Ciencia animal

 

Capacitación espermática inducida por la conservación de semen de carnero diluido, refrigerado o congelado

 

Sperm capacitation induced by conservation of diluted, refrigerated, or frozen ram semen

 

Felipe A. Rodríguez–Almeida¹*, Carlos O. Ávila Cota¹, Alfredo Anchondo Garay¹, Blanca Sánchez–Ramírez² y Jorge A. Jiménez Castro¹

 

¹ Facultad de Zootecnia *(Autor responsable),

² Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Chihuahua, Administración de Correos 4–28, Periférico Francisco R. Almada Km. 1, 31031–3103. Chihuahua, Chihuahua, México (frodrigu@uach.mx)

 

Recibido: Febrero, 2007.
Aprobado: Marzo, 2008.

 

Resumen

La refrigeración y criopreservación de los espermatozoides reducen o interrumpen su actividad metabólica y alargan su viabilidad, pero la capacitación espermática (CE) inducida en el semen de carnero puede reducir la fertildad. Para determinar el grado de inducción de la CE y el efecto en la motilidad progresiva (MP), se evaluaron muestras de semen fresco [baño maría a 36 °C por 3 (F3) y 6 h (F6)]; refrigerado [5 °C por 3 (R3), 6 (R6) y 24 h (R24)]; y congelado [(CON) en N líquido]. Cinco eyaculados de cada uno de tres carneros jóvenes y tres adultos por raza (Pelibuey y Blackbelly), se diluyeron en solución citrato–yema y se dividieron en tres alícuotas. Se determinaron los porcentajes de MP y de espermatozoides capacitados con acrosoma intacto (patrón B) y reacción acrosomal (patrón RA), estos dos últimos por duplicado con el ensayo de la clortetraciclina. El modelo estadístico para evaluar MP incluyó efectos fijos de tipo–tiempo de preservación (PRE), raza, edad, y sus interacciones; y aleatorios de carnero y su interacción con PRE dentro de raza y edad. Para los patrones B y RA el modelo incluyó además los efectos aleatorios de eyaculado y eyaculado por PRE dentro de carnero, raza y edad. Las medias para el patrón B fueron 23.9, 30.8, 32.8, 42.5, 44.5 y 36.6 % (E.E.=2.3; p<0.01) para F3, F6, R3, R6, R24, y CON. Hubo interacción de PRE con edad para el patrón RA; fue mayor (p<0.01) en carneros jóvenes que en los adultos sólo en R24 (27.8±1.6 vs 19.8±1.6%) y CON (33.9±1.6 vs 26.3±1.6%). La MP se redujo más (p<0.01) en F6 y CON que en los otros niveles de PRE. Con la refrigeración a 5 °C la motilidad del semen de carnero se mantuvo, pero cuando se conservó hasta 24 h, al igual que con la criopreservación, los niveles de CE inducidos cambian la fertilidad.

Palabras clave: Clortetraciclina, criopreservación, semen de carnero.

 

Abstract

Refrigeration and cryopreservation of spermatozoa reduce or interrupt their metabolic activity and prolong their viability, but sperm capacitation (CE) induced in ram semen may reduce its fertility. In order to determine the degree of CE induction and the effect on progressive motility (MP) fresh semen samples were assessed [double boiler water bath at 36 °C for 3 (F3) and 6 h (F6)]; refrigerated [5 °C for 3 (R3), 6 (R6), and 24 h (R24)]; and frozen [(CON) in liquid N]. Five ejaculates of each of three young rams and three adults per breed (Pelibuey and Blackbelly) were diluted in citrate–yolk extender and divided proportionally in three aliquots. Percentages of MP and of capacitated spermatozoa with intact acrosome (B pattern) and acrosomal reaction (RA pattern) were determined, the two latter in duplicate with chlortetracycline assay. The statistical model for evaluating MP included fix effects of type–time preservation (PRE), breed, age, and their interactions; and random effects of ram and its interaction with PRE within breed and age. For B and RA patterns, the model included also the random effects of ejaculate and ejaculate by PRE within ram, breed and age. The means for B pattern were 23.9, 30.8, 32.8, 42.5, 44.5, and 36.6 % (E.E.=2.3; p<0.01) for F3, F6, R3, R6, R24, and CON. There was interaction of PRE with age for RA pattern; it was greater (p<0.01) in young rams than in adults only in R24 (27.8±1.6 vs 19.8±1.6%) and CON (33.9±1.6 vs 26.3±1.6%). MP was more reduced (p<0.01) in F6 and CON than in the other levels of PRE. With refrigeration at 5 °C ram semen motility was maintained, but when it was kept until 24 h, the same as with cryopreservation, the induced CE levels change fertility.

Key words: Chlortetracycline, cryopreservation, ram semen.

 

INTRODUCCIÓN

Los espermatozoides de los mamíferos sufren algunos cambios estructurales y bioquímicos al recorrer el tubo genital de la hembra, que los habilitan para fertilizar al óvulo. Este proceso es la capacitación espermática (CE) y es indispensable para que ocurra la fertilización. La criopreservación del semen, según la raza en ovinos (Bag et al., 2002) y edad del macho en bovinos (Januskauskas et al., 1999), causa cambios en el espermatozoide, similares a los que ocurren en la CE (Bailey et al., 2002; Cormier y Bailey, 2003), por lo que se le denomina criocapacitación (Vadnais et al., 2005). Por tanto, cuando se aplica la fertilización in vitro con semen criopreservado, la etapa de la CE inducida in vitro puede ser innecesaria (Cormier et al., 1997).

Algunos cambios celulares que ocurren con la CE son: aumento en la permeabilidad y decremento en la relación colesterol:fosfolípidos en la membrana (Langlais y Roberts, 1985), aumento del Ca⁺² intracelular y alcalinización citoplasmática (Handrow et al., 1989), activación de los canales de Ca⁺² y de Na/K (Arnoult et al., 1996), generación de oxígeno reactivo (de Lamirande et al., 1998), y fosforilación de la tirosina de las proteínas (Flesch et al., 1999). Si estos cambios son inducidos prematuramente por la criopreservación, pueden reducir las tasas de concepción si el semen se usa en la inseminación artificial (Bailey y Buhr, 1994). La habilidad del espermatozoide capacitado para adherirse a las células epiteliales del oviducto es menor que la del espermatozoide no capacitado, in vitro e in vivo (Medeiros et al., 2002; Tienthai et al., 2004). Por tanto, menos espermatozoides funcionales estarían disponibles en el oviducto para fertilizar al óvulo. Cormier et al. (1997) y Pérez et al. (1997) sugieren que un proceso similar al inducido por la criopreservación puede ocurrir en los espermatozoides cuando el semen diluido se conserva en refrigeración o en fresco por 4 h o más.

Morrier et al. (2002) observaron que la presencia de espermatozoides con reacción acrosomal aumentó en el semen de carnero cuando el tiempo en refrigeración aumentó de 16 a 24 h. No se ha analizado simultáneamente los factores tipo y tiempo de conservación del semen en el grado de inducción de la CE en carneros. Por tanto, el objetivo del presente estudio fue cuantificar la proporción de espermatozoides que sufren cambios relacionados con la capacitación inducida a diferentes tiempos cuando el semen de carnero es diluido, refrigerado o criopreservado, así como el grado de efecto en la motilidad progresiva.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Se usaron tres carneros jóvenes (alrededor de un año de edad), y tres adultos, Pelibuey y Blackbelly, después de una prueba de fertilidad. De cada carnero se obtuvieron cinco eyaculados con vagina artificial (Evans y Maxwell, 1990) en sesiones separadas al menos por 3 d. De algunos carneros se obtuvieron dos eyaculados en una misma sesión.

El volumen, apariencia y color del semen se evaluaron a simple vista y su motilidad progresiva (MP) y porcentajes de células normales y vivas se determinaron al microscopio (40X) usando la tinción eosina–nigrosina. No se usaron muestras de semen con menos de 70% de MP, 85% de espermatozoides normales, 70% de espermatozoides vivos, ni con un volumen menor a 0.5 mL. La concentración espermática se midió con el hemocitómetro (Sorensen, 1982).

En las muestras de semen que cumplieron los requisitos, se tomó una alícuota de 0.25 mL de semen y se diluyó con 2.25 mL de la fracción A del diluyente. De esta parte se conservó 1 mL en baño maría a 36 °C y se tomaron alícuotas (0.25 mL) para evaluarlas a 0, 3 y 6 h. Los otros 1.5 mL de semen diluido se enfriaron a 5 °C en un periodo de 1 a 1.5 h, y se tomaron alícuotas (0.25 mL) para evaluarlas a las 3, 6 y 24 h. Las demás muestras se prepararon para congelarlas: se agregó 1 mL de la fracción A del diluyente, se determinó el número de pajillas a envasar y se agregó el resto de la fracción A del diluyente para tener una concentración de 240X10⁶ espermatozoides por pajilla. Se bajó la temperatura a 5 °C en 1 a 1.5 h, se agregó la fracción B del diluyente en cuatro periodos de 15 min (10, 20, 30 y 40% de la fracción B) para tener una concentración final de 120X10⁶ espermatozoides por pajilla (0.5 mL). El tiempo de equilibramiento antes del congelado fue 2 a 3 h. Después el semen se envasó en pajillas y se congeló a –120 °C por 12 min y luego a –196 °C en líquido. Para la evaluación las pajillas se descongelaron 40 s a 36 °C en baño maría. La fracción A del diluyente incluyó 2.9 g de citrato de sodio, 20% (v/v) de yema de huevo, 0.1 g de fructosa, 100 000 UI de penicilina sódica, y 100 mg de estreptomicina por cada 100 mL de agua destilada. Para la fracción B se agregó glicerol (14% v/v).

Las muestras de semen fresco, refrigerado y congelado se purificaron a través de gradientes de Percoll (45/70; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, Cat: P1644). El Percoll se diluyó con medio Sperm TL stock sin albúmina (Specialty Media, (908)213–0500, E.U., www.specialtymedia.com), adicionado con solución stock de penicilina–estreptomicina+piruvato de sodio (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA). Luego se templó a 36 °C antes de agregar el semen. En un tubo cónico de 15 mL se agregaron primero 1.5 mL de Percoll al 70% y luego 1.5 mL de Percoll al 45 %, con una pipeta serológica de 2 mL y un succionador automático. Una vez agregado el semen, las muestras se centrifugaron (Precision®, Durafuge 200) 30 min a 2000 rpm y se retiró el sobrenadante de Percoll con una pipeta Pasteur hasta quedar solo el sedimento de semen, el cual se recolectó con una pipeta Eppendorf para medir la cantidad de semen y transferirlo a un tubo cónico de 15 mL. Se tomaron 10 µL de la muestra de semen y se agregó 90 µL de agua para evaluar la concentración de espermatozoides en un hemocitómetro. El resto del sedimento se resuspendió con medio IVF–TALP (Specialty Media, (908)213–0500, E.U., www.specialtymedia.com) para obtener una concentración de 10X10⁶ espermatozoides mL^–1 y se prepararon las laminillas para evaluar la CE.

Las tasas de CE se evaluaron con el método de la clortetraciclina (CTC) modificado por Chamberland et al. (2001). Se usó un microscopio Olympus BX41 con sistema de epifluorescencia y filtro V–2A (400–500 nm de excitación, y 470 nm de emisión) con objetivo 40X. De cada muestra se prepararon dos laminillas y 48 h después se contaron 100 espermatozoides, que se clasificaron con los siguientes patrones: F, mostraron fluorescencia uniforme en toda la cabeza, lo que indicó espermatozoides no capacitados con el acrosoma intacto; B, con una banda libre de fluorescencia en la región post acrosomal que indicó espermatozoides capacitados con el acrosoma intacto; RA, con la cabeza libre de fluorescencia o con una pequeña banda de fluorescencia en la región ecuatorial, que indicó reacción acrosomal.

Los porcentajes de MP obtenidos antes de la purificación con Percoll y los porcentajes de espermatozoides con los patrones B y RA se analizaron estadísticamente con PROC MIXED (SAS, 2004a). El modelo para MP incluyó los efectos fijos de las subclases tipo–tiempo de preservación (PRE) [fresco a 3 (F3) y 6 h (F6); refrigerado a 3 (R3), 6 (R6) y 24 h (R24); y congelado (CON)], raza (Pelibuey y Blackbelly) y edad del carnero (joven y adulto), así como las interacciones dobles y triples entre estos efectos; y los efectos aleatorios de carnero y la interacción de carnero por PRE, ambos dentro de las subclases de raza por edad. En los patrones B y RA el modelo incluyó además los efectos aleatorios de eyaculado y eyaculado por PRE, ambos dentro de las subclases de carnero por raza por edad. Cuando el efecto principal del factor PRE fue estadísticamente significativo, pero no sus interacciones con otros factores, para MP se hicieron las comparaciones inicialmente planeadas: 1) promedio en semen fresco vs promedio en semen refrigerado a 3 y 6 h [(F3 + F6)/2 vs (R3 + R6)/2]; 2); media del semen refrigerado a 24 h vs media del semen congelado (R24 vs CON), y se ajustaron los polinomios ortogonales: 3) tendencia lineal y 4) cuadrática en semen fresco; y 5) tendencia lineal y 6) cuadrática en semen refrigerado. Para los patrones B y RA no se incluyó la tendencia cuadrática en semen fresco, pues no se incluyó el nivel 0 h ya que todas las observaciones fueron iguales a cero. Cuando hubo interacción de PRE con edad del carnero, se analizaron las diferencias entre edades para las mismas comparaciones planeadas y los polinomios ortogonales mencionados. Dado que para el semen refrigerado los niveles de tiempo no estaban igualmente espaciados, los coeficientes de los polinomios ortogonales se generaron con la función ORPOL de PROC IML (SAS 2004b).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Para MP hubo efectos (p<0.01) de subclase tipo–tiempo de preservación y raza del carnero, pero no de edad o interacción (p>0.05). En semen fresco, en promedio para las 3 y 6 h, el MP se redujo 18% más (p<0.01) que en el refrigerado; además la MP se mantuvo en el refrigerado (p>0.05) en los tiempos evaluados, pero en el semen fresco se redujo cuadráticamente (p<0.01), con una mayor reducción de las 3 a las 6 h (19%) que de las 0 a las 3 h (8%; Cuadro 1; Figura 1).

En el semen congelado MP se redujo drásticamente (promedio 53.7±1.9%) (p<0.01) comparado con el semen refrigerado 24 h (83.3±1.9%; Cuadro 1; Figura 1). Los espermatozoides de carnero tienen una alta tasa metabólica y el semen diluido de carnero no debe estar más de 4 h entre 30 a 39 °C (Vivanco, 1998). Además, al congelar el semen sólo alrededor de 50% de los espermatozoides de carnero mantienen su viabilidad (Bailey y Buhr, 1994), lo cual coincide con los valores de MP del presente estudio. Con la refrigeración el semen mantuvo su motilidad progresiva en niveles similares al semen fresco a las 0 h, porque al bajar la temperatura se reduce la actividad metabólica y de motilidad, lo que aumenta la vida media del espermatozoide. La motilidad se reestablece nuevamente al subir la temperatura (30 a 39 °C), si no hubo daños estructurales causados por un shock térmico (Vivanco, 1998). Paulenz et al. (2002) no observaron diferencias en MP al monitorear semen diluido a 5 °C por 0, 6, 24 y 30 h; sin embargo, Maxwell y Salamon (1993) indican que la fertilidad del semen refrigerado de carnero declina rápidamente después de las 24 h. Los carneros Pelibuey tuvieron un promedio mayor de MP (p<0.01; 79.4±1%) que los Blackbelly (74±1%). Bag et al. (2002) reportan efectos de raza en la MP del semen de carnero, y Lunstra y Echternkamp (1982) en toretes.

Para el porcentaje de espermatozoides capacitados con acrosoma intacto (Patrón B del ensayo de CTC), sólo la subclase tipo–tiempo de preservación mostró un efecto significativo (p<0.01). En promedio, el semen refrigerado a 5 °C tuvo mayor (p<0.01) porcentaje de patrón B que el semen en fresco a 36 °C por 3 y 6 h, y el refrigerado por 24 h que el semen congelado (Cuadro 1). Asimismo, a través del tiempo, con la refrigeración del semen aumentó (p<0.01) cuadráticamente (Cuadro 1 y Figura 2) el porcentaje de Patrón B (32.8, 42.5 y 44.5%, E.E.=2.2, para R3, R6 y R24). Morrier et al. (2002) reportaron resultados similares (34 ±2 y 40±4% para el patrón B en semen de carnero refrigerado 3 h a 5 °C y en semen congelado. Según Bailey et al. (2002), estos resultados se deben a los cambios en la membrana celular causados por las temperaturas de refrigeración y de congelación usadas para la criopreservación, lo cual aumenta los niveles intracelulares de Ca⁺² (Bailey y Buhr, 1994), como ocurre en la CE (Cormier y Bailey, 2003). También en el semen mantenido 3 h a 36 °C hubo un proceso de CE inducida en 23.9±2.2% para el patrón B, y ésta aumentó (p<0.01) a 30.8±2.2% a las 6 h. Pérez et al. (1997) mencionan que la CE se puede presentar también en el semen de carnero almacenado sin diluir; ellos encontraron 30 a 35% de espermatozoides con patrón B después de 4 h de almacenamiento a 20 °C, resultados similares a los del presente estudio. Cormier et al. (1997) observaron 19% de patrón B en semen fresco de bovino a las 4 h a 23 °C.

En espermatozoides capacitados con reacción acrosomal (patrón RA del ensayo de CTC), hubo un efecto de la interacción (p<0.01) de tipo–tiempo de preservación por edad, pero no de la raza del carnero (p<0.05). Al transcurrir el tiempo de preservación y el tipo de preservación pasó de la dilución en fresco a la refrigeración y luego al congelado, los espermatozoides con el patrón RA aumentaron de 6 a más de 26% (Figura 3), y este incremento fue mayor para los carneros jóvenes que para los adultos en semen refrigerado por 24 h y semen congelado (27.7± 1.5 vs 19.8±1.5% y 33.8±1.6 vs 26.3±1.5%). El efecto de la interacción se debió al marcado incremento lineal (p<0.01) con el tiempo de conservación en el semen refrigerado de carneros jóvenes, comparado con el de los adultos (Cuadro 1; Figura 3). Este efecto de la edad en el patrón RA fue reportado en toros por Lunstra y Echternkamp (1982) y por Januskauskas et al. (1999). Según Dott et al. (1979) y Corteel (1980), el efecto de la edad en la viabilidad y motilidad de los espermatozoides se debe al grado de madurez de las glándulas sexuales accesorias en el macho. La concentración de proteínas en el plasma seminal aumentó significativamente de los 7 a los 13 meses de edad, mejorando la viabilidad y motilidad de los espermatozoides (Lunstra y Echternkamp, 1982). Pérez et al. (1997) observaron 7% de espermatozoides con reacción acrosomal después de almacenar el semen de carnero 4 h a 20 °C, y Morrier et al. (2002) reportaron 14, 10, 15 y 25% de patrón RA en semen refrigerado (5 °C) por 3, 8, 16 y 24 h. Un semen apto para inseminación artificial debe tener al menos 45 a 50% de espermatozoides intactos (la diferencia con respecto a la suma de espermatozoides con los patrones B y RA) (Ax et al., 2005), lo cual no ocurre con los promedios observados en el presente estudio para el semen refrigerado 24 h (R24) y el congelado (CON). Esto indica que el semen de muchos de los sementales con estos esquemas de preservación no es apto para la inseminación artificial.

Para la criopreservación del semen, el almacenamiento a 36 °C y la refrigeración del semen diluido de carnero dan origen a espermatozoides con capacitación prematura. El semen diluido se conserva bien en fresco las primeras 3 h. Con la refrigeración a 5 °C por 24 h, al igual que con la criopreservación, se inducen niveles de capacitación espermática que cambian la fertilidad en programas de inseminación artificial; esto es más crítico en carneros jóvenes que en adultos. El semen fresco debe usarse las primeras 3 ó 4 h, de lo contrario se debe refrigerar; si la inseminación artificial se hará a las 24 h o después, se debe congelar.

 

AGRADECIMIENTOS

Al Fondo Sectorial SAGARPA–CONACYT, México, por el apoyo financiero brindado a través del proyecto SAGARPA–2004–C01–167.

 

LITERATURA CITADA

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