Protección vegetal

 

Etiología de la muerte descendente del mezquite (Prosopis laevigata L.) en la reserva de la biosfera del Valle de Zapotitlán, México

 

Etiology of mesquite dieback (Prosopis laevigata L.) in the biosphere reserve of Zapotitlan Valley, Mexico

 

Rodolfo De La Torre–Almaráz*¹, F. Maribel Cota–Trujillo¹, J. Lilia García–Rojas¹, Jorge E. Campos¹, Felipe San–Martín²

 

¹ Facultad de Estudios Superiores Iztacala. Laboratorio de Microbiología. UNAM. 54090. Tlalnepantla, Estado de México, México.

² BIOTA A. C. Sierra Sosa # 617 Fr. Villa Real. 87027. Cd. Victoria, Tamaulipas. México.* Autor responsable: (drodolfo@servidor.unam.mx)

 

Recibido: Octubre, 2007.
Aprobado: Diciembre, 2008.

 

Resumen

En 2001, plantas de mezquite (Prosopis laevigata L.) con muerte descendente de ramas, fueron observadas en la reserva de la Biosfera de Tehuacán–Cuicatlán, Puebla (18° 15' N y 97° 25' O). Sobre las ramas con daños se desarrolló un hongo de color pardo claro que produjo conidióforos y conidios hialinos, verdosos, elipsoides con un extremo truncado. En el estroma pul vinado y aglomerado hubo masas de peritecios negros conspicuos y globosos. Las ascosporas son pardo–oscuro, unicelulares, elipsoides desiguales, con extremos redondeados y un tubo germinativo a lo largo de la espora. Las perisporas fueron dehiscentes en tratamiento con KOH (10 %) y la epispora lisa y enrollada. El hongo fue identificado como Hypoxylon diatrypeoides Rehm y su anamorfo como una especie del tipo Nodulosporium. Los síntomas de muerte descendente fueron inducidos en plantas de mezquite producidas en el invernadero, con inoculación en tallos por inserción de palillos de madera colonizados con micelio y peritecios del hongo, 15 d después de la inoculación. La caracterización molecular por secuencias nucleotídicas de la región ITS1–ITS2 de H. diatrypeoides de México (No. de acceso AY303629) confirmó su ubicación taxonómica dentro de la familia Xilareaceae, relacionándose con especies reportadas sólo en Sudamérica y el sur de Asia.

Palabras clave: Patosistemas silvestres, tierras áridas, xylariales.

 

Abstract

During 2001, branch dieback (Prosopis laevigata L.) was observed on mesquite plants in the Tehuacan–Cuicatlán biosphere reserve, Puebla, México (18° 15' N and 97° 25' W). Developing on damaged branches was a light brown fungus tissue that produced conidiophores and hyaline conidia, greenish in mass, ellipsoid with one truncate tip and glomerate to pulvinate stromata with conspicuous perithecial mounds, black surface, and globose perithecia. Ascospores were dark–brown, single–celled, non–equilateral ellipsoid with rounded tips and a germination tube along the spore. Perispores were dehiscent in 10 % KOH and had coiled, smooth epispore. The fungus was identified as Hypoxylon diatrypeoides Rehm and its anamorph as a Nodulosporium–type species. Branch dieback symptoms were induced in mesquite plants produced in a greenhouse by inoculating branches with a wooden toothpick colonized with fungus mycelia and perthecia and inserted through a permanent wound. Symptoms appeared 15 days after the inoculation. The nucleotide sequence of the ITS1–ITS2 region of this H. diatrypeoides isolate from México (Accession No. AY303629) confirmed that taxonomically it belongs to the Xilareaceae family and was related to species previously reported only in South America and South Asia.

Key words: Wild plant pathosystems, arid lands, xylariales.

 

INTRODUCCIÓN

El género Prosopis en México se conoce con el nombre común de mezquite, que proviene del náhuatl micuitl, y que probablemente los aztecas le dieron a estas plantas (Granados, 1996). Este género contiene poco más de 40 especies nativas de regiones áridas y semiáridas de Norte y Sudamérica, África y Asia, con individuos desde 40 cm hasta 20 m de altura, pudiendo crecer en zonas con lluvias menores a los 100 mm anuales y soportando en verano temperaturas máximas promedio superiores a 40 °C. El mezquite es un recurso natural con importancia económica en las regiones áridas y semiáridas del mundo, ya que su madera es usada como combustible, para construcción de cercas, sus vainas como forraje y como alimento para el hombre; produce resina que tiene uso en la fabricación de pegamentos, barnices, mientras sus flores son importantes en la producción de miel (Buckart, 1976; Hernández, 1992).

En México hay 10 especies de mezquite: Prosopis palmeri, P. reptans var. cineroscens, P. pubescens, P. articulata, P. laevigata, P. tamaulipana, P. velutina, P. juliflora, P. glandulosa var. tipica, P. glandulosa var. torreyana y P. mexicanum. En las regiones altas y semiáridas de los Valles Centrales de México se distribuye principalmente P. laevigata (Rzedowski, 1988).

Grandes poblaciones de P. laevigata forman parte importante de la flora nativa en el Valle de Zapotitlán, en el estado de Puebla, las cuales están en las partes bajas y en los márgenes de los ríos y arroyos del Valle, ocupando una superficie aproximada de 4000 ha (Dávila et al., 1993). En la región se han observado diversas clases de daños o enfermedades que afectan a numerosas plantas P. laevigata; una de estas enfermedades causa una pudrición seca, negra, así como defoliación de ramas jóvenes y tiernas, y su muerte. Los daños causados por esta enfermedad se inician en la parte apical de las ramas jóvenes, avanzando hacia el centro del árbol, por lo que en el presente trabajo, este daño es descrito como muerte descendente (Figura 1A). Otro daño común en las ramas secundarias se caracteriza por la presencia de manchas redondas o alargadas, negras opacas y aspecto húmedo que causan el rompimiento y desintegración de la corteza, de la cual escurre abundante goma o resina de color rojizo; por tanto, esta enfermedad fue denominada resinosis de ramas (Figura 1B).

La muerte descendente y resinosis de las ramas son particularmente más intensas en sitios con exceso de sombra y húmedos (Obs. pers.). En México se desconocen los agentes causales que originan estos daños en mezquite; sin embargo, evidencia preliminar obtenida en nuestro laboratorio indicó que estas enfermedades probablemente eran causadas por alguna clase de hongos. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue determinar la etiología de los síntomas de la muerte descendente y resinosis que afectan al mezquite (P. laevigata) en el Valle de Zapotitlán, Puebla, México.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Sitio de recolecta de muestras

El Valle de Zapotitlán está en la porción suroeste del estado de Puebla (18° 20' N y 97° 'O) y está considerado como una de las etiología de la muerte descendente del mezquite en la reserva de la biosfera del valle de Zapotitlán, México reservas naturales con la mayor riqueza, diversidad y endemismo florístico en el mundo (Dávila et al., 1993). El clima en la región es semiárido del tipo BShw"(w)(e)g con una precipitación media anual de 380 mm, una temperatura media anual de 21.4 °C (16.5 °C en enero y 24.2 °C en mayo). El principal tipo de vegetación en la zona es el matorral xerófilo, donde el mezquite es una de las especies vegetales dominantes ocupa un extenso territorio en la zona (Dávila et al., 1993; Valiente et al., 2001).

Del 2001 al 2004 en recorridos en las poblaciones de mezquite en el Valle de Zapotitlán, fueron recolectadas ramas y trozos de troncos de mezquite con los síntomas de muerte descendente y resinosis de ramas, usando tijeras de podar o serruchos. El material recolectado fue etiquetado, colocado en bolsas de papel encerado (20X40 cm) y trasladado al Laboratorio de Microbiología de la Unidad de Biotecnología y Prototipos, Facultad de Estudios Superiores, Iztacala UNAM para herborización (Lot y Chiang, 1986) y análisis fitopatológico (Király et al., 1974). En el herbario de la FES–Iztacala (FESI) y en el herbario R. H. Miller de la Universidad de Georgia, Athens, EE. UU. fueron depositadas y registradas muestras de 100 g de material previamente tratado a 45–50 °C, en donde puede ser requerido para su consulta.

Aislamiento de hongos a partir de tejido de mezquite con síntomas

Fragmentos (1 cm largo) de madera de mezquite con síntomas, recién recolectado en campo, fueron recolectados y desinfectados con una solución de hipoclorito de sodio al 2 %; se lavaron con agua destilada estéril y colocaron en papel filtro estéril en una cámara de flujo laminar hasta eliminar el exceso de humedad. Cada trozo de material desinfectado y seco se cortó en fragmentos más pequeños (aproximadamente 3 mm largo), y usando pinzas de disección estériles se colocaron al centro de una caja petri con medio de papa dextrosa agar (PDA). Las cajas con los distintos tipos de materiales de mezquite infectado estuvieron en una cámara incubadora a 37 °C o a temperatura de laboratorio (18 °C) hasta por 30 d. Las colonias obtenidas después de los periodos de incubación se transfirieron a nuevas cajas petri con medio de cultivo PDA fresco, procedimiento repetido hasta obtener un solo tipo de colonia (Király et al., 1974).

Aislamiento de hongos del tejido de mezquite con signos

Se realizaron cortes de los tejidos dañados y con signos usando una hoja de rasurar de doble filo. Los cortes se montaron en portas y cubreobjetos en un microscopio esteroscópico utilizando agua destilada estéril o solución de azul de lactofenol. En algunas preparaciones se utilizó el reactivo de yodo para destacar algunos detalles estructurales típicos de importancia taxonómica y la solución KOH al 10 %.

Parte de las estructuras fungosas (micelio, cuerpos fructíferos o esporas) encontradas en la superficie del material de mezquite con síntomas se transfirieron directamente a cajas petri con medio PDA, incubándolas a 37 °C o a temperatura de laboratorio (18 °C) (Király et al., 1974). Los hongos aislados en los medios de cultivo artificial se observaron con un microscopio compuesto (Carl Zeiss), se anotaron todas sus características morfológicas, así como el color y tamaño de sus estructuras, utilizando la escala micrométrica del ocular ajustado con un micrometro objetivo (0–1mm/100, Nikon).

Pruebas de patogenicidad

Vainas sanas de algunos árboles de mezquite fueron recolectados para obtener semillas maduras, las cuales se sembraron en almácigos con una mezcla estéril de arena, tierra de hoja y negra (2:1:1 v/v). Las plántulas fueron transplantadas a macetas (1 L de capacidad) y mantenidas en invernadero hasta una altura de 30 a 40 cm, lo que ocurrió aproximadamente cinco meses después de la siembra.

Para la inoculación e inducción de los síntomas observados en mezquite en campo, se utilizó el método de inoculación de palillos de madera colonizado con micelio y cuerpos fructíferos del organismo que fue el más frecuente para aislar del material enfermo (Mengistu et al., 1996), co–cultivados en medio de PDA mejorado con 10 % de cloruro de calcio, donde se obtuvo abundante micelio y cuerpos fructíferos y esporas.

Durante el verano de 2002 se hicieron pruebas de patogenicidad en invernadero (25°–35 °C) usando tres plantas jóvenes de mezquite (25 cm altura) producidas desde semilla en el invernadero, por tratamiento. Los tratamientos fueron: 1) inoculación de ramas con inserción de un palillo de madera, colonizado con micelio y peritecios del hongo en medio V8–agar; 2) aspersión de ascosporas en ramas heridas con un palillo de madera estéril; 3) aspersión de ascosporas en ramas sin herir; 4) plantas heridas sin aplicación de inóculo; 5) plantas inoculadas sin heridas Cuando aparecieron síntomas en las plantas inoculadas se realizaron re–aislamientos del patógeno en medios de cultivos y se comparó con el aislamiento original. Se realizaron tres pruebas de patogenicidad con el mismo número de plantas y tratamientos por prueba.

Caracterización molecular por secuenciación y análisis filogenético de productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se obtuvo ADN de 0.100 mg de esporas separadas de los cuerpos fructíferos encontrados en las ramas de mezquite enfermas, utilizando el reactivo de DNAzol y siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogene, USA). Se obtuvo ADN total por el método de Dellaporta et al. (1983) con 1 g de micelio del hongo aislado del material enfermo de mezquite del H. diatrypeoides cultivado en caldo de papa–dextrosa (15 %) por 15 d. Se realizó el ensayo de la PCR para la amplificación de las regiones intergenéticas transcripcionales (ITS1–ITS2) del componente ADN 18S ribosomal de hongos (Lee y Taylor, 1990; Mugnier, 1998; Sogin, 1990). Los oligonucleótidos utilizados fueron ITS4 (5'–TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC–3') e ITS5 (5'–GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G–3') (White et al., 1999). El programa de amplificación consistió de: 1 ciclo 95 °C, 1 min; 30 ciclos a 95 °C, 1 min, 57 °C, 1 min, 72 °C, 1 min; 1 ciclo a 72 °C, 12 min.

Los productos amplificados se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 1.0 % en solución amortiguadora de boratos pH 8.0, teñidos con bromuro de etidio para su documentación. Los productos de PCR fueron purificados con el método de Exo–sap–IT (Invitro Gene, USA) o tomados directamente del gel y purificados con Wizar SV (Promega, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los fragmentos fueron secuenciados directamente en un Genetic Analyzer 3100 (Applied Biosystems, USA). Las secuencias nucleotídicas obtenidas se depositaron en el GenBank para obtener su número de acceso, y se compararon con las disponibles en ese mismo banco de datos (NCBI, 1999), usando el método de Blast. Las secuencias fueron alineadas a ojo con MacClade 4.06 (Maddison y Maddison, 2003). El análisis de búsquedas parsimoniosas se realizó con el programa Paup versión 4.0b10 (Swofford, 2002) usando el comando PRAP (Müller, 2004) con 10 réplicas de adiciones aleatorias de taxón y el barrido con "tree–bisection–reconnection" (TBR), con las opciones "steepest descent" y "multiple tree" sin efecto. Los "gaps" fueron tratados como datos perdidos. El soporte estadístico fue medido con la prueba no paramétrica Bootstrap implementada en PAUP. Las proporciones del Bootstrap se basaron en 10 000 réplicas usando el método "simple–taxon–addition tree" de forma inicial; las opciones TBR "steepest descent" y "multiple tree" options quedaron sin efecto. Búsquedas heurísticas más intensas no aumentaron la fiabilidad del análisis Bootstrap (Müller, 2005). Aquellos nodos que reportaron niveles BP > 70 % se consideraron estadísticamente significativos (Hillis y Bull, 1993). El dendrogramas final fue construido usando el programa "TreeGraph" (Müller y Müller, 2005).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento, cultivo e identificación de hongos

En medio de cultivo artificial de PDA se logró aislar un hongo de los fragmentos de tejidos con los síntomas de muerte descendente y resinosis de ramas de mezquite que crece en forma natural en el Valle de Zapotitlán, Puebla, México. El hongo aislado desarrolló una colonia micelial blanquecino y aspecto algodonoso al principio, observándose posteriormente anillos concéntricos, adquiriendo una coloración ligeramente verdosa y al final pardo claro. Después de dos semanas de crecimiento aparecieron en toda la caja petri conglomerados de micelio que formaron cuerpos globosos oscuros, en cuyo interior había ascas y ascosporas similares a las encontradas en los tejidos afectados con la enfermedad de muerte descendente. La observación directa de signos en las ramas de mezquite con muerte descendente permitió encontrar en forma natural una masa micelial pardo claro que contenía conidióforos y conidios hialinos, con forma elipsoidal y un extremo truncado, con medidas de 5.14–6.66 x 4.13–4.86 mm (Figura 2). Por sus características morfológicas fue identificado como un hongo del tipo Nodulosporium (Barnett y Hunter, 1998).

Bajo la masa de conidioforos y conidios se desarrolló un estroma aglomerado o pulvinado formando peritecios globosos negros y labios periteciales conspicuos (–1.5) 2 mm longitud x 2 mm anchura (–3.5); superficie negra brillante, de consistencia serosa (Figura 3). Los peritecios frecuentemente estaban cubiertos por conidioforos y conidioesporas del tipo Nodulosporium. Los peritecios globosos a subglobosos (0.32–0.48 mm diámetro) con ostiolos umbilicados (Figura 3) contenían gránulos rojizos a negruzcos dispersos inmediatamente bajo la gruesa capa peritecial y entre las paredes. Las ascas tenían una media de 153.1–173.37 µm longitud total x 10.2–12.83 µm anchura, la parte del alineamiento de esporas de 82.37–99.96 µm y el tallo de la asca de 59.08–83.36 µm longiud (Figura 4). No se observó anillo apical ni la presencia de almidón en las ascas con el tratamiento de solución de yodo.

Las ascosporas eran pardo–oscuras, unicelulares, elipsoides–inequilaterales, con extremos ligeramente redondeados con las siguientes medidas: (13.56–) 14.90 (–16.24) x (–6.99) 8.04 (–9.08) µm, con la longitud de la abertura germinal alargada del lado convexo. Se precisó la presencia de una periespora dehiscente al tratar las ascosporas con una solución de KOH al 10 %, y la epispora de aspecto cristalino y lisa (Figura 5) (Hanlin, 1998; Ulloa y Hanlin, 2000).

Considerando las características morfológicas registradas, este segundo hongo aislado y separado en medios artificiales a partir de los síntomas de muerte descendente y resinosis, que fructifica en forma natural sólo en las ramas con el síntoma de muerte descendente, fue identificado como Hypoxylon diatrypeoides Rehm. (Ascomycete:Xylariales) considerando los criterios taxonómicos de Ju y Rogers (1996), así como los de San Martín y Lavin (1999) y San Martín et al. (1998).

El hongo Nodulosporium es considerado como el anamorfo o la fase asexual de varias especies del género Hypoxylon (Ju y Rogers (1996). Por tanto, se concluye que ambos hongos están relacionados con la inducción de los síntomas observados en mezquite, probablemente en diversas etapas del desarrollo de las enfermedades en el Valle de Zapotitlán. Muestras de ramas de mezquite con estromas de H. diatrypeoides y masas conidiales de Nodulosporium se depositaron y registraron en el herbario J. H. Miller de la Universidad de Georgia (No. de acceso GAM16048).

Pruebas de patogenicidad

Las pruebas de patogenicidad mostraron que 15 d después de las inoculaciones de las plantas de mezquite en el invernadero, se observaron síntomas de muerte descendente y pudrición del tronco en todas las plantas inoculadas con palillos de dientes colonizados con micelio y peritecios (Figura 6), y en la mitad de los individuos inoculados con ascosporas. No se observaron síntomas en plantas sin heridas y en los tratamientos testigo (Cuadro 1). El hongo H. diatrypeoides fue reaislado consistentemente de las ramas sintomáticas. Entonces, H. diatrypeoides es el agente causal de la muerte descendente y pudrición negra del tronco del mezquite en el Valle de Zapotitlán y aunque son comunes otras especies del género Hypoxylon en México (Mendel y Chacón, 1997; Guzmán y Medel, 1999; San Martín et al., 1999), se confirma su función como patógeno en mezquite (De La Torre et al., 2003). Previamente, este hongo sólo había sido reportado como saprofito en madera de encinos en Brasil y Nueva Zelanda (Ju y Rogers, 1996).

Caracterización molecular por secuenciación y análisis filogenético de productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se obtuvo regularmente un producto de 600–650 pb en la PCR con los oligonucleótidos ITS4–ITS5, del ADN obtenido de las esporas y del micelio cultivado en medio líquido. Tres secuencias directas de los productos de la PCR, fueron obtenidas: una procedente del ADN de esporas (No. de acceso AY303629) y dos del micelio (No. de acceso DQ985380 y DQ985381).

Los resultados de la comparación entre las secuencias obtenidas de ADN de esporas y micelio de los aislados de H. diatrypeoides del mezquite de Zapotitlán, con los síntomas de muerte descendente y pudrición negra del tronco, mostró una homología lo suficientemente alta para considerarlos como la misma especie. La comparación de estas secuencias con las disponibles en el GenBank permitió confirmar que el hongo aislado de plantas de mezquite sólo se agrupa con la secuencia de un aislado de Hypoxylon, aún no descrito hasta especie, procedente de Tailandia (No. de acceso DQ223765) (Figura 7).

Las secuencias más relacionadas al grupo de H. diatrypeoides pertenecen a H. ochraceum y con H. perforatum, especies distribuidas en el hemisferio sur, particularmente en Sudamérica y Nueva Zelanda. El único reporte morfológico anterior de la especie H. diatrypeoides se encuentra en Brasil (Ju y Rogers, 1996) lo que sugiere que la distribución de esta especie sea continua entre los hemisferios norte y sur en América y posiblemente en el sur de Asia (Katleen et al., 1997). El dendrograma presenta dos grupos cuya separación no está bien sustentada, pero sus agrupamientos interiores si lo están; uno de ellos agrupa secuencias de especies de los géneros Daldinia y Entonaema; el segundo está conformado principalmente por especies del género Hypoxylon. Sin embargo, una secuencia de la especie D. loculata y otra de H. fuscopurpureum no se agrupan con los de su misma especie, lo cual podría sugerir una clasificación errónea del organismo de origen de estas secuencias (Figura 7).

 

CONCLUSIONES

Se determinó que el agente causal de la muerte descendente y la resinosis del mezquite, que crece naturalamente en el Valle de Zapotitlán, en el estado de Puebla, México, es causada por un hongo Ascomycete perteneciente al orden Xylareales. El hongo fue identificado como Hypoxylon diatrypeoides Rehm, considerando las características morfológicas de sus peritecios, ascas y ascosporas. El hongo se aisló y cultivó en medios artificiales de los tejidos con los síntomas de muerte descendente y pudrición negra del tronco, aunque se observó la producción en condiciones naturales de peritecios de H. diatrypeoides, junto con conidios y conidiosporas de una especie de Nodulosporium, que se consideró la fase anamorfica o asexual de H. diatrypeoides.

Se reprodujeron los síntomas de muerte descendente y resinosis del tronco en plantas jóvenes de mezquite producidas en el invernadero, cuando se inocularon con el micelio y peritecios inoculadas del hongo H. diatrypeoides aislado de mezquite y cultivado en medio artificial.

La secuencia nucleotídica de la región ITS1–ITS2 del rADN del aislamiento de H. diatrypeoides de México confirmó que este hongo pertenece al orden Xylareales con relaciones filogenéticas con otras especies de Hypoxylon reportadas en el hemisferio sur (Brasil y Nueva Zelanda), pero éste es el primer reporte en el hemisferio norte y en México, causando una enfermedad en mezquite.

 

AGRADECIMIENTOS

Este proyecto de investigación fue financiado totalmente por la CONABIO (Proyecto BK–041).

 

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