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Introducción
La pascuita (Euphorbia leucocephala Lotsy) es una especie vegetal arbustiva originaria de México y Centroamérica, utilizada como ornamental en la temporada navideña. Se propaga principalmente por esquejes y semillas. Su reproducción en masa por diferentes técnicas de micropropagación no está reportada y solo existe un antecedente en la literatura científica que proporciona información sobre el establecimiento exitoso y posterior enraizamiento de esquejes apicales de pascuita in vitro (Martínez-Villegas et al., 2015). La nula existencia de variedades comerciales de esta especie es uno de los grandes problemas para los productores y una oportunidad para la investigación en mejoramiento genético. Diversas técnicas de transformación y generación de mutaciones pueden ser aplicadas sobre callos in vitro en programas de mejoramiento genético. Lo anterior deja clara la necesidad de generar una metodología para el establecimiento in vitro y la formación de callos de pascuita, como un primer paso para abordar parte de los retos asociados a la producción agronómica de esta especie.
La formación de callos in vitro de cualquier especie vegetal involucra la posibilidad de generar variaciones somaclonales en ese tejido y en aquellos formados a partir del mismo (Duta-Cornescu et al., 2023). Cuando se desea propagar una especie ornamental (como es el caso de la pascuita) por organogénesis indirecta, la presencia de variaciones somaclonales puede representar un problema, especialmente aquellas que se expresan en el fenotipo, pues lo que se desea en dichos casos, es la generación de plántulas idénticas a la planta madre. Estas variaciones pueden ser también utilizadas durante el mejoramiento genético, especialmente para la generación de nuevos genotipos (Duta-Cornescu et al., 2023) y como en el caso de la pascuita, para la generación de nuevas variedades. Si bien, el objetivo del presente trabajo no involucra la promoción o detección de estas variaciones, son un factor importante para considerar durante el establecimiento in vitro de cualquier especie.
El establecimiento de tejidos vegetales in vitro es afectado por múltiples factores como el medio de cultivo, reguladores de crecimiento, tipo de explantes y ambiente del cuarto de incubación. Diversas especies del género Euphorbia y la familia Euphorbiaceae se han cultivado in vitro previamente, existiendo protocolos de micropropagación para nochebuena (Euphorbia pulcherrima) (D´Onofrio & Morini, 2001; Perera & Trader, 2010), Euphorbia helioscopica (Aljibouri et al., 2014) y Jatropha curcas (Daud et al., 2013). El medio de cultivo MS es el más utilizado en la micropropagación de especies de esta familia; sin embargo, se ha reportado que esquejes de pascuita se adaptan mejor al medio WPM sin presencia de CaCl2 (Martínez-Villegas et al., 2015).
La generación de callos está fuertemente influenciada por la adición de reguladores del crecimiento al medio de cultivo (Ikeuchi et al., 2013). De manera general se conoce que el balance entre auxinas y citoquininas estimula las reacciones necesarias para la generación de callos, tallos o raíces de un explante in vitro (Ikeuchi et al., 2013). Las auxinas sintéticas más utilizadas para promover la formación de callos son el ácido indol-3-acético (AIA) ácido indol-3-butírico (AIB) y el ácido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D); y respecto a citoquininas, las más empleadas son la benciladenina (BA), cinetina y zeatina. En nochebuena “Prestige Red”, la adición de 4 µM de AIA con 8, 10 o 12 µM de BA mostró ser óptima para la generación de callos (Perera & Trader, 2010); para las variedades Agelika, Dorothee y Regina lo fue la adición al medio de 1 µM de 4-CPA (ácido 4-clorofenoxiacetico) y 0.9 µM de BA (D´Onofrio & Morini, 2001); mientras que en E. helioscopica el uso de 1 mg L-1 de BA y 0.8 mg L-1 de 2,4-D generó buenos resultados para el mismo objetivo (Aljibouri et al., 2014).
El estado fisiológico de los tejidos empleados y sus niveles hormonales endógenos son de vital importancia para la desdiferenciación celular y la formación de callos (Mostafa et al., 2020). Se sabe que en los meristemos se encuentra un grupo de células no diferenciadas que usualmente permiten una generación óptima de callos (Sobańska et al., 2023); sin embargo, de acuerdo con la teoría de la totipotencia celular, no solo las células meristemáticas son capaces de generar callos (Mostafa et al., 2020). Respecto a especies de la familia Euphorbiaceae, se ha logrado inducir la formación de callos a partir de fragmentos foliares en nochebuena (Pickens et al., 2005), Euphorbia hirta (Amos Samkumar et al., 2019) y Croton urucurana (Lima et al., 2008); mientras que a partir de meristemos apicales (ápices) o axilares (nudos o fragmentos de nudos) la formación de callos se ha reportado en nochebuena (Perera & Trader, 2010), Phyllanthus urinaria (Catapan et al., 2002), E. helioscopica, Euphorbia peplus, Euphorbia granulata y E. hirta (Aljibouri et al., 2014).
Entre los factores ambientales que influyen sobre el establecimiento de plantas in vitro, la calidad de la luz es de los más importantes (Cavallaro et al., 2022). A través de los fotorreceptores las plantas responden a la intensidad luminosa, longitud de onda y fotoperiodo, desencadenando procesos que controlan la bioquímica, fisiología y morfología vegetal. Si bien es común que en micropropagación se utilice luz blanca para el mantenimiento de las plantas in vitro, varias investigaciones han demostrado que la luz roja y la azul pueden desencadenar múltiples reacciones fisiológicas que permiten acelerar o hacer eficientes varios de los procesos necesarios para lograr la regeneración vegetal (Daud et al., 2013; Li et al., 2017; Pawłowska et al., 2018; Yu et al., 2019). Sobre nochebuena se ha reportado que la luz roja favorece la formación de callos en comparación con la luz azul y blanca (D´Onofrio & Morini, 2001), efecto que ha sido observado también en otras especies (Adil et al., 2019; Budiarto, 2010; Younas et al., 2018; Yu et al., 2019), por lo que se puede atribuir que dicha respuesta se debe a que este color de luz favorece un balance hormonal adecuado para la formación de callos (Yu et al., 2019).
Pruebas realizadas previo al establecimiento del presente trabajo mostraron altos porcentajes de necrosamiento en fragmentos de hojas de pascuita establecidos in vitro bajo el medio WPM sin CaCl2, lo que dejó clara la necesidad de probar el uso de antioxidantes y otro tipo de propágulo para lograr establecer a la pascuita in vitro.
Por lo anterior, el presente trabajo tuvo como objetivo determinar el tipo de explante y agente antioxidante adecuado para establecer a la pascuita in vitro, así como evaluar tres colores de luz LED y diferentes combinaciones de benciladenina (BA) con ácido indol-3-acético (AIA) sobre la formación de callos y posterior generación de tallos.
Materiales y métodos
Ubicación, manejo de explantes y medio de cultivo
El experimento se llevó a cabo en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Departamento de Fitotecnia de la Universidad Autónoma Chapingo (UACh). Se utilizaron plantas madre de E. leucocephala de un año de edad cultivadas bajo invernadero en la UACh. Se fertilizaron una vez por semana con una solución del fertilizante Ultrasol® Multipropósito a 1 mg L-1. Para el saneamiento de las plantas se utilizó INTERMICIN 500® (Estreptomicina, Oxitetraciclina y Sulfato tribásico de cobre) a 1 g L-1 aplicado al riego a las cuatro y dos semanas previas a la obtención de los explantes. Dado que previo a la obtención de los explantes (4 de noviembre) iniciaron los días cortos, las plantas madre se trataban diariamente con 4 horas de luz adicional (8:00 PM - 12:00 AM) utilizando luz blanca fría (PHILIPS® EcoHome LEDBulb 12MX) a 85 μmol m-2 s-1 para evitar la floración.
El presente trabajo se realizó en dos fases (descritas en los siguientes apartados), en ambas, los explantes se obtuvieron del antepenúltimo verticilo formado en ramas de las plantas madre (Figura 1); durante el transporte del invernadero al laboratorio, estas estructuras estuvieron sumergidas en una solución antioxidante (150 mg L-1 de ácido cítrico más 100 mg L-1 de ácido ascórbico). El método de desinfección consistió en lavado con jabón y agua corriente adicionado con 5 gotas de Tween® por 10 min, posteriormente lavado con solución de FUNLATE 50® (benomilo) a 1 g L-1 e INTERMICIN 500® (estreptomicina, oxitetraciclina y cobre) a 2 g L-1 por 10 min en agitación constante y finalmente lavado con hipoclorito de sodio comercial al 10 % por 5 min; ya dentro de la campana de flujo laminar se enjuagaron una sola vez con agua destilada y para su posterior manejo permanecieron en solución antioxidante (150 mg L-1 de ácido cítrico más 100 mg L-1 de ácido ascórbico).
En ambas fases del trabajo se utilizó el medio de cultivo WPM (Woody Plant Medium) modificado por Martínez-Villegas et al. (2015), cuya composición es: NH4NO3, 400 mg L-1; Ca (NO3)2 4H2O, 695 mg L-1; MgSO4, 370 mg L-1; KH2PO4, 170 mg L-1; Na2 EDTA 2H2O, 37.2 mg L-1; FeSO4 7H2O, 27.8 mg L-1; H3BO3, 6.2 mg L-1; MnSO4 4H2O, 22.3 mg L-1; ZnSO4 7H2O, 8.6 mg L-1; Na2MoO4 2H2O, 0.25 mg L-1; y CuSO4 5H2O, 0.25 mg L-1. Se adicionó también 3 % de sacarosa, 100 mg L-1 de mio-inositol y 0.4 mg L-1 de tiamina-HCl; el pH se ajustó a 5.7 y se agregó 0.7 % de agar (Sigma-Aldrich). El medio se colocó en tubos de ensayo, aproximadamente 20 mL de medio en cada uno.
Iluminación
En ambas fases de trabajo los tubos de ensayo se establecieron dentro de cajas de aislamiento luminoso, de 60 x 40 x 35 cm de largo, ancho y alto, respectivamente, estas estaban forradas con papel aluminio para promover una iluminación homogénea. Como fuentes luminosas se utilizaron paneles con 100 módulos de LED 5630 (TUNIX® LA-CCH50505) de1.5 W, de colores rojo, blanco y azul establecidos en un área de 9 x 30 cm en la parte central de la tapa superior de la caja. La iluminación se mantuvo a 10 µmol m-2 s-1 (medido a la base de la caja de aislamiento) y 16 h de fotoperiodo. Las características espectrales de cada fuente de iluminación se muestran en la Tabla 1 y fueron medidas con un espectroradiómetro Apogee® modelo StelarNet PS-300.
Tabla 1 Características espectrales de las fuentes luminosas.Table 1. Spectral characteristics o f the light sources.
| Blanco | Rojo | Azul | |
|---|---|---|---|
| Densidad de flujo de fotones (µmol m2 s-1) | 10 | 10 | 10 |
| Longitud de máxima emisión (nm) | 447.5, 547.5 | 556.5 | 451 |
| UV (300-400 nm) | 1.40% | 4.87% | 6.98% |
| Azul (400-500 nm) | 30.62% | 2.58% | 85.44% |
| Verde (500-600 nm) | 47.87% | 4.60% | 2.89% |
| Rojo (600-700 nm) | 18.17% | 83.35% | 2.14% |
| Rojo lejano (700-800 nm) | 1.94% | 4.60% | 2.55% |
| Proporción Azul/Rojo | 1.68 | 0.03 | 39.85 |
Fase 1. Explante y agente antioxidante
En esta primera fase buscó determinar el tipo de explante y agente antioxidante adecuado para establecer a la pascuita in vitro. Se diseñó un experimento factorial donde se probaron dos tipos de propágulos: fracción central de la hoja (1 cm2 aproximadamente, Figura 2c) establecida con la superficie abaxial hacia el medio de cultivo y una cuarta parte de un nudo desprovisto de hojas y peciolos (Figura 2b); y dos antioxidantes: polivinilpirrolidona (PVP, adicionada al medio a 300 mg L-1) y carbón activado (adicionado al medio a 1 g L-1). Cada una de las combinaciones generó un tratamiento y cada tratamiento tuvo dieciocho repeticiones que se establecieron bajo los tres colores de luz LED, seis por cada color. La unidad experimental fue un tubo de ensayo con el tratamiento respectivo. A los diez días se contabilizó el porcentaje de necrosamiento en cada tratamiento, sin considerar aquellas unidades experimentales que se hubieran contaminado.
Figura 2 Explantes probados para establecer a la pascuita in vitro. a) Zona del nudo de donde se tomaron los explantes. b) Nudo entero y nudo fraccionado en cuatro partes. c) La parte central de la hoja se utilizó como el segundo explante probado.
Las unidades experimentales sin necrosamiento o contaminación se mantuvieron en observación por 60 días, con la finalidad de detectar si formaban callo.
Para el análisis estadístico en esta primera fase se utilizó una prueba de Friedman (P ≤ 0.05) para detectar diferencias en el porcentaje de necrosamiento entre los diferentes tratamientos. Se utilizó el programa estadístico SAS® System versión 9.0.
Fase 2: BA/AIA y tipo de luz en la inducción de callos y tallos adventicios
Una vez obtenidos los resultados de necrosamiento del experimento anterior se estableció la segunda fase, cuyo objetivo era inducir la formación de callos y posteriormente tallos. Utilizando fragmentos de nudo como propágulos y PVP como antioxidante (300 mg L-1) se diseñó un experimento factorial donde se probaron tres colores de luz LED (blanco, rojo y azul, 10 µmol m-2 s-1 y 16 h de fotoperiodo) y dos concentraciones de benciladenina (BA, 9.0 y 12.0 µM) en combinación con tres concentraciones de ácido indol-3-acético (AIA, 5, 8 y 11 µM). La combinación de los factores generó 18 tratamientos, se establecieron cinco repeticiones por cada uno. La unidad experimental consistió en un tubo de ensayo con el tratamiento respectivo.
Se evaluó la formación de callos a los 10, 16 y 23 días de establecido el experimento, registrando como positivo la formación de callo en al menos 50% de la superficie del explante. El porcentaje de unidades experimentales con callos formados por tratamiento se calculó sin considerar aquellos tubos en que hubiera contaminación o necrosamiento de explantes. El tamaño de los callos se registró considerando una escala empírica utilizando cruces, donde +: callos pequeños (< 0.5 cm), ++: callos medianos (0.5-1.0 cm) y +++: callos grandes (> 1.0 cm). Los callos se mantuvieron bajo los tratamientos luminosos respectivos y se contabilizó el porcentaje de unidades experimentales con tallos presentes por tratamiento a los días 59, 72 y 90 después de establecido el experimento.
A los 90 días de establecido el experimento se contabilizó el número de tallos y la longitud promedio de los tallos en cada unidad experimental. Para obtener las medias de estas variables en cada tratamiento, no se tomaron en cuenta aquellos casos en que aun con presencia de callos, no hubiera tallos formados.
Se realizaron pruebas de Kruskal-Wallis (P ≤ 0.05) para detectar el efecto del color de luz y las combinaciones de los tratamientos hormonales sobre el porcentaje de callos y tallos adventicios formados. Para las variables número de tallos y longitud de tallos formados, se aplicó análisis de varianza (ANAVA) y prueba de comparación de medias de Duncan (P ≤ 0.05). Se utilizó el programa estadístico SAS® System versión 9.0.
Resultados
Fase 1. Explante y agente antioxidante
En todo el experimento solo se observó una unidad experimental contaminada (bacteria no identificada), lo que corresponde a 1.38 % del total. Se detectaron diferencias significativas (Friedman, P ≤ 0.05) para las combinaciones entre tipo de propágulo y antioxidante utilizado. No se observaron diferencias estadísticas significativas (P ≤ 0.05) en el porcentaje de necrosamiento debidas al tipo de antioxidante cuando se utilizaban fragmentos de hoja como propágulo (Tabla 2), sin embargo, cuando se utilizaron fragmentos de nudos, la adición de PVP al medio mostró una reducción significativa (P ≤ 0.05) del necrosamiento en comparación con la adición de carbón activado.
Tabla 2 Efecto de dos antioxidantes adicionados al medio de cultivo sobre el necrosamiento de dos tipos de propágulos de pascuita evaluado a los diez días.Table 2. Effect of two antioxidants added to the culture medium on the necrosis of two types of pascuita propagules evaluated at ten days.
| Explante | Antioxidante | Necrosamiento (%) ± DE |
|---|---|---|
| Fragmento de hoja | Polivinilpirrolidona | 72.33 ± 20.76 a* |
| Carbón activado | 77.67 ± 9.24 a | |
| Fragmento de nudo | Polivinilpirrolidona | 5.67 ± 8.0 c |
| Carbón activado | 27.67 ± 7.54 b |
*Medias seguidas de la misma letra no difieren estadísticamente (Friedman, P ≤ 0.05). DE: desviación estándar.
*Means followed by the same letter do not differ statistically (Friedman, P ≤ 0.05). SD: standard deviation.
Posterior a la toma de datos, se conservó el experimento para observar su evolución. En ningún caso se observó formación de callo u órganos adventicios, dejando clara la necesidad de adicionar reguladores del crecimiento para la generación de estas estructuras. En los explantes de hoja hubo necrosamiento en el 50 % a los 35 días, mientras que más del 50 % de los explantes de fragmento de nudo permanecieron sin necrosamiento hasta el final de las observaciones (60 días).
Fase 2: BA/AIA y tipo de luz en la inducción de callos y tallos adventicios
El análisis estadístico mostró que únicamente el efecto del color de luz fue significativo (Kruskal-Wallis, P = 0.047) sobre el porcentaje de unidades experimentales con callo formado al día 10. Para los días 16 y 23 no se observaron efectos significativos (P ≤ 0.05) del color de luz LED aplicado o de los tratamientos hormonales.
La formación de callos de pascuita inició durante la primera semana. A los diez días de establecido el experimento el mayor porcentaje de unidades experimentales con callo presente se registró bajo luz roja (Tabla 3), sin presentar diferencia estadística (Kruskal-Wallis, P ≤ 0.05) al porcentaje registrado bajo luz blanca. El menor porcentaje de formación de callos se observó bajo luz azul. Para el día 16, el tratamiento con luz roja había alcanzado el 100 % de unidades experimentales con callo formado. Para el día 23 todas las unidades experimentales tenían callos formados.
Tabla 3 Formación de callos de pascuita bajo diferentes colores de luz LEDTable 3. Callus formation of Pascuita under different LED light colors
| Color de luz | Unidades experimentales con callo (%) | ||
|---|---|---|---|
| Día 10 (± DE) | Día 16 (± DE) | Día 23 (± DE) | |
| Blanco | 84.17 ± 18.35 a* | 95.83 ± 9.32 | 100 ± 0 |
| Rojo | 93.33 ± 9.43 a | 100 ± 0 | 100 ± 0 |
| Azul | 64.17 ± 18.35 b | 88.33 ± 11.79 | 100 ± 0 |
*Porcentajes seguidos de letras iguales, no difieren estadísticamente (Kruskal-Wallis, P ≤ 0.05).
DE.: desviación estándar.
*Percentages followed by the same letters do not differ statistically (Kruskal-Wallis, P ≤ 0.05).
SD: standard deviation.
Respecto al tamaño de los callos, los más grandes se presentaron bajo luz roja y blanca (Tabla 4), aunque el tamaño varió en función del tratamiento hormonal.
Tabla 4 Tamaño de callos de pascuita formados bajo diferentes colores de luz LED y tratamientos hormonales.Table 4. Size of pascuita calli formed under different LED light colors and hormonal treatments.
| Tratamiento hormonal | Color de luz | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| BA (µM) | AIA (µM) | Blanco | Rojo | Azul | |
| 9 | 5 | ++ | ++ | + | |
| 8 | ++ | ++ | + | ||
| 11 | +++ | ++ | ++ | ||
| 12 | 5 | ++ | +++ | + | |
| 8 | +++ | +++ | ++ | ||
| 11 | ++ | +++ | + | ||
+: callos pequeños (< 0.5 cm), ++: callos medianos (0.5-1.0 cm), +++: callos grandes (> 1.0 cm). n=5. el número de cruces en la Tabla representa la moda en cada tratamiento.
+: small calli (< 0.5 cm), ++: medium-sized calli (0.5-1.0 cm), +++: large calli (> 1.0 cm). n=5. The number of crosses in the table represents the mode in each treatment.
Las características de los callos no mostraron grandes diferencias (Figura 3). Bajo luz roja y con tratamiento hormonal de BA 9 µM y AIA 11 µM se observó la presencia de una tonalidad rosa en la superficie de los callos. Respecto al área del explante cubierta por callo, fue bajo luz azul donde se detectó menor crecimiento de este tipo de células.
Figura 3 Callos de pascuita formados bajo diferentes colores de luz LED y tratamientos hormonales. BA: benciladenina AIA: ácido indol-3-acético.
La formación de tallos se observó en todos los tratamientos. Al día 59, solo los tratamientos hormonales fueron significativos estadísticamente (Kruskal-Wallis, P = 0.039) sobre el porcentaje de unidades experimentales con tallos. Para el día 72 solo se observó significancia para el factor color de luz (P = 0.017), mientras que para el día 90, ninguno de los factores evaluados fue significativo para esta variable. El análisis de varianza para el número y longitud de tallos mostró que para ambas variables hubo efectos significativos (P ≤ 0.05) del color de luz aplicado, los tratamientos hormonales y la interacción de ambos.
La formación de tallos en función de los tratamientos hormonales para el día 59 fue máxima cuando se usaron 5 µM de AIA y disminuyó en función del aumento en la concentración de la auxina, independientemente de la concentración de BA en el medio (Tabla 5).
Tabla 5 Formación de tallos adventicios a partir de callos de pascuita en función de diferentes tratamientos hormonales in vitro.Table 5. Formation of adventitious shoots from pascuita calli based on different in vitro hormonal treatments.
| Tratamiento | Unidades experimentales con tallos (%) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| BA (µM) | AIA (µM) | Día 59 (± DE) | Día 72 (± DE) | Día 90 (± DE) | |
| 9 | 5 | 83.33 ± 11.79 a* | 91.67 ± 0 | 100 ± 0 | |
| 8 | 30.00 ± 7.07 b | 61.11 ± 20.79 | 72.22 ± 20.79 | ||
| 11 | 23.33 ± 2.36 c | 58.33 ± 31.18 | 66.67 ± 31.18 | ||
| 12 | 5 | 83.33 ± 11.79 a | 91.67 ± 11.79 | 100 ± 0 | |
| 8 | 41.67 ± 23.57 b | 75.00 ± 20.41 | 100 ± 0 | ||
| 11 | 28.33 ± 20.95 c | 50.00 ± 20.41 | 83.33 ± 23.57 | ||
*Porcentajes seguidos de letras iguales, no difieren estadísticamente (Kruskal-Wallis, P ≤ 0.05). DE: desviación estándar.
*Percentages followed by the same letters do not differ statistically (Kruskal-Wallis, P ≤ 0.05). SD: standard deviation.
En función de los tratamientos luminosos, al día 72 de iniciado el experimento se registró un mayor porcentaje de unidades experimentales con tallos adventicios formados bajo luz roja (Tabla 6), seguido por luz azul y blanca, estas últimas sin ser estadísticamente diferentes entre sí (Kruskal-Wallis, P ≤ 0.05). Al día 90 no se detectaron diferencias entre los tratamientos, sin embargo, cabe resaltar al tratamiento con luz roja como el único donde el 100% de las unidades experimentales formaron tallos.
Tabla 6 Formación de tallos adventicios de pascuita a partir de callos bajo diferentes colores de luz LED.Table 6. Formation of pascuita adventitious shoots from calli under different LED light colors.
| Color de luz | Unidades experimentales con tallos (%) | |||
|---|---|---|---|---|
| Día 59 (± DE) | Día 72 (± DE) | Día 90 (± DE) | ||
| Blanco | 54.17 ± 33.59 | 66.67 ± 23.57 b* | 79.17 ± 22.44 | |
| Rojo | 45.00 ± 22.17 | 95.83 ± 9.32 a | 100 ± 0 | |
| Azul | 45.83 ± 30.33 | 51.39 ± 23.77 b | 81.94 ± 28.22 | |
*Porcentajes seguidos de letras iguales, no difieren estadísticamente (Kruskal-Wallis, P ≤ 0.05). DE. desviación estándar.
*Percentages followed by the same letters do not differ statistically (Kruskal-Wallis, P ≤ 0.05). SD: standard deviation.
Si bien no se realizaron estudios histológicos para determinar el origen de los nuevos tallos, al día 72 se observó que estos se originaban en la superficie de los callos (Figura 4). Bajo luz roja en combinación con 9 µM de BA y 11 µM de AIA fue posible observar un elevado número de primordios de tallo sobre la superficie del callo (Figura 4B), muchos de ellos se desarrollaron y fueron cuantificados a los 90 días.
Figura 4 Tallos de pascuita formados in vitro bajo luz blanca (A), roja (B) y azul (C) en medio WPM adicionado con 9 µM de BA y 11 µM de AIA, a los 72 días del establecimiento.
El número y la longitud de los tallos adventicios formados estuvieron en función de las diferentes combinaciones entre el color de luz aplicado y el balance hormonal del medio. El mayor número de tallos se obtuvo bajo luz blanca en los tratamientos hormonales que contenían 5 µM de AIA y en luz roja con 9 µM de BA y 11 µM de AIA (Tabla 7). Respecto a la longitud de los tallos, los valores mayores se registraron bajo múltiples tratamientos hormonales en los colores rojo y azul.
Tabla 7 Número y longitud de tallos de pascuita formados a partir de callos bajo diferentes tratamientos hormonales y luminosos in vitro.Table 7. Number and length of pascuita shoots formed from calli under different in vitro hormonal and light treatments.
| Color de luz | BA (µM) | AIA (µM) | Número de tallos (± DE) | Longitud de tallos (cm) (± DE) |
|---|---|---|---|---|
| Blanco | 9 | 5 | 4.00 ± 0 a* | 0.50 ± 0.14 c |
| 8 | 1.00 ± 0 f | 0.70 ± 0 bcd | ||
| 11 | 1.20 ± 0.43 ef | 0.76 ± 0.49 bcd | ||
| 12 | 5 | 4.00 ± 0 a | 0.30 ± 0.08 d | |
| 8 | 2.75 ± 0.43 bc | 0.37 ± 0.20 d | ||
| 11 | 1.00 ± 0 f | 0.85 ± 0.15 bcd | ||
| Rojo | 9 | 5 | 2.25 ± 0.83 cde | 0.89 ± 0.11 bcd |
| 8 | 2.60 ± 0.8 c | 2.06 ± 0.85 a | ||
| 11 | 3.67 ± 0.47 ab | 0.87 ± 0.17 bcd | ||
| 12 | 5 | 2.80 ± 0.4 bc | 1.36 ± 0.37 abc | |
| 8 | 2.50 ± 0.5 cd | 1.41 ± 0.39 ab | ||
| 11 | 2.50 ± 0.5 cd | 1.45 ± 0.23 ab | ||
| Azul | 9 | 5 | 2.75 ± 0.43 bc | 0.95 ± 0.38 bcd |
| 8 | 1.00 ± 0 f | 1.45 ± 0.05 ab | ||
| 11 | 1.00 ± 0 f | 0.90 ± 0.1 bcd | ||
| 12 | 5 | 2.00 ± 0 cdef | 1.95 ± 0.17 a | |
| 8 | 1.33 ± 0.47 ef | 1.40 ± 0.36 ab | ||
| 11 | 1.50 ± 0.5 ef | 0.45 ± 0.05 d |
*Medias seguidas por la misma letra, no son diferentes estadísticamente (Duncan, P ≤ 0.05). AIA: ácido indol-3-acetico. BA: benciladenina. DE: desviación estándar.
*Means followed by the same letter are not statistically different (Duncan, P ≤ 0.05). AIA: Indole-3-acetic acid. BA: Benzyladenine. SD: Standard deviation.
Discusión
Fase 1. Explante y agente antioxidante
Los resultados (Tabla 2) mostraron que el uso de fragmentos de nudos como propágulo y PVP como antioxidante, permiten el establecimiento de la pascuita in vitro con mínimo necrosamiento del tejido. El necrosamiento de explantes in vitro de debe a múltiples factores, entre los que destacan la oxidación de algunos componentes celulares por la acción de radicales libres y la oxidación de compuestos fenólicos por la enzima polifenol oxidasa (Ahmad et al., 2013). Se ha reportado también, que explantes con meristemos apicales o axilares son menos propensos a necrosarse (Azofeifa, 2009). En este sentido, la respuesta observada en el presente trabajo puede adjudicarse a que, en los fragmentos de nudos están presentes meristemos axilares, mientras que, los fragmentos de hoja no se encuentran en crecimiento activo. Así mismo, si bien no se ha reportado la composición fitoquímica de las hojas de pascuita, puede especularse que contienen compuestos altamente oxidables. Otra de las posibilidades por las que se observó un mayor necrosamiento en fragmentos de hoja pudiera ser que, durante la desinfección, las células de estos explantes están expuestas directamente a los agentes oxidantes utilizados y a la abrasión. Respecto al uso de antioxidantes se ha descrito al carbón activado y a la polivinilpirrolidona como absorbentes de compuestos fenólicos (Azofeifa, 2009), su eficiencia depende de la dosis, el genotipo y las características del tipo de explante sobre el que se utilicen (Amente & Chimdessa, 2021) en este trabajo, el uso de PVP a 300 mg L-1 agregado al medio de cultivo resultó ser más eficiente que 1 g L-1 de carbón activado para el control del necrosamiento de fragmentos de verticilos de pascuita in vitro.
Fase 2: BA/AIA y tipo de luz en la inducción de callos y tallos adventicios
La formación de callos que se presentó en todos los tratamientos hormonales (Figura 1) es un buen indicador del potencial de reproducción in vitro que tiene la pascuita. La mayor velocidad de formación de callos bajo luz roja seguida por la velocidad observada bajo luz azul (Tabla 3) está relacionada con los efectos de la calidad de la luz sobre el balance hormonal interno del propágulo. Una mayor formación de callos en proporción y tamaño en incubación con luz roja frente a otros colores de luz también se ha observado en nochebuena (D´Onofrio & Morini, 2001), anturio (Budiarto, 2010), algodón (Yu et al., 2019), Withania somnífera (Adil et al., 2019) y Silybum marianum (Younas et al., 2018).
Una posible explicación a los resultados observados considera que el nivel endógeno de AIA correlaciona con la formación y mantenimiento del callo (Centeno et al., 1996), así mismo se ha reportado que varios reguladores del desarrollo de raíces laterales participan en la formación de callos en condiciones in vitro (Ikeuchi et al., 2013). La luz roja promueve el incremento de la concentración interna de AIA de manera indirecta (Alallaq et al., 2020), mientras que la luz azul promueve la sobreexpresión de genes relacionados con la síntesis de AIA y la formación de raíces (Gil et al., 2021; Shen et al., 2022), lo que explicaría un incremento interno de esta hormona en los propágulos bajo luz roja o azul en comparación con los establecidos bajo luz blanca y, por tanto, una mayor velocidad en la formación de callos. Esta teoría ha sido apoyada parcialmente por Yu et al. (2019) quienes bajo luz roja observaron una mayor formación de callos en algodón, acompañada de un incremento en el contenido interno de AIA y un balance AIA/ZA cercano a 0.5, sin embargo, bajo luz azul dicho balance se redujo considerablemente (aproximadamente 0.35) debido a una reducción en la concentración interna de AIA y no a un incremento en la concentración de zeatina.
Un patrón especifico en la formación de tallos en función de la concentración hormonal en el medio, se observó al día 59 (Tabla 5); independientemente de la concentración de BA un incremento en la concentración de AIA redujo el porcentaje de unidades experimentales con tallos formados (Kruskal-Wallis, P ≤ 0.05). Generalmente es aceptado que las respuestas observadas in vitro están en función del balance hormonal en el medio de cultivo, es así como un balance que tiende hacia las auxinas promueve la formación de raíces, un balance neutro la formación de callos y un balance que tiende hacia las citoquininas promueve la formación de tallos (Ikeuchi et al., 2013). Si bien a los días 72 y 90 el patrón no fue observado, la disminución de la concentración de AIA que favorece un balance hacia la BA explica los resultados observados al día 52.
Los efectos del color de la luz sobre el inicio en la formación de tallos pueden interpretarse por la influencia positiva de la luz roja sobre la acumulación de auxinas (Yu et al., 2019) y de la luz azul sobre la acumulación de citoquininas (Kohler et al., 1980), lo que explica mayor formación de tallos bajo luz azul en diferentes especies (Budiarto, 2010; Cybularz-Urban et al., 2015; Dutta Gupta & Sahoo, 2015; Jeong & Sivanesan, 2018); sin embargo, en el presente trabajo se han encontrado resultados diferentes, ya que bajo luz roja se observó una mayor formación de nuevos tallos (Tabla 6). Una posible explicación es que el inicio de la formación de tallos adventicios fue disparado por la concentración de hormonas exógenas (Tabla 5) al día 59, dejando múltiples meristemos adventicios formados, pero sin desarrollarse lo suficiente para ser considerados como brotes; por efecto de la luz roja se promovió el alargamiento de dichos meristemos adventicios y fueron detectados al día 72.
El color de luz y tratamientos hormonales en combinación, produjeron los efectos observados sobre el número y longitud de tallos (Tabla 7). La formación de tallos adventicios se ha asociado a un balance hormonal que favorece a las citoquininas frente a las auxinas (Ikeuchi et al., 2013), por lo que es común la adición únicamente de citoquininas a los medios de cultivo con la finalidad de promover la formación de tallos adventicios. En este trabajo, los tratamientos con 5 µM de AIA acompañados de 9 0 12 µM de BA favorecieron dicho balance; fue bajo luz blanca y azul donde se pudo detectar que estos tratamientos generaban un mayor número de tallos frente a los demás tratamientos hormonales. Bajo luz roja fue el tratamiento con 9 µM de BA y 11 µM de AIA en el que se obtuvo la media mayor, sin poder adjudicarse en este caso un efecto debido a un balance hormonal hacia las citoquininas adicionadas al medio.
La longitud de los tallos también estuvo en función de la interacción entre el color de luz y el tratamiento hormonal (Tabla 7). Una mayor longitud de tallos in vitro bajo luz roja frente a luz azul y blanca se ha reportado en Ajuga multiflora (Jeong & Sivanesan, 2018), Rehmannia glutinosa (Manivannan et al., 2015), vid (Poudel et al., 2008) y Oncidium (Chung et al., 2010), dejando claro el papel de este color de luz sobre el alargamiento de tallos. Los resultados aquí mostrados presentan las medias más altas de longitud de tallos en tratamientos asociados a la luz roja, sin embargo, también bajo luz azul se registraron longitudes de tallos que no fueron diferentes estadísticamente (P ≤ 0.05) a las observadas bajo luz roja, si bien esto puede resultar contradictorio, los efectos observados se adjudican a la baja intensidad luminosa utilizada en el presente trabajo.
Conclusiones
El uso de fragmentos de nudos de pascuita como propágulo y polivinilpirrolidona como antioxidante permiten establecer a la pascuita en condiciones in vitro con un mínimo necrosamiento, así mismo, permiten generar callos bajo cualquiera de los tratamientos hormonales y luminosos evaluados. La mejor combinación de BA/AIA para la inducción de tallos fue 9 o 12 µM BA / 5 µM AIA. La luz roja acelera la formación de callos y mejora la obtención de tallos adventicios de pascuita. Los resultados de la presente investigación representan un primer paso para la generación de un método de reproducción de la especie por cultivo in vitro y para la futura exploración de métodos para la generación de nuevas variedades de pascuita.
