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Introducción
El grano de maíz es importante para la alimentación humana en América Latina y África (OCDE/FAO, 2011). En México es el cultivo principal, ocupa 33 % de la superficie sembrada nacional (7.5 millones ha), en el 2013 se produjeron 22.7 millones t de grano, el rendimiento nacional medio es 3.2 t ha-1, lo cual representa el 18 % del valor de la producción agrícola (78 mil millones de pesos) (FAOSTAT, 2014) y se estima un consumo anual aparente de 210 kg de grano por persona (Morris y López, 2000).
El maíz es el alimento de mayor consumo y la principal fuente de proteínas (39 %) y energía (59 %) (Fernández et al., 2013), en particular de la población rural y zonas citadinas marginales (Nuss y Tanumihardjo, 2011). Pero sus proteínas son deficientes en lisina y triptófano, aminoácidos esenciales para el metabolismo celular que no se sintetizan en los humanos y deben suministrarse mediante alimentos de origen animal.
El endospermo del maíz contiene 75 % de almidón y 15 % de proteína (Manicacci et al., 2009). Esta última se almacena principalmente como zeína que es deficiente en lisina y triptófano (Serna et al., 2008); por lo tanto, al consumir el grano del maíz solo se aprovecha 65 % de la proteína total (Gerdes et al., 2012).
Para contribuir a reducir la desnutrición y optimizar la situación alimentaria, el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT) y el programa HarvestPlus impulsan cultivos biofortificados (Nuss y Tanumihardjo, 2011) y trabajan de forma mancomunada con los programas nacionales. Entre sus objetivos está aumentar el valor nutricional del grano de maíz mediante el gen opaco2 (o2).
El gen mutante o2 se expresa en condición homocigótica recesiva y determina un mayor contenido de lisina y triptófano (Mertz et al., 1964; Krivanek et al., 2007). El valor nutritivo alto de estos maíces, llamados entonces opaco2, se ligaba con características indeseables del grano como endospermo con textura suave, bajo peso y poca resistencia a enfermedades y plagas de almacén (Bjarnason y Vasal, 1992). Lo anterior limitaba su uso hasta que mediante técnicas de mejoramiento tradicional se incorporaron genes modificadores de la textura del endospermo del maíz opaco2 (Vasal, 1994; Larkins et al., 1994) y se obtuvieron maíces con características muy semejantes a genotipos no modificados (Mendoza-E. et al., 2006), y se denominaron maíces con alta calidad de proteína (MCP o QPM, siglas en inglés).
El mejoramiento genético de los maíces o2 es complejo porque hay numerosos genes que regulan el desarrollo del endospermo (Holding et al., 2008), y sólo algunos de ellos se han identificado; además, la expresión de la calidad de proteína es afectada por el ambiente (Landry y Delhaye, 2007) y, en particular, por la dosis de fertilización (Gutiérrez et al., 2014). Por lo tanto, la denominación de MCP implica la respuesta genotípica y fenotípica del cultivar y la tecnología de producción (Vázquez et al., 2012). El éxito de la tecnología de los MCP estriba en que sus ventajas nutricionales se preserven hasta la generación F2 porque es la destinada a la alimentación humana y animal, y podría ser también la semilla para el siguiente ciclo de cultivo, dado el alto costo de la semilla híbrida.
La semilla F1 la siembra el agricultor para establecer el cultivo, el grano cosechado es la generación F2 y es para el consumo. Por ello es relevante lograr que los atributos de calidad alta de la proteína estén codificados en el genoma de las líneas progenitoras, preservadas en las F1 y expresadas en la F2.
Hay poca información del monitoreo de la calidad de proteína a través de las diferentes etapas de formación de híbridos de maíz o2, desde líneas parentales hasta la cosecha del grano para uso alimenticio. Así los objetivos de este estudio fueron: 1) Determinar el contenido de triptófano, lisina, proteína total e índice de calidad de proteína de seis líneas de maíz o2, de 15 cruzas simples formadas con ellas y de la generación F2 de esas cruzas; y 2) observar si esas variables disminuyen al pasar de la F1 a la F2.
Materiales y Métodos
Siembra en campo
La siembra en campo se efectuó en el Campo Experimental Valle de México del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (CEVAMEX, INIFAP) ubicado en Chapingo, México (19° 29’ N y 98° 53’ O), 2240 m de altitud, clima templado con 643 mm de precipitación en verano y temperatura promedio anual de 15.1 °C, y con suelo arcillo-arenoso.
Las líneas y cruzas F1 se sembraron el 20 de abril del 2011. Las cruzas F2 el 27 de abril del 2012, y ambos cultivos se manejaron como se describe a continuación.
El diseño experimental fue de bloques completos al azar con tres repeticiones. Los materiales genéticos fueron sembrados en parcelas cuyo tamaño fue de dos surcos de 5.0 x 0.80 m, con 26 plantas por surco con una separación entre ellas de 0.20 m. La densidad de población fue 65 mil plantas ha-1 y la dosis de fertilización (kg ha-1) fue N (120), P (60), K (30). Los riegos de auxilio se aplicaron a los 40, 90 y 120 d después de la siembra (dds).
Alrededor de la madurez fisiológica del cultivo (150 dds), se eligieron al azar diez plantas con competencia completa por repetición, se cosecharon y desgranaron a mano, se mezclaron los granos de las repeticiones y de ellos se tomaron las dos muestras de 100 g usadas para las determinaciones químicas. Los granos se almacenaron con 10 % de humedad hasta su análisis.
Material genético
Los tipos de materiales genéticos fueron:
1) Seis líneas endogámicas de maíz opaco2 (o2), con grano blanco y endospermo con textura normal (M1 a M6), derivadas de la cruza de las líneas CML 244 (S4), CML 352 (S5), CML 242 (S4), CML 246 (S3), CML 349 (S5) y CML 354 (S3) con la línea CML176 [(P63-12-2-1/P67-5-1-1)-1-2-B-B] del CIMMYT, ésta fue la donadora del gen o2; después se retrocruzaron tres ciclos hacia material normal, se autofecundaron y se hicieron incrementos masivos de ellas para recombinarlas y estabilizarlas (Cuadro 1).
Cuadro 1 Líneas endogámicas de maíz con alta calidad de proteína utilizadas en el estudio (CEVAMEX, 2011).
° = Autofecundaciones posteriores a las retrocruzas.
2) Las 15 cruzas simples directas formadas con las líneas anteriores (plantas S1, S2 o S3, según sus autofecundaciones posteriores al retrocruzamiento, con embriones F1 en el campo de cultivo).
3) La generación F2 de las cruzas anteriores (plantas F2 con embriones F2, en el campo de cultivo), se incluyó como testigo regional al H70, híbrido comercial con proteína y endospermo normales.
Los genotipos estudiados están adaptados para prosperar en el Altiplano Central de México (con altitudes de 2200 a 2600 msnm) y el cultivo de H70 predomina en esta región (Arellano et al., 2011), por lo cual se eligió como testigo regional.
Determinación de los contenidos de triptófano, lisina, proteína total e índice de calidad de proteína
Las determinaciones químicas se hicieron durante el 2013 en el Laboratorio de Biotecnología Molecular de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología del Instituto Politécnico Nacional (UPIBI, IPN), en la Ciudad de México. En cada genotipo (seis líneas, 15 cruzas F1 y sus respectivas F2) se cuantificaron los contenidos de lisina (Lis), triptófano (Trp), proteína total (PT) e índice de calidad de proteína (ICP), y se utilizaron las dos repeticiones de 100 granos ya mencionadas.
Los granos se molieron y desgrasaron con hexano durante 6 h, de esta harina se tomaron 100 mg para realizar la determinación espectrofotométrica (Zuzi 4201/20) de los aminoácidos (Galicia et al. 2009). Para Lis el protocolo se basó en la reacción del 2-cloro, 3, 5-dinitropiridina (390 nm) y para Trp en la del ácido glioxílico (560 nm).
La PT se calculó multiplicando el contenido de nitrógeno total, determinado según Galicia et al. (2009), por el factor 6.25 (Salinas y Vázquez, 2006). El ICP proteina (ICP) se calculó con la fórmula: ICP= [triptófano (%) x 100] [proteína (%)]-1 (Galicia et al. 2009). Los resultados se expresaron como porcentaje en base seca en promedio de dos repeticiones.
Variación de la calidad de proteína entre las generaciones F 1 y F 2
Para estimar la estabilidad de las variables de la calidad de la proteína entre las generaciones F1 y F2, se calcularon las diferencias (%) de sus valores entre ambas generaciones: F1-F2=(F1-F2) (100) (F1)-1; donde F1= valor de la cruza simple y F2= valor de la cruza segregante correspondiente, se multiplicó por (-1) para indicar la disminución de la variable (adaptado de Hernández-Leal et al., 2013).
Análisis estadístico
Con los datos se realizó un ANDEVA, los contenidos de Lis, Trp, contenido de proteína e ICP entre y dentro de genotipos, se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05). Para evaluar la estabilidad de la calidad de proteína de cada cruza entre sus generaciones F1 y F2 (depresión endogámica) se usó la prueba de t para datos apareados (p≤0.05). Todos los análisis estadísticos se efectuaron con SAS (SAS Institute, ver. 9.2).
Resultados y Discusión
Cuantificaciones químicas
Hubo diferencias (p≤0.01) en Trp, Lis, PT, e ICP, para líneas y cruzas F1 y F2 y testigo regional (H70) (Cuadro 2). Así, los genotipos expresaron una variación significativa en las características de la calidad de proteína cuantificadas, por lo cual se realizó la comparación estadística de las medias obtenidas en cada caso (Cuadro 3).
Cuadro 2 Cuadrados medios y significancia estadística de los caracteres químicos evaluados en las líneas endogámicas de maíz, cruzas F1 y F2 y testigo regional.
**p≤0.01; CV = Coeficiente de variación.
Cuadro 3 Promedios (% en base seca) del contenido de triptófano, lisina, proteína e índice de calidad proteica en las líneas endogámicas de maíz.
Medias con letra diferente en una columna son estadísticamente diferentes (Tukey; p≤0.05).
La diversidad en la expresión de las características evaluadas se puede deber a que la genealogía de las seis líneas parentales fue distinta aunque todas ellas compartieron la línea CML176 como donadora del gen o2. Es decir, las líneas conservaron su individualidad y nivel alto de endogamia, ya que sólo se incorporó el o2 y después se retrocruzaron hacia su respectivo material no modificado o normal (Cuadro 1).
Las líneas (Cuadro 3) y las cruzas F1 (Cuadro 4) superaron significativamente al testigo regional (H70) en todas las mediciones de calidad de proteína evaluadas y principalmente en aminoácidos esenciales e ICP, caracteres químicos prioritarios para la calidad de proteína. Por lo tanto, se puede indicar que el potencial de los materiales fue amplio para generar híbridos de alta calidad de proteína.
Cuadro 4 Promedios (% en base seca) del contenido de triptófano, lisina, proteína e índice de calidad proteica en las generaciones F1 y F2 de las cruzas de maíz.
Medias con letra diferente en una columna son estadísticamente diferentes (Tukey; p≤0.05).
Las líneas M2 y M3 tuvieron los contenidos más altos (p≤0.05) de Trp, PT e ICP, seguidas de M6, y M1, M4 y M5 que mostraron el desempeño menor (Cuadro 3). Es decir, hubo variación genética entre líneas para Trp, PT e ICP pero no para Lis, porque el contenido de este aminoácido no varió entre líneas ni entre cruzas F1 y F2, por lo cual fue la variable con mejor respuesta en todo del estudio.
Las F1 con los valores más altos y consistentes en las mediciones efectuadas se obtuvieron con los cruzamientos de las líneas situadas en los dos primeros niveles significativos (M2, M3, M4 y M6) (Cuadro 3), pero los cruzamientos entre líneas menos prominentes generaron híbridos con menores atributos de calidad de proteína. En ambos casos, con la hibridación se conservó la calidad proteica intrínseca de las líneas.
Las cruzas M2 x M5 y M5 x M6 tuvieron un comportamiento intermedio pero consistente en las generaciones F1 y F2 (Cuadro 4), por lo cual fueron una opción genotécnica para formar MCP, es decir, híbridos con menores atributos de calidad proteica pero estables en la F2. La anterior es la generación de alimenta y en la cual se busca expresar los beneficios del maíz con alta calidad de proteína. Las líneas descritas como superiores (M2, M3 y M6) fueron progenitoras de siete cruzas sobresalientes para PT (p≤0.05), de las cuales solo tres destacaron también en Trp, Lis e ICP. Por lo tanto las cruzas consistentemente superiores en todas las variables fueron M2 x M4, M2 x M6 y M3 x M6 (Cuadro 4).
Los cruzamientos mencionados como más favorables para PT que para factores preponderantes de la alta calidad de proteína, como los aminoácidos esenciales y el ICP, no sugiere que las proteínas de los materiales experimentales tuvieran un buen balance de aminoácidos. Este argumento coincide con la ausencia de correlación entre contenido de proteína y reportada por Gutiérrez et al. (2014).
Variación de la calidad de proteína entre las generaciones F 1 y F 2
El examen de la calidad de proteína de las cruzas al pasar de su generación F1 (de polinización controlada) a la F2 (de polinización aleatoria), mostró que la depresión endogámica fue no significativa en 70 % de los casos (Cuadro 5). Esto indicó que, pese a la recombinación aleatoria, la mayoría de las cruzas mantuvo en las generaciones F1 y F2 contenidos semejantes de las variables estudiadas, principalmente de Lis e ICP, seguidas de Trp y al final PT (Cuadro 5). Así, PT fue el componente químico con mayor dificultad para que las cruzas lo conservaran en la generación de consumo de grano (F2).
Cuadro 5 Depresión endogámica (%) de los caracteres químicos evaluados entre las generaciones F1 y F2.
°=Prueba de datos apareados de Student. En columnas: *p≤0.05; *p≤0.01; ns=No significativo.
La estabilidad descrita de las cruzas entre las generaciones F1 y F2 también podría explicarse por el alto nivel de endogamia de las líneas parentales con respecto al o2 (como ya se adujo), de manera que la recombinación de la F2 ocurrió entre alelos del mismo gen y, en consecuencia, en la mayoría de las cruzas no hubo depresión endogámica en las variables que están determinadas por el o2, que son Lis, Trp e ICP, aunque este último de manera indirecta, puesto que es la proporción de la cantidad de TRP presente en la proteína del grano.
Otro aspecto destacado de la Lis es que sus diferencias F1 - F2 fueron positivas en 73 % de las cruzas (Cuadro 5). Esto significa que su contenido aumentó en la generación F2, así que no denotó depresión endogámica, la cual si se presentó en Trp, PT e ICP.
Los aumentos de Lis en la F2 se atribuirían a que la recombinación ocurrió entre líneas homocigóticas para el o2, con contenidos altos del aminoácido, con las cuales se obtuvieron cruzas F1. Éstas también fueron sobresalientes en la misma variable y la polinización aleatoria favoreció la acumulación de Lis.
Las cruzas M2xM4, M2xM6 y M3xM6, mencionadas ya como sobresalientes por sus valores elevados y significativos de Trp, Lis, PT e ICP, redujeron sus respuestas por la depresión endogámica, excepto M3xM6 que conservó sin cambios su ICP en la F2. Esta cruza fue la mejor del estudio porque mostró valores altos y significativos de calidad de proteína en F1 y no mostró depresión endogámica significativa.
Las cruzas M2 x M5 y M5 x M6, con respuesta intermedia, tuvieron una alta estabilidad en la F2, porque no mostraron depresión endogámica (p≤0.05) en aspectos primordiales de la calidad de proteína (aminoácidos esenciales e ICP), Por tanto, también fueron híbridos valiosos.
Algunas cruzas mantuvieron el nivel de calidad de sus líneas y otras no, lo cual podría derivar de su constitución genética, puesto que la expresión del o2 está regulada por el genotipo de la línea endogámica en la cual se introduce (Gutiérrez-Rojas et al., 2008). Además hay genes modificadores del desarrollo del endospermo (Holding et al., 2008), los cuales deben variar con el genotipo.
Entonces, hubo respuestas genotípicas diferentes para la depresión endogámica, las cruzas con calidad de proteína superior fueron más susceptibles que combinaciones alélicas con menores atributos de calidad, y la recombinación genética aleatoria tuvo una repercusión favorable en la variable Lis y mermó el contenido de aminoácidos y el ICP.
La obtención de híbridos de maíz o2 es un proceso complejo pero viable, en el cual es deseable evaluar y caracterizar el germoplasma experimental con base en la cuantía de aminoácidos esenciales, sobre todo del ICP y la estabilidad de la manifestación de las bondades del o2 en la generación F2, y se debe definir el ambiente y el nivel tecnológico de producción al cual están destinados. Además es posible integrar los elementos anteriores mediante modelos matemáticos que contribuyan al conocimiento del proceso.
Conclusiones
Las líneas M2 y M3 y las cruzas M2xM4, M2xM6 y M3xM6 presentaron los contenidos más altos de lisina, triptófano, proteína total e índice de calidad de proteína. La calidad de proteína de dichas cruzas no fue estable en la F2, excepto M3xM6, por lo cual fue la cruza más consistente y estable.
La depresión endogámica no incidió sobre las cruzas con calidad intermedia de proteína ni en el contenido de lisina, que fue la variable experimental con mejor respuesta en todas las etapas genotécnicas.
