Biotecnología

 

Polimorfismos de la proteína 15 morfogénica ósea (BMP15) y su relación con el tipo de parto en la oveja Pelibuey

 

Polymorphisms of bone morphogenetic protein 15 (BMP15) and its relation to lambing type in the Pelibuey ewe

 

H. Javier Argüello-Hernández¹, César Cortez-Romero^1,2*, R. Isabel Rojas-Martínez³, O. Lourdes Segura-León⁴, J. Guadalupe Herrera-Haro¹, Juan Salazar-Ortiz^1,5, Jaime Gallegos-Sanchez¹

 

¹ Ganadería. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.

² Campus San Luis Potosí. Colegio de Postgraduados. 78600. Salinas de Hidalgo, San Luis Potosí. (ccortez@colpos.mx)

³Fitopatología. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.

⁴Entomología y Acarología. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.

⁵ Campus Córdoba. Colegio de Postgraduados. 94500. Córdoba, Veracruz.

 

Recibido: abril, 2013.
Aprobado: diciembre, 2013.

 

Resumen

La proteína 15 morfogénica ósea (BMP15), también conocida como factor 9B de crecimiento y diferenciación (GDF9B), es miembro de la superfamilia de factores β de crecimiento (TGFβ) y su expresión en el ovocito es esencial para el desarrollo y crecimiento folicular. Polimorfismos en el gen BMP15 están asociados con el aumento de tasa ovulatoria o prolificidad en algunas razas de ovinos. Los objetivos del presente estudio fueron determinar los polimorfismos FecX^G, FecX^L y FecX^H con una mutación de una sola base (SNP) en el gen BMP15, y estimar la asociación de los tres polimorfismos con el tipo de parto en ovejas Pelibuey. En 253 ovejas Pelibuey adultas en edad reproductiva se tomaron muestras sanguíneas de la vena yugular para determinar los SNPs, de acuerdo con la mejor aptitud de producción probable (MPPA) de prolificidad. Mediante la técnica tetraprimer ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction), se determinaron por primera vez los polimorfismos en las ovejas Pelibuey. De las 253 ovejas se usaron 1050 partos, donde los genotipos homocigoto silvestre (CC) y mutado (TT) del polimorfismo FecX^G con 45% y 43%, respectivamente, y el homocigoto silvestre (GG) y mutado (AA) del polimorfismo FecX^L con 66 % y 29%, respectivamente, se asociaron con un número mayor de partos dobles (p≤0.01). En el polimorfismo FecX^H sólo se encontró el genotipo CC con 52% de parto doble (p≤0.01). En conclusión, los polimorfismos FecX^G y FecX^L del gen BMP15 fueron determinados por primera vez en ovejas Pelibuey, y están asociados con un número mayor de tipo de parto doble.

Palabras clave: polimorfismos, BMP15, ARMS-PCR, secuenciación, tipo de parto, Pelibuey.

 

ABSTRACT

Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15), also known as Growth and Differentiation Factor 9B (GDF9B), is a member of the superfamily of Transforming Growth Factor β (TGFβ) and it expression in the oocyte is essential for follicular development and growth. Polymorphisms in the BMP15 gene are associated to the increase in ovulation rate or prolificacy in some sheep breeds. The objectives of this study were to determine the FecX^G, FecX^L and FecX^H polymorphisms with a mutation of a single base (SNP– single nucleotide polymorphisms) on the BMP15 gene, and to estimate the association of the three polymorphisms with the lambing type in Pelibuey sheep. Blood samples were taken from the jugular vein of 253 adult Pelibuey ewes in reproductive age to determine the SNPs, according to the most probable producing ability (MPPA) in prolificacy. Through the tetraprimer ARMS-PCR technique (Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction), the polymorphisms were determined for the first time in Pelibuey sheep. Of the 253 ewes, 1050 births were used, where the wild (CC) and mutated (TT) homozygous genotypes of polymorphism FecX^G with 45% and 43%, respectively, and the wild (GG) and mutated (AA) homozygous genotype of polymorphism FecX^L with 66% and 29%, respectively, were associated to a higher number of double lambing (p≤0.01). In polymorphism FecX^H only CC genotype was found, with 52% double lambing (p≤0.01). In conclusion, polymorphisms FecX^G and FecX^L of the BMP15 gene were determined for the first time in Pelibuey ewes, and they are associated to a higher number of double lambing.

Keywords: polymorphisms, BMP15, ARMS-PCR, sequentiation, lambing type, Pelibuey.

 

INTRODUCCIÓN

La proteína 15 morfogénica ósea (BMP15, Bone Morphogenetic Protein 15) llamada también factor 9B de crecimiento y diferenciación (FecX o GDF9B, Growth Differentiation Factor 9B), está relacionada estrechamente con el factor 9 de crecimiento y diferenciación (GDF9 o FecG); ambos específicos de la superfamilia TGFβ (Transforming Growth Factor β) y esenciales para la foliculogénesis ovárica temprana en la oveja (McNatty et al., 2006). En ovejas heterocigotas aumenta la tasa de ovulación, pero las homocigotas son infértiles debido a un fallo ovárico primario (Hanrahan et al., 2004; Bodin et al., 2007). El receptor de las células de la granulosa que regula la respuesta de BMP15 no está identificado, pero una mutación en el receptor BMP15 en la oveja Boorola es responsable del aumento en la tasa de ovulación (McNatty et al., 2006). El gen BMP15 se ubica en el cromosoma X con una secuencia completa de codificación de 1179 nucleótidos contenidos en dos exones, separados por un intrón de aproximadamente 5.4 Kb (Galloway et al., 2000). Este gen tiene seis mutaciones que afectan la prolificidad: FecX^G y FecX^B (Hanrahan et al., 2004), FecX^H y FecX^I (Galloway et al., 2000), FecX^L (Bodin et al., 2007) y FecX^R (Monteagudo et al., 2009). El sistema de la proteína morfogénica ósea (BMP), al cual pertenece BMP15, tiene una función fundamental en la foliculogénesis modulando la proliferación y diferenciación de las células de la granulosa y de la teca, en respuesta a la estimulación por gonadotropinas. La mutación induce una maduración precoz de los folículos ováricos al aumentar su sensibilidad a la hormona folículo estimulante (FSH). Como consecuencia, en las ovejas portadoras de la mutación se produce la ovulación y luteinización de numerosos folículos maduros de menor tamaño, con una sensibilidad precoz a la LH, lo que conduce a una mayor tasa de ovulación (Galloway et al., 2000; McNatty et al., 2006; Scaramuzzi et al., 2011). Las principales razas de ovejas de pelo son Pelibuey y Black Belly, y son una fuente importante para el abastecimiento de carne en México (Segura et al., 1996; Dickson et al., 2004). Las razas de pelo se han popularizado por su rusticidad, precocidad, fertilidad y adaptación a diferentes situaciones de manejo intensivo o extensivo (González-Reyna et al., 1991). La raza Pelibuey es rústica y con valores de prolificidad de 1.16 a 2.20 (Segura et al., 1996; Dickson et al., 2004). El aumento de la prolificidad es una vía para mejorar la competitividad de la producción, con énfasis en la tasa de ovulación, considerando factores ambientales y genéticos principalmente con la participación de un conjunto de genes de pequeño efecto (poligen) y por la acción de genes mayores con un gran efecto sobre la tasa de ovulación. Así, el gen BMP15 en ovinos aumenta la tasa de ovulación en alrededor de un óvulo extra y el tamaño de la camada en 0.6 corderos por parto. Este gen es conservado y su polimorfismo influye para que los animales sean prolíficos, no prolíficos y de partos simples (McNatty et al., 2006).

En la literatura revisada no se encontraron estudios sobre genes relacionados con tasa ovulatoria y prolificidad en ovinos Pelibuey. Por tanto, la hipótesis del presente estudio fue que los polimorfismos FecX^G, FecX^L y FecX^H del gen BMP15 están presentes y asociados con el tipo de parto en la oveja Pelibuey. Los objetivos fueron determinar los polimorfismos FecX^G, FecX^H y FecX^L con una mutación de una sola base (SNP) en el gen BMP15 y estimar la asociación de los tres polimorfismos con el tipo de parto en ovejas adultas Pelibuey.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Ubicación del estudio

El estudio se realizó con datos de registros de ovejas Pelibuey adultas del Rancho "El Tesoro", ubicado en el km 19.3 de la ciudad de Campeche hacia Edzna, Campeche, a 19° 35’ N y 90° 20’ O, y a una altitud de 15 m (INEGI, 1990).

Características de las ovejas

Los datos son de 253 ovejas adultas con edades de 4 años 5 meses hasta 10 años 9 meses, que presentaron las mejores características fenotípicas y genéticas de la raza Pelibuey, avaladas mediante un registro de la AMCO (Asociación Mexicana de Criadores de Ovinos) y de acuerdo al análisis de la mejor aptitud de producción probable (MPPA) en prolificidad.

Mejor aptitud de producción probable (MPPA)

La MPPA se usó para evaluar la prolificidad de las 253 ovejas en relación al tamaño de la camada y al número de camadas de la observación individual, comparadas con las del rebaño seleccionado (Herrera et al., 2003), basada en la productividad del quinto al décimo parto por oveja, para un total de 1050 partos.

Recolección y conservación de muestras

Las muestras sanguíneas se recolectaron de la vena yugular de 253 ovejas usando tubos vacutainer de tapa lila (Vacutainer, Hemogar^®, EE.UU.) con anticoagulante K2 ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Los tubos se almacenaron a 4 °C para su uso posterior.

Preparación de las muestras para PCR

Extracción de ADN para los polimorfismos

Para determinar los polimorfismos del gen BMP15, se realizó la extracción de ADN de las 253 muestras sanguíneas usando las instrucciones del fabricante con el kit QIAGEN (QIAamp^® DNA Blood, catálogos 51104 y 51106; QIAGEN^®, Alemania).

Extracción de ADN para los exones

Para verificar la presencia de los polimorfismos en el exón 1 o 2, se realizó la extracción de ADN en cinco muestras sanguíneas de ovejas prolíficas y cinco no prolíficas, seleccionadas del análisis del MPPA de las 253 ovejas, según la metodología descrita por Reineke et al. (1998).

Procedimiento de la PCR para la determinación de los polimorfismos

La amplificación de los polimorfismos FecX^G, FecX^H y FecX^L del gen BMP15 se realizó con la técnica tetraprimer-ARMS (Sistema de Amplificación Refractario de Mutaciones)-PCR descrita por Ye et al. (2001). Se usaron dos pares de cebadores (Polley et al., 2009) para cada polimorfismo (Cuadro 1).

La técnica ARMS-PCR se realizó con 25 µL de reacción preparada con 2.5 µL de MgCl₂ (30 mM); 2.5 µL de amortiguador de reacción 10X (KCl 500 mM, Tris-HCl pH 8.3 100 mM, gelatina 100 µg m^-1, Tritón 1%, 1.5 mg mL^-1, BSA; Bio TecMol^®, México); 1 µL de mezcla de dNTPs (sales de sodio de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, cada uno a 10 mM en agua a pH 7.5; Promega^®, EE. UU.); 1.5 µL de cada cebador (10 pmol µL^-1); 1.5 µL de enzima ADN polimerasa (amplificasa; 5 U, unidades µL^-1; amplificasa^®); 1 µL de agua esteril (agua inyectable, PiSA^®, México) y 10 µL de ADN (aproximadamente una media de 140 ng). Las condiciones de amplificación para cada polimorfismo fueron las siguientes: una desnaturalización a 94 °C por 4 min, seguido de 32 ciclos (desnaturalización a 94 °C por 30 s, alineamiento: FecX^G, 56 °C por 30 s; FecX^H, 58 °C por 30 s o FecX^L, 55 °C por 30 s, y extensión a 72 °C por 30 s), y una extensión final de 72 °C por 7 min, en un termociclador (Tc-512; Techne^®). El producto amplificado por ARMS-PCR para cada polimorfismo fue: FecX^G homocigoto silvestre CC (-/-; 102 pb), mutado TT (+/+; 112 pb), y heterocigoto CT o TC (-/+ o +/-; 102 pb y 112 pb) (Hanrahan et al., 2004); FecX^H homocigoto silvestre CC (-/-; 203 pb), mutado TT (+/+; 248 pb) y heterocigoto CT o TC (-/+ o +/-; 203 pb y 248 pb) (Galloway et al., 2000). Por último, FecX^L homocigoto silvestre GG (-/-; 252 pb), mutado AA (+/+; 204 pb) y heterocigoto GA o AG (-/+ o +/-; 252 pb y 204 pb) (Bodin et al. (2007). Luego se verificó el producto amplificado por PCR de las muestras en una cámara vertical (Modelo MVG-216-33; C.B.S Scientific CO^®, EE. UU.) usando gel de poliacrilamida al 8% (22 mL de poliacrilamida; acrilamida-bisacrilamida 29:1, p/p, al 40% p/v), 11 mL de amortiguador TBE 10X (Tris Borato-EDTA), 77 mL de agua destilada estéril, 65 µL de TEMED (N, N, N’, N’-Tetramethylethylenediamine; SIGMA^®, EE. UU.) y 440 µL al 25% de (persulfato de amonio, p/v; SIGMA^®, EE. UU.). En cada pozo se depositó un volumen final de 3 µL: 2 µL de producto de PCR y 1 µL del amortiguador de carga II usando como amortiguador de corrida TBE 1X y 1.5 µL del marcador de peso molecular (GeneRuler 1 kb DNA Ladder; Thermo Scientific^®, EE.UU.). Las condiciones de la electroforesis fueron 247 V por 90 min para los tres polimorfismos. Finalizada la electroforesis, los resultados fueron evaluados en tres pasos: 1) tinción y lavado del gel, con ácido acético glacial al 10% en agitación por 25 min, seguido por inmersión en agua destilada por 6 min; por último, inmersión en solución de tinción (1 g AgNO₃; 1.5 mL formaldehído en un 1 L de agua destilada) por 30 min; 2) revelado de los polimorfismos, se usó solución reveladora (dilución de 60 g de Na₂CO₃ en 2 L de agua destilada) mantenida en refrigeración a 6 °C y, antes de usarse, se agregaron 3 mL al 37% de formaldehído y 400 µL a 10 mg m^-1 de tío-sulfato de sodio (modificado de Sambrook et al., 1994); 3) foto-documentación, se usó el programa Digital Science 1D V.2.0.3. (Kodak^®) y un transiluminador de luz blanca (TLW-20; UVP^®, EE. UU.) para usar en el análisis de las frecuencias.

Procedimiento de la PCR para la identificación de los exones 1 y 2

Para la amplificación del exón 1 (AF236078) y el exón 2 (AF236079) del gen BMP15 (Hanrahan et al., 2004), se usó la técnica de PCR punto final. Cada exón empleó un par diferente de cebadores (Cuadro 2).

La reacción usada de 25 µL se preparó con 2.5 µL de MgCl₂ (30 mM); 2.5 µL de amortiguador de reacción 10X, KCl 500 mM, Tris-HCl pH 8.3 100 mM, gelatina 100 µg m^-1, Triton 1%, 1.5 mg mL^-1 BSA; Bio TecMol^®, México); 1 µL de dNTPs (sales de sodio de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, cada uno a 10 mM en agua a pH 7.5; Promega^®, EE.UU.); 1.5 µL de cada cebador (10 pmol µL^-1); 1.5 µL de enzima ADN polimerasa (amplificasa, 5 U, unidades µL^-1; amplificasa^®, México); 1 µL de agua estéril (agua inyectable, PiSA^®, México); y 13 µL de ADN (aproximadamente con media de 140 ng). Las condiciones del ciclo térmico para cada exón fueron: 1) exón 1, desnaturalización a 94 °C por 4 min, luego 30 ciclos (desnaturalización a 94 °C por 1 min, alineamiento: exón 1, 56 °C por 50 s; 2) exón 2, 58 °C por 50 s, y extensión a 72 °C por 1 min 30 s, y una extensión final de 72 °C por 7 min. El producto amplificado por PCR para el exón 1 (325 pb) y exón 2 (857 pb) se verificó en gel de agarosa al 1.4% (1.4 g de agarosa y 100 mL de buffer TBE 1X; Tris Borato-EDTA) por medio de una electroforesis (Sambrook et al., 1994), en una cámara modelo horizon 58 (cámara de electroforesis; Life Technologies^®). En cada pozo se depositó un volumen final 18 µL (4 μL del amortiguador de carga II y 14 µL de producto de PCR) usando como amortiguador de corrida TBE 1X. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio a una concentración final de 1 µg mL^-1 durante 30 min y 1.5 µL de marcador de peso molecular (GeneRuler 1 kb DNA Ladder; Thermo Scientific^®, EE. UU.). Las condiciones de electroforesis fueron 88 V por 105 min para el exón 1 y de 50 min para el exón 2. Los resultados se evaluaron en el fotodocumentador Modelo Gel Doc 2000 (Bio Rad^®) de luz ultravioleta y las imágenes se capturaron por computadora (Quantityone one; Bio Rad^®) para identificar los productos a purificar, según las instrucciones del kit QIAGEN (MinElute Gel Extraction Kit; QIAGEN^®, Alemania), las cuales se enviaron a la empresa MICRO GEN^® (Corea) para su secuenciación. Cada muestra se verificó visualmente para eliminar falsos positivos.

Secuenciación de los exones

La secuenciación del producto de PCR purificado de los exones 1 y 2 se realizó según las especificaciones de la empresa (MICROGEN INC^®, Corea): se colocaron 10 µL del producto purificado en tubos Eppendorf de 1.5 mL, para obtener una buena lectura de las secuencias usadas para identificar las mutaciones FecX^G, FecX^L y FecX^H.

Análisis estadístico de frecuencias

Para determinar los polimorfismos FecX^G, FecX^L y FecX^H se evaluaron las frecuencias genotípicas y alélicas de las 253 ovejas muestreadas. Después de asignar el genotipo de cada oveja, se estimó mediante la prueba de ajuste del equilibrio de Hardy-Weinberg para las frecuencias genotípicas y las frecuencias alélicas (Crow, 1999), comparándose mediante la prueba de Ji cuadrada.

Análisis estadístico de la distribución de los partos asociada a los polimorfismos

La asociación de las frecuencias genotípicas de cada polimorfismo con la distribución del tipo de parto de las 253 ovejas con los 1050 partos, se estimó mediante la prueba de ajuste del equilibrio de Hardy-Weinberg (Crow, 1999), comparándose mediante la prueba de Ji cuadrada.

Análisis de secuencias

El análisis genómico de las secuencias obtenidas en las cinco ovejas prolíficas y cinco no prolíficas, se realizó con el programa MEGA 5.05 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis 5.05; Mega^®) para buscar los polimorfismos en los exones. Un alineamiento (ClustalW 1.6) se realizó para ubicar los polimorfismos entre las secuencias obtenidas, y después se realizó otro alineamiento de las secuencias obtenidas de las ovejas Pelibuey con las secuencias del gen BMP15 de otros ovinos reportadas en el banco de genes (número de acceso AF236078, AF236079 y AF268477).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Estimación de las frecuencias genotípicas y alélicas de los polimorfismos del gen BMP15

Las frecuencias genotípicas y alélicas de los polimorfismos FecX^G, FecX^L y FecX^H evaluadas individualmente en 253 ovejas adultas Pelibuey, fueron registradas. Las frecuencias genotípicas del polimorfismo FecX^G fueron similares entre genotipos homocigotos mutado TT (0.43; +/+, 112 pb) y silvestre CC (0.45; -/-, 102 pb). Pero hubo una gran diferencia entre los homocigotos TT y CC en comparación con el heterocigoto (0.12) TC (+/-; 112 pb) o CT (-/+; 102 pb) (p≤0.01). Las frecuencias alélicas fueron similares en el genotipo TT y CC (p>0.05) (Cuadro 3; Figura 1). En cambio, las frecuencias genotípicas del polimorfismo FecX^L fueron diferentes entre homocigoto mutado AA (0.29; +/+, 204 pb), homocigoto silvestre GG (0.66; -/-, 252 pb) y heterocigoto (0.05) GA (-/+, 252 pb) o AG (+/-, 204 pb). Se observó la relevancia del homocigoto silvestre GG (p≤0.01). Las frecuencias alélicas fueron distintas entre genotipo AA y GG (p≤0.01) (Cuadro 3, Figura 1). Para el polimorfismo FecX^H no se reporta la distribución de las frecuencias genotípicas y alélicas, ya que sólo se presentó el homocigoto silvestre CC (-/-; 203 pb) (Figura 1).

En este estudio se determinaron por primera vez los polimorfismos FecX^G y FecX^L en ovejas adultas Pelibuey, polimorfismos reportados en las razas de lana Lacaune, Belclare y Cambridge (Davis et al., 2006; Bodin et al., 2007). Sin embargo, el polimorfismo FecX^G no se identificó en la raza de lana iraní Baluchi (Moradband et al., 2011) ni en la raza Cele Black (Hongcai et al., 2010); ni tampoco el polimorfismo FecX^H en la raza tunisina Barbarina (Borni et al., 2011). Similar a lo reportado por estos dos últimos autores, en este estudio con la raza Pelibuey, no se encontró la mutación en el polimorfismo FecX^H, la cual afecta la tasa de ovulación y fertilidad descrita en la raza Romney (Galloway et al., 2000).

Distribución de los partos asociada a los polimorfismos

La MPPA en las 253 ovejas Pelibuey fue comparada con la frecuencia genotípica de cada polimorfismo. La asociación de la distribución de los partos con las frecuencias genotípicas del polimorfismo FecX^G, fue similar en el genotipo TT y genotipo CC, pero hubo una gran diferencia entre los homocigotos TT y CC en comparación con el heterocigoto TC o CT (p≤0.01) (Cuadro 4). La distribución de los 1050 partos fue 2% para parto triple, 52% en parto doble y 46% en parto simple. El parto doble fue el tipo de parto con mayor porcentaje dentro de cada genotipo: el genotipo homocigoto mutado fue 52% de 452 partos, el genotipo heterocigoto fue 52% de 126 partos y el homocigoto silvestre 51% de 472 partos (p≤0.01) (Cuadro 4).

En cambio, la asociación de la distribución de los partos con las frecuencias genotípicas del polimorfismo FecX^L fue diferente en el genotipo AA, genotipo GG y genotipo TC o CT (p≤0.01). La distribución de los 1050 partos fue 2% parto triple, 46% parto simple y 51% partos dobles. El parto doble fue el tipo de parto con mayor porcentaje dentro de cada genotipo: el genotipo homocigoto mutado fue 51% de 304 partos, el genotipo heterocigoto fue 52 % de 52 partos y el homocigoto silvestre 51 % de 694 partos (p≤0.01) (Cuadro 5).

Para el último polimorfismo FecX^H no se estimaron las frecuencias, ya que sólo presentó el genotipo homocigoto silvestre CC (-/-; 203 pb) de 1050 partos: 486 partos simples (46%), 539 partos dobles (52 %) y 25 partos triples (2%) (p≤0.01). La asociación de la distribución de los partos con las frecuencias alélicas para el polimorfismo FecX^G fue similar en el genotipo TT (0.49; 514 partos) y genotipo CC (0.51; 536 partos); para el polimorfismo FecX^L, fue diferente en el genotipo AA (0.31; 326 partos) y genotipo GG (0.69; 724 partos) (p≤0.01).

Las mutaciones FecX^G, FecX^L y FecX^H muestran un comportamiento similar en tasa de ovulación y prolifcidad de acuerdo al genotipo; es decir, el homocigoto mutado es estéril con ovarios hipoplásicos, en las razas de lana Cambridge, Belclare, Lacaune y Romney (Galloway et al., 2000; Davis et al., 2006; Bodin et al., 2007). Pero el genotipo homocigoto mutado en ovejas adultas Pelibuey es fértil para el polimorfismo FecX^G y para el FecX^L, con 43 y 29% del total de partos, respectivamente. Además, el análisis de las frecuencias genotípicas en la determinación de los polimorfismos FecX^G y FecX^L, muestra una diferencia significativa de partos dobles, 52 y 51% para los homocigotos mutados TT y AA (X², p≤0.01). Esto se puede explicar, según Scaramuzzi et al. (2011), probablemente porque el gen BMP15 esté involucrado en un complejo con otros genes de la misma familia, como el GDF9 de la tasa de ovulación en las razas Belclare y Cambridge (Hanrahan et al., 2004) y tiene un comportamiento similar al BMP15 (McNatty et al., 2006); muestra un incremento de tasa ovulatoria para heterocigotos, mientras que para homocigotos mutados hay esterilidad con ovarios disfuncionales, pero principalmente al receptor 1B de la BMPR1B. Éste contrasta con BMP15 y GDF9, ya que el genotipo homocigoto mutante presenta una mayor ovulación, 5-9 folículos, en comparación con 1-2 del genotipo homocigoto silvestre. Esta fertilidad en los homocigotos mutados de la raza Pelibuey, similar al BMPR-1B, se puede deber probablemente a que el homocigoto mutante del BMP15 afecta el desarrollo temprano del ovocito, debido a la respuesta precoz del folículo y de las células de la granulosa a la FSH y LH, que provoca la ovulación y luteinización de numerosos folículos maduros de menor tamaño por la sensibilidad precoz a la LH, dando como resultado, una mayor tasa de ovulación (McNatty et al., 2006; Scaramuzzi et al., 2011). La respuesta favorable en este estudio con los homocigotos mutados para FecX^G y FecX^L al no mostrar esterilidad, se podría deber también a la selección realizada por el productor del rebaño, considerando sólo las ovejas más prolíficas, partos dobles para el pie de cría. En un estudio en el mismo rebaño de ovejas Pelibuey, De Lucas et al. (2012) reportan un índice de prolificidad promedio de 1.77, con 1.40 al primer parto; 1.67 a los 2 a 4 años; 1.75, a los 5 a 7 años; y 1.8 de los 8 a 10 años; valores relativamente cercanos a dos corderos por parto.

Los resultados en este estudio muestran una frecuencia significativa en los partos dobles para los homocigotos silvestres y mutados, y para los heterocigotos (X², p≤0.01). Esta tendencia para obtener más partos dobles, en contraste con partos triples, es conveniente y deseable para el productor (Laviña, 2012), porque las ovejas soportan fisiológica y anatómicamente, criar dos corderos. En ovejas Aragonesa, con la distribución de partos para el polimorfismo FecX^R del gen BMP15, el genotipo heterocigoto presentó un mayor porcentaje en partos triples (Laviña, 2012). Por el contrario, en este estudio, para el polimorfismo FecX^G y para FecX^L, los genotipos heterocigotos CT o TC y GA o AG presentaron 2% de partos triples en 452 partos (p≤0.01) y 2% en 52 partos (p≤0.01). En el caso del gen GDF9, para el índice de prolificidad con el polimorfismo FecX^G en la raza Small Tailed (Chu et al., 2006) hay un aumento de 0.55 para genotipos heterocigotos; en cambio, los homocigotos mutados (TT) son estériles. Un genotipo homocigoto mutado puede indicar esterilidad en razas Romney, Belclare, Lacaune y Cambridge (Davis et al., 2006; Bodin et al., 2007), pero no necesariamente en otras razas. Así, en el genotipo mutado Fec^SI en la raza Santa Inés para el gen GDF9 (Silva et al., 2010), es posible que esta mutación no produzca un efecto drástico en la disminución de la actividad de la proteína madura, lo cual permite que en ovejas homocigotas E/E no exista una pérdida total de la acción del GDF9. Esta situación podría suceder con el gen BMP15 en la oveja Pelibuey, en la cual el efecto de los polimorfismos con el genotipo homocigoto mutado del gen BMP15 no causa esterilidad como en otras razas evaluadas.

Evaluación de las secuencias

El análisis de la secuencias es importante en estudios moleculares para mutaciones puntuales. En la presente investigación, los resultados con el análisis y alineamiento de las secuencias del exón 1 y exón 2 representados en los electroferogramas o gráficas de alineación de secuencias, no mostraron variación de la base nucleotídica en la posición, donde los tres polimorfismos presentan las mutaciones mencionadas (FecX^G, Figura 2; FecX^L, Figura 3; FecX^H, Figura 4). No obstante, el alineamiento de las secuencias permitió confirmar la ubicación de las mutaciones de los polimorfismos, FecX^G, FecX^L y FecX^H, en el exón 2. La falta de claridad en los electroferogramas por suposición de líneas, como lo ocurrido en el estudio de la secuencias del Pelibuey, puedo deberse a la insuficiente cantidad de ADN causando una señal demasiado baja o a la contaminación del ADN por algún cebador mal purificado o degradado.

 

CONCLUSIONES

Los polimorfismos FecX^G y FecX^L del gen BMP15 fueron determinados por primera vez en la oveja Pelibuey. De los 1050 partos de las 253 ovejas muestreadas, sólo los genotipos homocigotos de dichos polimorfismos se relacionaron con el mayor número de corderos en las ovejas Pelibuey, por tener un mayor número de tipo de parto doble, dado que el genotipo heterocigoto tuvo poca influencia en la variable tipo de parto o prolificidad. Esto probablemente se debe al criterio de selección del productor en el área de estudio, quien usa como pie de cría las hembras más prolíficas, de partos dobles. En cambio, para el polimorfismo Fecx^H sólo se presentó el genotipo homocigotosilvestre. El número de ovejas prolíficas estudiadas fue limitado, por lo que para confirmar el efecto de los homocigotos TT y CC asociados a un número mayor de hembras de otras regiones del país con registros de partos, usar el análisis de MPPA, buscar mutaciones en otros genes con efecto en la variable tipo de parto o prolificidad, estudiar la sensibilidad del folículo y las células de la granulosa a la FSH y LH en hembras portadoras y no portadoras de la mutación.

 

AGRADECIMIENTOS

El primer autor recibió apoyo económico para sus estudios de postgrado del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). Este estudio se realizó en el laboratorio de Fisiología de la Interacción Planta Patógeno -Vector- del área de Fitopatología y fue financiado con recursos provenientes de los campus San Luis Potosí y Montecillo, del Fideicomiso para la Investigación Científica y Desarrollo Tecnológico del Colegio de Postgraduados (Modalidad financiamiento a proyectos de investigación de tesis 2011) y de la Línea Prioritaria de Investigación LPI-5 (Biotecnología Microbiana, Vegetal y Animal).

 

LITERATURA CITADA

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