Protección vegetal

 

Control de bacterias patógenas y hongos de postcosecha con extractos del pigmento de Gibberella zeae (Fusarium graminearum)

 

Pathogenic bacteria and postharvest fungi control with pigment extracts from Gibberella zeae (Fusarium graminearum)

 

Ramón Villanueva-Arce¹, C. Arturo Aguilar-Pompa¹, Y. de las Mercedes Gómez y Gómez¹, Gustavo Valencia-Del Toro¹, A. Belem Piña-Guzmán¹, Silvia Bautista-Baños²

 

¹ Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI). Instituto Politécnico Nacional (IPN). Avenida Acueducto s/n, Barrio La Laguna Ticomán. 07340 México, D. F. *Autor responsable. (rarce@ipn.mx).

² Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi). IPN. Km 8.5 Carretera Yautepec-Jojutla. 62731, San Isidro, Yautepec, Morelos.

 

Recibido: octubre, 2012.
Aprobado: agosto, 2013.

 

Resumen

El objetivo del estudio fue evaluar efectos del extracto etanólico crudo del pigmento rojo-púrpura producido por Gibberella zeae (Fusarium graminearum) en el control de las bacterias Bacillus subtilis, Salmonella typhi, Shigella sp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, la levadura Candida albicans, y los hongos Colletotrichum acutatum, C. fiagariae y C. gloeosporioides. El diseño experimental fue completamente al azar con un arreglo factorial 3x2 de tratamientos: temperatura (20; 28 °C), pH (6; 8) y medio de cultivo sólido (PDA; EMA; Czapeck) y líquido (caldo papa; caldo extracto de malta y caldo Czapeck). Las variables de respuesta fueron tipo y hábito de crecimiento del micelio, color de la colonia, diámetro de la colonia (mm), tiempo (d) de aparición del pigmento y producción de biomasa (g). Con los datos se realizó un ANDEVA y las medias de los tratamientos se compararon con contrastes ortogonales. El pigmento se extrajo con etanol (96°), se concentró y usó 1.6 mg de este extracto diluido en 100 μL (16 mg μL^-1), en pruebas de control de bacterias patógenas y de hongos fitopatógenos. Las mejores condiciones de crecimiento fueron 20 °C, pH 6.0 en PDA. La aparición del pigmento rojo-púrpura fue 4 a 9 d después de la siembra. El crecimiento del hongo fue menor en medio líquido al igual que la producción del pigmento rojo. Después de 24 h sólo se observó inhibición del crecimiento en las bacterias S. typhi y S. aureus. El análisis de los resultados mostró la actividad antimicrobiana del pigmento producido por G. zeae para S. typhi y S. aureus, pero no para B. subtilis, Shigella sp., E. coli, C. albicans, C. acutatum, C. iragariae y C. gloeosporioides.

Palabras clave: pigmentos fúngicos, aurofusarina, Salmonella, Shiguella, Colletotrichum.

 

Abstract

The objective of this study was to evaluate effects of crude ethanol extract of the reddish purple pigment produced by Gibberella zeae (Fusarium graminearum) in the control of the bacteria Bacillus subtilis, Salmonella typhi, Shigella sp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, the yeast Candida albicans, and the fungi Colletotrichum acutatum, C. fragariae and C. gloeosporioides. The experimental design was completely randomized with a 3x2 factorial arrangement of treatments: temperature (20; 28 °C), pH (6; 8), and solid (PDA; EMA; Czapeck) and liquid (potato broth; malt extract broth; Czapeck broth) culture media. The response variables were growth type and habit of the mycelia, colony color, colony diameter (mm), time (d) of pigment appearance and biomass production (g). With these data an ANOVA was performed and treatment means were compared with orthogonal contrasts. The pigment was extracted with ethanol (96°) and concentrated; 1.6 mg of this extract diluted in 100 μL (16 mg μL^-1) was used in pathogenic bacteria and phytopathogenic fungi control tests. The best conditions for growth were 20 °C, pH 6.0 in PDA. The reddish-purple pigment appeared 4 to 9 d after sowing. Fungus growth was less in liquid medium as was red pigment production. After 24 h, inhibition of growth was observed only in the bacteria S. typhi and S. aureus. Analysis of the results revealed antimicrobial activity of the pigment produced by G. zeae against S. typhi and S. aureus, but not against B. subtilis, Shigella sp., E. coli, C. albicans, C. acutatum, C. iragariae or C. gloeosporioides.

Key words: fungal pigments, aurofarsarin, Salmonella, Shiguella, Colletotrichum.

 

INTRODUCCIÓN

Los hongos proveen una gran gama de metabolitos secundarios y algunos tienen actividad biológica que se puede usar en medicina, agricultura, alimentación, etc. (Carlile et al., 2001). Los hongos basidiomicetes (macroscópicos) y filamentosos (microscópicos) producen compuestos antimicrobianos, antifúngicos, antivirales y citostáticos, etc. (Brizuela et al., 1998; Trigos et al., 2005). Además, algunos basidiomicetes tienen actividad antiinflamatoria, antioxidante, antitumoral y reguladora de los niveles de azúcar y de colesterol, y se pueden usar en tratamientos clínicos (Stamets, 2002). La actividad antimicrobiana de los hongos es básicamente controlar bacterias y hongos (Carlile et al., 2001) que causan enfermedades en hombres y animales (Gutiérrez et al., 2004). Los géneros que pueden producir antibióticos son Aspergillus, Acremonium y Penicillium (Cantoral-Fernández, 2000). Otros hongos producen metabolitos secundarios (toxinas, pigmentos, etc.) con actividad biológica contra otros microorganismos (Trigos et al., 2005), pero no se conocen los compuestos responsables de dicha actividad antimicrobiana. Los hongos filamentosos Monascus spp., Paecilomyces spp., Aspergillus spp. y Penicillium spp. producen pigmentos que son melaninas, betalaínas, quinonas, xantinas, flavonoides, curcuminoides, carotenoides, isocromos e iridoides, los cuales tienen especial interés industrial y alimenticio (González-Ruíz et al., 2009).

Un género de hongo filamentoso importante en la agricultura y el manejo de granos y semillas, por sus toxinas y los daños causados es Fusarium spp. (Nelson et al., 1983). Algunas especies de Fusarium pueden presentar, en medios de cultivo sintético, colonias blancas, cremas, naranjas, pardo, pardo-rojizo, rojo carmín, rosa, púrpura, e incluso azuladas (Nelson et al., 1983). El pigmento puede estar dentro del micelio o disperso en el medio de cultivo en el cual se desarrolla el hongo. En Fusarium graminearum Schwabe [teleomorfo Gibberella zeae (Schwein.: Fr.) Petch], el pigmento está asociado con la producción de la toxina aurofusarina, una naftoquinona (Medentsev et al., 2005) presente en granos forrajeros contaminados y asociado con el cambio de la yema de huevo de naranja amarillento a pardo oscuro (Kotyk et al., 1990). Algunos de los pigmentos producidos por Fusarium solani (Mart.) Sacc. pueden tener actividad antimicrobiana contra hongos y bacterias (Ammar et al., 1979) por lo que no se descarta que los pigmentos producidos por F. graminearum también lo tengan. El objetivo de este estudio fue evaluar el extracto crudo de color púrpura de G. zeae (F. graminearum) obtenido de material vegetal muerto, en el control de bacterias de interés clínico (Bacillus subtilis, Salmonella typhi, Shigella sp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli), la levadura Candida albicans y hongos de postcosecha (Colletotrichum spp.).

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Zonas de muestreo

Material vegetal, vivo (plantas) o muerto (residuos), con síntomas (necrosis, pudriciones, etc.) de ataque por hongos (fitopatógenos o saprófitos) fue recolectado desde enero a septiembre de 2009 en localidades de los estados de Guerrero (Chilacachapa, 18° 16' 21'' N, 99° 44' 25'' O, 1700 msnm), Michoacán (Zirahuén 19° 25' 41'' N, 101° 42' 37'' O, 2118 msnm), Morelos (San Isidro 18° 49' 30'' N, 99° 05' 48'' O, 1061 msnm) y el Estado de México (Coatepec Harinas 18° 55' 26'' N, 99° 46' 04'' O, 2266 msnm; La Marquesa 19° 17' 10'' N, 99° 22' 42''O, 3080 msnm, Ejido de la Finca, 18° 53' 08'' N, 99° 37' 32'' O, 1831 msnm). El material recolectado se trasladó en bolsas de papel dentro de cajas térmicas (20 °C) al laboratorio de Inocuidad Alimentaria de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI) del Instituto Politécnico Nacional (IPN) en la Ciudad de México, D. F.

Aislamiento y purificación de hongos

Las muestras recolectadas se usaron para preparaciones temporales en glicerol al 20 % y se observaron en un microscopio óptico para detectar signos (esporas, micelio, cuerpos fructíferos, etc.). En las muestras donde había esporas, los hongos se purificaron por la técnica de cultivos monospóricos (monoconidiales): una porción de micelio con esporas y se diluyó en tubos con agua destilada estéril, el líquido se vació en cajas petri con agar e incubadas 24 h a 25 ±2 °C en condiciones ambientales de luz. La caja petri se observó en un microscopio estereoscópico y se identificó la germinación de las esporas. Las esporas germinadas se aislaron individualmente, se sembraron en cajas petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) e incubadas 5 d a 25 ±2 °C con luz ambiental. Las muestras de material vegetal sin presencia de signo de los hongos, se colocaron en cámaras húmedas a 25± 2 °C y 9095 % HR con luz ambiental para favorecer la esporulación. En el material vivo, con síntomas de ataque de hongos (fitopatógenos), se cortaron secciones de tejido vivo y muerto, y se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1.5 %. Estas muestras se lavaron tres veces con agua destilada estéril, se secaron con papel estéril, se sembraron en cajas petri (100x10 mm) con PDA y extracto de malta agar (EMA) y las cajas petri sembradas se incubaron 3 d a 25 ± 2 °C con luz ambiental. Las colonias desarrolladas fueron aisladas y cuando produjeron esporas, se purificaron por cultivos monosporicos o punta de hifa. Las colonias desarrolladas y con esporas formadas se conservaron en una solución de glicerol al 20 % a -84 °C. Durante el aislamiento y crecimiento de los hongos se identificaron las colonias que produjeron algún metabolito (pigmento) o causaron inhibición o muerte de colonias fungosas o bacterianas.

Identificación de hongos productores de pigmentos

La identificación a nivel genérico de los hongos se realizó comparando las características morfológicas de la colonia y del tipo de estructuras (esporas) con claves taxonómicas de identificación de Barnett y Hunter (1998). Los hongos que no produjeron esporas se identificaron y caracterizaron a nivel molecular. Muestras de colonias puras (punta de hifa) se enviaron al laboratorio de la Estación Nacional de Epidemiología Cuarentena y Saneamiento Vegetal en Querétaro, estado de Querétaro, para la extracción del ADN ribosomal, amplificación, secuenciación y alineación con las bases de datos del banco de genes del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) de EE.UU.

Caracterización cultural del hongo y producción de pigmentos

Una vez identificado el hongo de interés se estudió y caracterizó en medio sólido y líquido (caldo) para encontrar las mejores condiciones de crecimiento y producción del pigmento. El diseño experimental fue completamente al azar con arreglo factorial 3x2 de tratamientos: temperatura (20, 28 °C), pH (6, 8) y medio de cultivo [PDA, EMA, Czapeck (Cza)]. En los medios líquidos sólo se excluyó agar [caldo papa dextrosa (CPD), caldo extracto de malta (CEM), caldo Czapeck (CCza)]. Las variables de respuesta fueron hábito de crecimiento del micelio, color de la colonia, diámetro de colonia (mm), tiempo (d) de aparición del pigmento y producción de biomasa (g). La unidad experimental fue una caja petri o un tubo de ensayo inoculado con micelio del hongo y hubo tres repeticiones por cada tratamiento. Con los datos se realizó un ANDEVA, y las medias de los tratamientos se compararon con contrastes ortogonales usando SAS (1988).

Para el medio sólido se depositó un disco (5 mm) de PDA con micelio en el centro de cada caja petri con medio de cultivo sólido (20 mL) y se incubaron 10 d en las condiciones señaladas. En todos los casos las evaluaciones fueron diarias, excepto en producción de biomasa que sólo se hizo a los 10 d. Para esto, se colocaron las cajas petri en baño maría hasta licuar el medio, y con unas pinzas se colocó el micelio en charolas de aluminio de peso conocido. Las muestras se secaron (60 °C por 2 d) en una estufa (Cole Parmer^® Mod. 05015-51. USA). Por diferencia de peso con el peso inicial, se calculó la producción de biomasa (g). En los medios de cultivo líquidos se depositó un disco (5 mm) de PDA con micelio en tubos de ensayo de 50 mL con 30 mL de medio de cultivo líquido. Los tubos se incubaron en agitación (100 rpm) 10 d en las condiciones indicadas. El micelio de cada tubo se extrajo por filtración bajo una campana de flujo laminar y se calculó la producción de biomasa como se hizo para los medios sólidos.

Extracción, purificación e identificación del pigmento

Para extraer el pigmento producido por las colonias de 20 d de edad se probaron solventes orgánicos: cloroformo (99.8 %, High Purity^®), éter de petróleo (99.99 %, Alyt^®), acetona (99.5 %, High Purity^®) y etanol 96° (99.5 %, Meyer^®). Primero se removió el micelio con un asa bacteriológica, el medio sólido (agar) se fragmentó, se colocó en morteros y se maceró con cada solvente separadamente. Las muestras maceradas se colocaron en matraces de 500 mL y se agregó más solvente hasta alcanzar un volumen de 200 mL (o el equivalente para una relación 2:1) y se agitaron manualmente por 10 min. Las muestras se colocaron 10 min en un sonicador Ultasonic Cleaner Mod. AS3120B (AutoScience^®, Tianjin, China) para favorecer la ruptura de las células y mejorar la extracción del pigmento, y luego se agitaron 10 min con el mismo equipo. La pigmentación de cada uno de los solventes se observó y se eligió aquel con mayor intensidad de color. El pigmento se concentró por destilación simple hasta evaporar la mayor cantidad del solvente: la muestra se filtró y se destiló 30 min. Después se agregó sulfato ferroso anhidro (para absorber restos de humedad) y se filtró para remover los restos del sulfato. El extracto crudo se depositó en viales de vidrio de 20 mL y se cubrieron con papel aluminio para protegerlos de la luz. Parte de este extracto crudo líquido se concentró en un rotovapor con vacío Hahnvapor Mod. HS-2000NS (HahnShin^®, Corea del Sur) (70 °C, 30 min), y el concentrado se depositó en un vial de vidrio de 2 mL con tapa perforada. Finalmente se determinó el peso del extracto (mg) obtenido de cada repetición (cajas petri).

Para separar y purificar el pigmento, se realizó una cromatografía en capa fina (TLC) de Sílica Gel 60G (Merck^® Millipore, Darmstadt, Alemania), como fase móvil se usó diferentes combinaciones de solventes [metanol (99. 5%, High Purity^®): hexano (98.5 %, High Purity^®) (8:2), hexano: acetato de etilo (99.5 %, Meyer^®) (8:2) y diclorometano (99.8 %, Reasol^®): acetato de etilo (8:2)]. El sistema de migración y visualización del pigmento fue evaluado. El revelado de la placa cromatográfica se hizo con ácido sulfúrico (10 %) a 40 °C. La cromatografía en capa fina se realizó con el solvente de mejor visibilidad y revelado, comparando el patrón de migración del pigmento con el de estándares de colorantes (safranina, rojo de metilo, rojo neutro, fucsina básica y naranja de xileno). La concentración usada como testigo para cada colorante químico fue 0.1 mg mL^-1. El factor de retención (Rf) de cada muestra se reporta y la similaridad del pigmento obtenido se determinó en función del Rf. Después se realizó una cromatografía en columna con Sílica Gel-60 eluída con la mezcla de solventes seleccionada en la cromatografía de capa fina, para lo cual se hidrataron 5 g de sílica-gel. En la parte superior de la columna de sílica se depositaron 300 ffL del pigmento concentrado y se agregó la mezcla de solventes seleccionados. Una fracción se recolectó cada 5 min (o cada vez que se observó la separación de una banda del pigmento a través de la columna). Las fracciones se leyeron en un espectrofotómetro Cintra Mod. 10e (Cintra^® 10e, Alemania) y se realizó un barrido en el espectro de luz visible (200-800 nm). Como blanco se usó la mezcla de solventes usada en la elución. Los puntos máximos de absorbancia y longitud de onda de cada fracción, así como la relación de éstos entre cada fracción fueron identificados. El color correspondiente de la relación absorbancia-longitud de onda del espectro de luz visible fue identificado.

Pruebas de control contra bacterias patógenas y hongos fitopatógenos

Con el extracto crudo concentrado de G. zeae se realizaron pruebas de control in vitro de cepas bacterianas de interés clínico (B. subtillis, S. typhi, Shigella sp., S. aureus y E. coli) y la levadura C. albicans, proporcionadas por el Laboratorio de Farmacología de la UPIBI. El método de vaciado en placa se usó porque permite un crecimiento bacteriano homogéneo en el área interna de la caja petri (NOM-092-SSA1, 1994). El medio de cultivo de siembra base (agar nutritivo) fue preparado; se vaciaron 10 mL del medio por cada caja petri y se inocularon las cepas bacterianas (0.1 mL inóculo 100 mL^-1 de medio de cultivo). Después de solidificar el medio de cultivo base, se depositó el medio de siembra (agar nutritivo). Luego se impregnó un sensidisco de papel filtro de 6 mm de diámetro estéril con una solución (16 mg μL^-1) de extracto crudo del pigmento en el solvente (etanol 96°). Los sensidiscos se colocaron sobre la superficie del medio de siembra por duplicado por caja y de manera opuesta en la parte media de las cajas petri. Las pruebas se realizaron por duplicado para cada bacteria. Las cajas inoculadas se incubaron (37 °C por 5 d) y se midió el diámetro de las colonias bacterianas. También se midió el diámetro del halo de inhibición para evaluar signos de inhibición o disminución en la velocidad de crecimiento.

Con el extracto crudo concentrado de G. zeae también se realizaron pruebas de control in vitro contra tres especies de Colletotrichum (C. fragarie A. N. Brooks, C. gloeosporoides (Penz.) Penz. & Sacc., y C. acutatum J. H. Simmonds) aislados e identificados de frutos de chirimoya y zarzamora (Villanueva, 2004); estos son los principales hongos fitopatógenos en postcosecha de frutas y hortalizas. Los hongos congelados (- 84 °C) en una solución de glicerol (20 %), se reactivaron en medio PDA y se incubaron (24± 2 °C) 5 d con luz ambiental. Para estas pruebas se solubilizó 1.6 mg de extracto con 100 μL (16 mg μL^-1) de solvente (alcohol 96°) y se colocaron sobre sensidiscos de papel filtro estéril de 6 mm de diámetro colocado en la parte central de cajas petri con PDA. En sentidos opuestos, se colocó un disco de 5 mm de PDA con micelio del hongo fitopatógeno. La incubación se realizó a 25 °C por 10 d. Las pruebas se realizaron por triplicado y por cada especie. El diámetro de las colonias fue observado y medido. Halos de inhibición, velocidad de crecimiento (diámetro de la colonia), la muerte o inhibición del hongo, fueron evaluados.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento y purificación de hongos

Alrededor de 50 hongos fueron aislados e identificar, de los cuales 35 se identificaron a nivel de género con las claves taxonómicas de Barnett y Hunter (1998). Algunos géneros de hongos (anamórficos) identificados fueron Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Helminthosporium, Alternaria, Bipolaris, Cladosporium, Colletotrichum, Gloeosporium, Fusarium, Phoma y Rhizopus; y una levadura (Sporobolomyces), entre otros. También, se identificaron algunos pseudohongos (Phytophthora), ascomicetes y basidiomicetes; los últimos de difícil identificación. Dentro de los organismos aislados e identificados, se observó una inhibición del crecimiento Sporobolomyces sp. y un basidiomicete no identificado (Figura 1A, B) y en otros, una producción de pigmento rojo-púrpura (Phoma herbarum Westend.y Gibberella sp.) (Figura 1C).

De los hongos identificados, con potencial para ser usados como agentes de control biológico, se descartó a Sporobolomyces sp. porque algunas de sus especies son patógenas al ser humano (Barnett y Hunter, 1998) y el basidiomiceto no creció en medio artificial. Así, se seleccionó un hongo saprófito (Gibberella sp.) recolectado de material vegetal muerto en descomposición, el cual no produjo esporas en condiciones ambientales (23 ±2 °C), pero sí un pigmento rojo-púrpura o amarillo-rosáceo de mayor intensidad en medio sólido que P. herbarum (Figura 2). Para favorecer la producción de esporas, las colonias se pusieron bajo luz negra y UV, como lo indican Snyder y Hansen (1947), Zachariah et al. (1956) y von Arx (1981). La identificación reveló que era Fusarium sp. La producción del pigmento comenzó a los 5 d y se encontró principalmente en el micelio inmerso en el medio de cultivo (Figura 3). La producción de pigmentos rojo púrpura o carmín es típica en las especies de Fusarium de la sección Discolor, como F. reticulatum Mont. [W&R, G], F. sambucinum Fuckel [W&R, G, B, J], F. culmorum (W G. Smith) Sacc. [W&R, G, G, B, J], F. crookwellense Burgess, Nelson & Toussoun, además de F. graminearum (Nelson et al., 1983). En otras especies la coloración puede ser diferente como el F. roseum (Lk.) Emend, Snyder & Hansen, con colonias amarillas a rosadas (Watanabe, 2002).

 

Identificación del hongo productor de pigmentos

La caracterización molecular del hongo por secuenciación (Cuadro 1) de la región intergénica ITS1 del ADN ribosomal y su posterior alineamiento con las bases de datos del Banco de Genes del NCBI, reveló una similitud genética con G. zeae (teleomorfo), cuyo anamorfo es F. graminearum. Las características morfológicas de las colonias y esporas fueron similares con las descripciones de F. graminearum reportadas por Booth (1971) y Nelson et al. (1983). Las colonias en PDA fueron blancas de micelio raso (plano, corto) y denso al principio y de micelio largo (aéreo) algodonoso a mayor edad de la colonia, con márgenes blancos a rojo púrpura. Las macroconidias (27.4 x 2.4 μm) fueron menores a las reportadas por Booth (1971).

Caracterización cultural del hongo y producción de pigmentos

En cultivos sólidos, las colonias variaron en función de la composición del medio (Cuadro 2). En algunos casos el micelio fue raso los primeros días de crecimiento, y aéreo al final; en otros, el micelio fue de lento crecimiento y muy compacto. En medio PDA el color inicial de las colonias fue amarillo a rojo a los 5-6 d. En EMA, la intensidad de los rojos fue mayor. La intensidad del color aumentó con el tiempo de incubación al pasar de rojo a púrpura a los 10 d. El pigmento apareció a los 4 d en algunos tratamientos y a los 9 d en otros. El color de las colonias (amarillo-rojo-púrpura) de F. graminearum varía en función del pH (ácido-alcalino) al cambiar de amarillo a naranja, rojo, púrpura o incluso azul (Sansanya, 2008). El color amarillo de las colonias puede deberse a la producción de toxinas como en Gibberella fujikuroi (Sawada) Ito (Barrero et al., 1991). Además, niveles limitados de nitrógeno, fósforo y cobre en el medio pueden reducir el crecimiento y la producción de los pigmentos (Griffith et al., 2007; Sansanya, 2008). Aunque la mayoría de los hongos crecen bien entre pH 6.8 y 8.3, el intervalo para F. graminearum es 6.7 a 7.2 (Booth, 1971).

En los cultivos líquidos, el desarrollo (producción de micelio) del hongo fue menor que en medios sólidos. En los cultivos líquidos, las colonias en CPD a 20 °C presentaron micelio abundante, compacto y blanquecino. Sólo a pH 6 se observó la presencia del pigmento rojo, en el micelio y sobre las paredes del tubo. En CEM, el micelio tuvo un color pardo rojizo y la biomasa fue como aglomerados. En CCza hubo poco crecimiento micelial, compacto y con pequeñas zonas de micelio blanquecino. A 28 °C y pH 6 en CPD, el micelio desarrolló un color rojo intenso y aglomerados blancos. La presencia del pigmento rojo tuvo mayor intensidad en CEM en las dos condiciones de pH. El micelio fue pardo rojizo y formó aglomerados grandes. En CCza se presentó la misma situación que a 20 °C; hubo poco crecimiento micelial, con aglomerados pequeños y poca o nula producción del pigmento.

El crecimiento y producción de biomasa fueron altamente significativos en medios sólidos y líquidos, para todos los factores estudiados (Cuadro 3). En los medios sólidos, el mayor crecimiento radial fue a 20 °C y pH 6 en PDA, mientras que la mayor producción de micelio (biomasa) fue en PDA y pH 6. La producción de biomasa en medios líquidos fue menor que en los sólidos y la mayor producción fue a 28 °C, pH 8 y en EMA (Cuadro 3).

Extracción, purificación e identificación del pigmento

La mayor extracción del pigmento se obtuvo con alcohol etílico (96°). En la cromatografía la mezcla metanol-hexano (8:2) se usó como solvente. El revelado mostró la presencia de al menos cuatro manchas cuyos valores Rf se compararon con pigmentos conocidos (Cuadro 4) y mostraron que el extracto crudo de F. graminearum está en la gama de colores rojos. La cromatografía en columna (metanol-hexano 8:2) permitió recolectar siete extractos en 60 min con lecturas desde 200 hasta 340 nm del amarillo al rosa claro, similar a lo reportado por Burmeister et al. (1974). Las lecturas observadas podrían indicar que el pigmento extraído es una mezcla de varios pigmentos como en F. solani donde además de la fusarubina, se producen otros pigmentos relacionados a ésta (Ammar et al., 1979). El pigmento de F. graminearum, denominado aurofusarina, se aisló y caracterizó por primera vez de Fusarium culmorum (Wm. G. Sm.) Sacc. (Ashley et al., 1937) y después se mostraron sus propiedades antibióticas contra hongos filamentosos, levaduras y algunas bacterias (Medentsev et al., 1993). Su color varía de amarillo a rojo o púrpura con el aumento del pH y se considera como una toxina por los efectos adversos que causa en la calidad de la carne y huevo de aves cuando los animales se alimentan con granos y cereales contaminados (Dvorska et al. 2001; Dvorska, 2002). El pigmento se deposita en las paredes celulares de tallos y espigas de cereales (Malz et al., 2005). La aurofusarina reduce significativamente las concentraciones de las vitaminas A y E, la proporción de ácido docosahexaenóico en los fosfolípidos, éster de colesterol y las fracciones de ácidos grasos en yemas de huevo de la codorniz japonesa (Dvorska et al. 2001). Con base en lo anterior, es posible que el pigmento producido por F. graminearum (G. zeae) y obtenido en este estudio sea la aurofusarina y es indispensable purificar e identificar el pigmento.

Pruebas de control contra bacterias patógenas y hongos fitopatógenos

Después de 24 h sólo hubo inhibición del crecimiento en S. typhi y S. aureus; éste último mostró la mayor inhibición (Cuadro 5). El pigmento producido por F. graminearum tuvo una actividad antibacteriana en estas dos especies, pero no para las otras probadas, al menos en la concentración usada (16 mg mL^-1). Según Muriuki et al. (2008), 100 /mL del pigmento purificado no afectaron el crecimiento de Bacillus cereus y E. coli, similar a lo reportado por Arnstein et al. (1946) para E. coli con el pigmento de Fusarium javanicum Koord. La actividad antimicrobiana de este pigmento podría asemejarse con la de el pigmento de F. solani ya que también controla a S. aureus, B. subtilis y E. coli en concentraciones de 75 a 100 μg mL^-1 (Ammar et al., 1979). Hubo inhibición de B. subtilis y S. aureus al usar 1 μg mL^-1 del antibiótico producido por Fusarium equiseti (Corda) Sacc. (Burmeister et al., 1974), mientras que Baker et al. (1990) reportaron actividad antibiótica de extractos de F. solani y Fusarium oxysporum Schltdl. Fr. desde 0.25-16.0 μg.mL^-1 contra S. aureus pero no contra E. coli y S. typhy. Así, las concentraciones usadas para controlar estas bacterias son variables y dependen de la especie de Fusarium. La producción de pigmentos (naftoquinonas) es común en los hongos filamentosos (Medentsev y Akimenko, 1998), entre ellos Fusarium, los cuales también pueden tener una actividad antimicrobiana contra hongos y levaduras (Medentsev et al., 1993, 2005).

En los hongos no se observó inhibición en el crecimiento de Colletotrichum spp., lo cual indica que, al menos a la concentración empleada, el extracto no presentó actividad antifúngica. Arnstein et al. (1946) y Lacey (1950) reportaron nula o poca actividad antifúngica de los pigmentos producidos por Fusarium spp., y actividad relativamente baja contra algunas levaduras y hongos filamentosos: Candida spp., Saccharomyces cerevisiae, Penicillium spp., Trichoderma viride Pers. : Fr., Mucor rouxii, Aspergillus spp. (Ammar et al., 1979; Muriuki et al., 2008), y Phytophthora parasitica Breda de Haan (Baker et al., 1990). El pigmento producido por Monascus purpureus Went tiene actividad antifúngica contra T. viride, F. oxysporum, Fusarium roseum Link : Fr., Mucor pusillus (Lindt) Schipper, Aspergillus ochraceus K. Wilh., Aspergillus usamii y Penicillium roqueforti Thom (Ferdes et al., 2009, Ungureanu y Ferdes, 2010).

 

CONCLUSIONES

Una concentración de 16 mg μL^-1 de extracto crudo del pigmento producido por G. zeae (F. graminearum), inhibió el crecimiento de S. typhi y S. aureus, pero no de B. subtilis, Shigella sp., E. coli, C. albicans, C. acutatum, C. fragariae y C. gloeosporioides.

 

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a la Subdirección de Investigación y Postgrado (proyectos 20080167, 20090337, 20100643) y a la Comisión de Operación y Fomento de Actividades Académicas del Instituto Politécnico Nacional por el apoyo económico otorgado.

 

LITERATURA CITADA

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