Introducción
El ácido linoleico conjugado (CLA) es el nombre genérico para una serie de isómeros posicionales (7,9; 8,10; 9,11; 10,12 y 11,13) y geométricos (cis o trans) del ácido linoleico (AL; C18:2 c9c12) con dobles enlaces conjugados (Bauman et al., 1999). El isómero mayoritario del CLA es el ácido ruménico (AR; C18:2 c9t11) que representa de 75 a 90 % del total de isómeros del CLA en la leche (Bauman et al., 2006). El AR es un intermediario de la biohidrogenación ruminal del AL, de donde también deriva el ácido vaccénico (AV; C18:1 t11), el cual se usa como sustrato en la síntesis de novo en la glándula mamaria por acción de la enzima delta9 desaturasa para la producción de AR (Bauman et al., 1999; Sun y Gibbs, 2012). El AR se asocia con la reducción de cáncer inducido y con la supresión de la aterosclerosis en animales de laboratorio (Ip et al., 1999).
Un desafío de la investigación es incrementar esos ácidos grasos (AG) en la leche porque es el alimento más consumido en el mundo (FAO, 2015). Además, los productos lácteos son la principal fuente de CLA en la dieta humana y su concentración en esos productos está en función de la concentración de CLA en la grasa de la leche (Parodi, 1999).
Hay una relación positiva entre el consumo de forraje y el contenido de AG insaturados (AGI) en la leche, principalmente de AR y AV (Bargo et al., 2006; Morales-Almaráz et al., 2010; Castro-Hernández et al., 2014). Además de cubrir parte de los requerimientos energéticos de las vacas, la inclusión de lípidos de origen vegetal en la dieta de las vacas incrementa la producción de CLA y su secreción en leche (Loor y Herbein, 2003). Chilliard et al. (2000) y Bauman et al. (1999) indican que la concentración de AR y AV en la grasa de la leche puede aumentar al suministrar aceite insaturado con alto contenido de LA. La naturaleza química de los lípidos insaturados suministrados también podría afectar el proceso de biohidrogenación (Loor y Herbein, 2003). La acumulación in vitro de AV y AR fue más baja cuando el AL enlazado al triglicérido fue el sustrato, comparado con el AG libre (Noble et al., 1974). Según Huang et al. (2008), el suministro de aceite de soya al 5 % sobre base seca (BS) en la dieta de vacas en lactancia es más efectivo para aumentar el contenido de CLA en leche que un suplemento de CLA en la misma dieta. La adición de 5 % BS de aceite de soya a vacas Holstein estabuladas no afectó la concentración de AG volátiles en rumen, el consumo de alimento, el rendimiento de leche, ni el contenido de proteína y de lactosa en leche, pero sí disminuyó el contenido de grasa en la leche (Huang et al., 2008).
La adición de lípidos en la dieta con vacas lecheras estabuladas se ha estudiado, pero hay pocos experimentos (Rego et al., 2005) acerca de proporcionar suplementos ricos de AGI como estrategia para mejorar el perfil de AG con vacas en pastoreo. Rego et al. (2005) reportan un incremento de AGI en la grasa de la leche y con un suplemento de 0.5 kg d-1 de aceites vegetales aumenta 61 % el contenido de CLA en la leche de vacas en pastoreo sin reducir el rendimiento de leche. Según Schroeder et al. (2004), la inclusión de AGI en la dieta de vacas lecheras en pastoreo causa un efecto significativo sobre el contenido de grasa en leche. Por lo tanto, el objetivo de nuestro estudio fue adicionar niveles altos de aceite de soya, rico en AL, a vacas Holstein en pastoreo, con un aporte alto de ácido linolénico (ALN; C18:3 c9c12c15) en el forraje consumido, para evaluar la producción y secreción de AR y AV en leche de vacas Holstein.
Materiales y Métodos
El estudio se realizó en el verano, junio-agosto de 2014, en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma del Estado de México, localizada en Cerrillo Piedras Blancas a 19° 24’ 48’’ N y 99° 40’ 45’’ O y a una altitud de 2632 m. La temperatura promedio de la época fue 15.7 °C, con una precipitación pluvial anual de 884.7 mm (SMN, 2014).
Animales, dieta y tratamientos
En este estudio se utilizaron seis vacas Holstein multíparas, con un peso vivo promedio de 602±45 kg, una producción diaria promedio de 23.0±2.9 kg de leche y 220±54 d en lactancia. Las vacas se distribuyeron aleatoriamente en un cuadro latino repetido 3×3 con tres periodos experimentales de 21 d cada uno, 16 d de adaptación y 5 d de medición. Las vacas se manejaron de acuerdo con el reglamento interno de bioética y bienestar de la Universidad con fundamento en las normativas oficiales (NOM-062-ZOO-1999; NOM-051-ZOO-1995). La alimentación de las vacas consistió en pastoreo (12 h) y el suministro, en el establo, de una TMR parcial (pTMR; Cuadro 1) formulada para cubrir los requerimientos de las vacas en lactancia (NRC, 2001).
† pTMR-0: dieta completa mezclada sin aceite de soya; pTMR-3: dieta completa mezclada con 3 % de aceite de soya; pTMR-6: dieta completa mezclada con 6 % de aceite de soya. ¶ Multitec, lechero bovino®: vitamina A: 231 UI; vitamina D3: 58.5 UI: vitamina E: 566 mg; Cu 400 mg; Fe: 2,560 mg; Mn: 1,860 mg; Co: 5.85 mg; I 19.84 mg; Zn: 16 mg; Se: 12 mg; P: 38,220 mg; Mg: 39,959.92 mg; carbonato de Ca: 194 g; sal: 236.621 g; bicarbonato de Na: 150 g; Na: 1,851.60 mg; K: 2,439 mg.
Al término del periodo de adaptación, los siguientes tratamientos se asignaron aleatoriamente a las vacas: 1) dieta completa mezclada sin aceite de soya (pTMR-0), 2) dieta completa mezclada con 3 % de aceite de soya (pTMR-3) y, 3) dieta completa mezclada con 6 % de aceite de soya (pTMR-6).
El pastoreo fue rotacional en praderas polífitas, compuestas principalmente por festuca (Festuca arundinacea), pasto ovillo (Dactylis glomerata), ballico (Lolium perenne), pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum) y trébol blanco (Trifolium repens), fertilizadas con 50 kg ha-1 de urea cada mes.
En el establo, las vacas se alojaron en corrales (3.50×4.50 m) individuales provistos de comederos y bebederos, con disponibilidad ad libitum de agua. El ordeño fue automatizado a las 06:00 y 15:00 h.
Desarrollo del experimento
Las vacas permanecieron 12 h en la pradera (07:00-15:00 y 16:00-20:00 h), respetando el tiempo de ordeño. El resto del tiempo permanecieron en el establo, donde se suministró la pTMR a libre acceso según el tratamiento asignado.
Con un cerco eléctrico se asignaron 22 kg MS d-1 por vaca en la pradera, dos terceras partes se ofrecieron entre ordeños y el resto después del ordeño de la tarde. La producción de forraje en la pradera se determinó cada día mediante el corte a ras de suelo de 2 m2 distribuidos aleatoriamente en ocho puntos y se usó un cuadrante de 0.25 m2. Después se determinó la MS por secado de la muestra en horno de microondas (Teuber et al., 2007).
El aceite de soya se agregó con la porción del concentrado (cereales y oleaginosas) para preparar la pTMR cada tercer día y evitar la rancidez. El ensilado de maíz se incluyó al concentrado una hora antes de que las vacas entraran al establo.
El consumo diario de pTMR se midió en cada vaca por diferencia de la oferta y el rechazo. El consumo de forraje se estimó por diferencia entre los requerimientos de energía neta (EN) para lactancia (ENL, Mcal d-1) de la vaca menos la ENL consumida con la pTMR, según el método descrito por Macoon et al. (2003). La EN de lactancia de las pTMR se calculó con las ecuaciones descritas por Menke y Steingass (1988) a partir del contenido de fibra ácido detergente. Las necesidades de ENL se estimaron con las ecuaciones de predicción del NRC (2001) incluyendo los requerimientos de EN para lactancia, mantenimiento, cambio de peso corporal, actividad en el pastoreo y desplazamiento hacia o desde la pradera al establo. Al inicio y al final de la etapa de medición las vacas se pesaron después de la ordeña de la mañana.
En la etapa de medición de cada periodo, se muestreó en tres días consecutivos la pTMR de cada tratamiento al momento de ofrecerla, y el forraje de la pradera, según la técnica de pastoreo simulado descrita por Wayne (1964). Las muestras se conservaron en congelación (-4°C) hasta su análisis.
Cada día se registró la producción de leche individual en ambos ordeños. La leche se muestreó en cada ordeño y se obtuvo una alícuota (100 mL) por vaca para análisis en el laboratorio.
Análisis de laboratorio
Las muestras de los alimentos (pTMR y forraje) se secaron en estufa de aire forzado a 60 °C por 24 h, se molieron con malla de 2 mm y se determinó el contenido de materia seca y cenizas por pérdida de peso tras desecación de la muestra a 100±1 °C en estufa de aire forzado durante 24 h, seguida de la incineración en la mufla a 600 °C por 4 h. El contenido de proteína bruta se determinó por el método Kjeldalh y el contenido extracto etéreo (EE) se determinó según la AOAC (2012). El análisis de fibra detergente ácido (FDA), fibra detergente neutro (FDN) y lignina detergente ácido (LDA) se realizó con el método descrito por Van Soest et al. (1991).
El contenido de AG de los alimentos se determinó previa liofilización de las muestras (LABCONCO, Free Zone 2.5), mediante la técnica de Sukhija y Palmquist (1988), con modificaciones de Palmquist and Jenkins (2003), utilizando ácido clorhídrico metanólico al 10 % para la esterificación y hexano como solvente orgánico.
El contenido de grasa, proteína y lactosa de la leche se determinó con un analizador Lactoscan (Milkotronic, LTD). Para el análisis de AG en leche se extrajo la grasa por ultracentrifugación (Feng et al., 2004); la metilación se realizó de acuerdo con la metodología descrita por Christie (1982), con modificaciones de Chouinard et al. (1999).
Los metil ésteres de los AG de alimentos y leche se separaron y cuantificaron por cromatografía de gases (Perkin Elmer Clarus 500), con una columna capilar de 100 m×0.25 mm×0.2 µm (SUPELCO TM-2560), utilizando nitrógeno como gas acarreador. Tanto el detector como el inyector se mantuvieron a 260 °C, la temperatura inicial del horno fue 140 °C por 5 min, aumentando 4 °C por minuto hasta llegar a 240 °C. Cada pico se identificó de acuerdo con los tiempos de retención de estándares de ésteres metílicos (Supelco 37 Component FAME Mix, trans-vaccenic acid y linoleic acid conjugated de SIGMA-ALDRICH). Los AG se registran en g 100 g-1 del total de AG.
Análisis estadístico
La composición química de las pTMR fue analizada con el procedimiento GLM de SAS (1999). Los resultados de consumo de MS, producción, composición y perfil de AG en la leche se analizaron con el procedimiento MIXTO (SAS, 1999), promediados por vaca y periodo, de acuerdo con el modelo de cuadrado latino repetido 3×3:
donde Yijkl: es la respuesta de las variables; µ: la media general; Ci: el efecto aleatorio del i-ésimo cuadro (1, 2); P(i)j: el efecto fijo del periodo (1, 2, 3); A(i)k: el efecto aleatorio del animal (1, 2, 3); Txl: el efecto fijo del tratamiento (1, 2, 3);Eijkl: el error residual.
La significancia fue p≤0.05. Además, se realizaron análisis de polinomios ortogonales para evaluar los efectos lineal y cuadrático para tratamientos.
Resultados y Discusión
Composición química y contenido de ácidos grasos de la dieta
El Cuadro 2 muestra la composición química y el contenido de AG de las pTMR y del forraje que consumieron las vacas. El contenido de EE fue 2.0 y 4.4 % mayor en las dietas pTMR-3 y pTMR-6 comparado con la pTMR-0, por la adición del aceite de soya. Los ácidos AL y ALN representaron 79 % del total de AG; el ALN representó 53 % del total de los AG del forraje fresco consumido por el ganado.
† pTMR-0: dieta completa mezclada sin aceite de soya; pTMR-3: dieta completa mezclada con 3 % de aceite de soya; pTMR-6: dieta completa mezclada con 6 % de aceite de soya. ¶ Valor estimado por la ecuación propuesta por Menke y Steingass (1988). ENL=(9.07-0.0097*FAD (g kg-1 MS). El resultado fue dividido entre 4.184 para obtener Mcal.
Consumo de alimento, producción y composición química de la leche
No hubo diferencia (p>0.05) en el consumo de forraje (2.11 kg MS vaca-1 d-1) (Cuadro 3). Morales-Almaráz et al. (2010) reportan en ganado lechero con 12 h de acceso a la pradera y una disponibilidad de forraje por vaca de 39.7 kg MS d-1 un consumo de forraje de 8.56 kg MS vaca-1 d-1 ofreciendo ad libitum una TMR a base de ensilado de maíz en la estabulación. Castro-Hernández et al. (2014) reportan consumos de forraje de 3.36 y 4.63 kg MS vaca-1 d-1, al suministrar 4.5 y 2.7 kg MS de concentrado a base de cereales más ensilado de maíz ad libitum en estabulación cuando las vacas permanecieron en la pradera 12 h con una asignación de forraje de 25 kg MS d-1. En nuestra investigación no se limitó la oferta de TMR a las vacas en el establo, lo cual redujo el consumo de forraje en la pradera a pesar de permanecer 12 h allí con una asignación de 22 kg MS vaca-1 d-1. Las vacas lecheras en pastoreo aumentan el consumo de forraje en la pradera cuando se restringe el alimento ofertado en el establo (Palladino et al., 2014).
ab Valores medios en una hilera con distinta literal son diferentes estadísticamente (p≤0.05) (n=90). † Tratamientos, pTMR-0: dieta completa mezclada sin aceite de soya; pTMR-3: dieta completa mezclada con 3 % de aceite de soya; pTMR-6: dieta completa mezclada con 6 % de aceite de soya. ¶ EEM: error estándar de la media. § Efectos, L: lineal; Q: cuadrático. Þ CMS: consumo de materia seca. ¤ Estimado por diferencia entre los requerimientos de energía neta para lactancia (ENL) menos la ENL consumida con la pTMR (Macoon et al., 2003).
El consumo de pTMR y la ingesta total de MS disminuyeron linealmente (p≤0.05) al aumentar el contenido de aceite de soya en la dieta. En nuestro estudio, el consumo de TMR tuvo una relación inversa con el contenido de EE en las dietas. Según Chamberlain y Wilkinson (1996), la inclusión de más de 6 % de lípidos insaturados en la dieta puede reducir la actividad microbiana en rumen y se reflejaría en un menor consumo de alimento y menor síntesis de grasa en la leche.
La eficiencia alimenticia (EA=kg leche vaca-1 d-1/consumo total MS d-1) fue mayor para los tratamientos con aceite de soya. La producción de leche en pTMR-3 fue 1.9 y 4.8 % mayor (p≤0.05) que en pTMR-0 y pTMR-6 (Cuadro 3). Una unidad de producción de vacas lecheras en pastoreo puede ser más eficiente cuando se incluye una fuente de lípidos adicional en la dieta. Vacas alimentadas solo a base de pastoreo mostraron una EA de 1.12 (Palladino et al., 2014) y de 0.95 al dar 6.3 kg de concentrado (Roca-Fernández et al., 2012) con una producción de 22.7 y 22.6 kg leche d-1.
Los tratamientos tuvieron un efecto cuadrático (p≤0.05) sobre la producción de leche y su contenido de grasa y proteína; los valores menores se observaron en pTMR-6. La influencia de la dieta sobre el contenido de grasa en la leche depende del contenido de fibra y de los lípidos presentes (Bauman y Griinari, 2001). Según Veira et al. (2001), el contenido de grasa (3.24 vs. 2.6%) y proteína (3.19 vs. 3.18%) disminuye en leche al proporcionar 0 y 3 % de aceite de soya. Esto podría explicarse porque la actividad celulolítica en rumen disminuye al consumir aceite vegetal, lo cual reduce la producción de acetato y la síntesis de AG de cadena corta en la glándula mamaria (Griinari et al., 1998). Además, el consumo de aceites insaturados puede inhibir la síntesis de la grasa de la leche derivado de la producción de AG parcialmente hidrogenados, especificamente AG trans (Griinari et al., 1998). Ambos mecanismos pudieron causar la disminución de grasa en leche.
El contenido de proteína en la leche de las vacas alimentadas con pTMR-6 fue menor, lo cual se puede deber al probable efecto negativo de los AGI sobre los microorganismos del rumen (Buccioni et al., 2012). El exceso de estos ácidos en el rumen puede afectar la actividad de los microorganismos y así reducir la síntesis de proteína microbiana (Chamberlain y Wilkinson, 1996).
Perfil de ácidos grasos en leche
La inclusión de aceite de soya en la dieta de las vacas disminuyó linealmente (p≤0.05) la concentración de AG saturados (AGS) y con ello la relación AGS/AGI, debido principalmente al aumento del contenido de AG monoinsaturados (AGMI) y AG poliinsaturados (AGPI) en la leche (Cuadro 4). De acuerdo con Dewhurst et al. (2006), la inclusión de aceites vegetales en la dieta reduce los AG de cadena corta y media, y aumenta los AG de cadena larga, con una respuesta caracterizada por un cambio hacia C18 a expensas de C16, y una disminución en la proporción de AGS e incremento de AGMI y AGPI en leche. En concordancia, las vacas alimentadas con pTMR-6 y pTMR-3 produjeron una leche nutricionalmente mejor porque tuvieron 26.7 y 9.1 % menos AGS, comparado con pTMR-0. Ulbricht y Southgate (1991) sugieren que los humanos deberían consumir más AGMI y AGPI, y menos AGS, para reducir el riesgo de enfermedad coronaria del corazón.
abValores medios en un renglón con distinta literal son diferentes estadísticamente (p≤0.05) (n=18). † Tratamientos, pTMR-0: dieta completa mezclada sin aceite de soya; pTMR-3: dieta completa mezclada con 3 % de aceite de soya; pTMR-6: dieta completa mezclada con 6 % de aceite de soya. ¶ EEM: error estándar de la media. § L: lineal; Q: cuadrático. Þ Categoría, AGS: ácidos grasos saturados; AGMI: ácidos grasos monoinsaturados; AGPI: ácidos grasos poliinsaturados; AGI: ácidos grasos insaturados.
El contenido de AG de cadena corta (C4, C6, C8, C10) y media (C11, C12, C13, C14, C15, C16 y C17) fue menor en la leche de las vacas que consumieron la dieta con 6 % de aceite de soya. Cabe destacar que los AG de cadena media C12, C14 y C16 redujeron su contenido en leche 56.7, 43.2 y 18.2 %, respecto al tratamiento testigo. Los estudios citados en la revisión realizada por Martínez et al., (2013) muestran que el contenido de AG de cadena corta y media disminuyen en la grasa de la leche cuando se adicionan aceites en la dieta de rumiantes. En nuestro estudio, la adición de aceite de soya en la dieta pudo afectar la producción total de AG volatiles en rumen; por lo tanto, pudo reducirse el ácido acético, el cual es el principal sustrato necesario para la síntesis de novo de AGS de cadena corta y media (Chilliard y Ferlay, 2004). Una menor síntesis de novo puede ocurrir por el efecto inhibitorio, debido al mayor contenido de AG de cadena larga, absorbidos en el intestino delgado, con mayor flujo y disponibilidad para la glándula mamaria, sobre las actividades de las enzimas acetil-CoA carboxilasa y ácido graso sintetasa (Martínez et al., (2013). Los AG C14:1, C16:1 y C17:1 fueron afectados de forma cuadrática (p≤0.05), mientras que el contenido del AG C14:1 disminuyó drásticamente con la dieta pTMR-6, y los AG C16:1 y C17:1 aumentaron, lo cual puede deberse a la actividad de las enzimas desaturasas en el organismo observada en algunos pares de AG (C14:1/C14; C16:1/C16; C18:1/C18, AR/AV) (Bauman y Griinari, 2001). Pero su índice de actividad depende de cada animal (Soyeurt et al., 2008), así como de las características del suplemento o alimento (Shi-jun et al., 2007).
La Figura 1 muestra los efectos lineal y cuadrático (p≤0.05) en el contenido de los AG esteárico y oleico en leche; en las dietas pTMR-3 y pTMR-6 el AG esteárico aumentó su concentración 13.8 y 26.1 %, comparado con la dieta pTMR-0; mientras que el AG oleico aumentó 14.3 y 40.6 %. El aumento del AG esteárico con la adición de aceite de soya puede deberse a la acción de los microorganismos del rumen, los cuales saturan los AGI de 18 carbonos (Buccioni et al., 2012); y el incremento del AG oleico puede estar asociado a la acción de la enzima delta9 desaturasa, la cual usa al AG esteárico como sustrato para síntesis al AG oleico (Griinari et al., 2000).
El contenido de AG ALN disminuyó (p≤0.05) ligeramente en la grasa de la leche al aumentar el nivel de aceite de soya en las TMR (Figura 2). Los niveles de ALN en leche son menores a los reportados por otros autores al asignar el mismo tiempo de acceso a la pradera (Castro-Hernández et al., 2014; Morales-Almaraz et al., 2010). El forraje fresco es una de las mayores fuentes de ALN, evita el proceso de BH ruminal, llega a la glándula mamaria y se incorpora a la leche. En nuestro estudio, el menor consumo de forraje fresco en las vacas ayuda a explica su ligero menor contenido en la leche. Según Huang et al. (2008), ALN es menor (0.24 vs. 0.30 g 100 g-1 AG) en la leche de vacas Holstein estabuladas y cuya dieta incluyó 5 % de aceite de soya, en comparación con el testigo.
La inclusión de aceite de soya en la dieta aumentó (p≤0.05) AL en la grasa de la leche, lo cual puede deberse a su mayor aporte con el aceite de soya incluido en la dieta. Una respuesta similar se observó en otros estudios con la adición de aceite de soya en la dieta de vacas lecheras (Huang et al., 2008; Rego et al., 2005).
El AV es el mayor AG trans producido por la biohidrogenación de los AG AL y ALN (Bauman y Griinari, 2001). En nuestro estudio se mostró que un aumento del contenido de aceite de soya en la dieta, incrementó la concentración de AV en la leche (p≤0.05) y fue 50.3 y 128.7 % mayor en pTMR-3 y pTMR-6, comparado con pTMR-0 (Figura 2). Sun y Gibbs (2012) concluyen que alimentar vacas con dietas alto contenido de AGPI puede inhibir la última fase del proceso de biohidrogenación en el rumen; en consecuencia, habría mayor concentración de AG intermediarios y un mayor flujo de estos hacia el intestino delgado donde se absorben y se transportan a la glándula mamaria para ser excretados en la leche. Un aspecto importante del contenido de AV en la leche de vacas es que este AG es un precursor de la síntesis del AR en humanos (Turpeinen et al., 2002). Para AV y AR se asocian propiedades para reducir la enfermedad coronaria del corazón y el riesgo de la aterosclerosis en modelos animales, y probablemente en el humano (Wang et al., 2012). En nuestro estudio el contenido de AR fue afectado de forma cuadrática (p≤0.05) y su mayor contenido se observó en la dieta pTMR-3 (Figura 2). En contraste, el tratamiento pTMR-6 redujo el contenido de AR en leche, lo cual puede deberse a una posible inhibición de la actividad de la enzima delta9 desaturasa por el AG C18:2 t10c12, tal vez debido a una menor expresión del gen responsable de esta enzima (Choi et al., 2000). Asimismo, el isómero C18:2 t10c12 del CLA, proviene de la isomerización del AL, y se ha observado mayor contenido cuando la proporción de concentrado en la dieta es mayor que la de forraje (Bauman et al., 1999).
Conclusiones
El uso de 6 % de aceite de soya en una ración completa mezclada a vacas lecheras en pastoreo, con 12 h en la pradera y una asignación de forraje de 22 kg de MS, aumenta el contenido total de ácidos grasos insaturados en la leche y reduce el contenido de ácidos grasos saturados, principalmente, C12, C14 y C16, pero disminuye el contenido total de grasa y proteína de la leche. El contenido de ácido ruménico en leche es duplicado con la adición de aceite de soya en la ración y es independiente del porcentaje de aceite de soya añadido, mientras que el contenido de ácido vaccénico incrementó al agregar más aceite de soya.