Recolecta de material vegetal

Los tejidos vegetales se recolectaron en plantaciones de Huizotlaco, Coacuilco y Contepec en Hidalgo, México (Figura 1, Cuadro 1). La recolecta de hoja, tallo y flor se realizó durante la etapa de floración en mayo de 2014. Los frutos de las plantas de cada sitio se recolectaron 32 semanas después de la polinización y se beneficiaron con el proceso tradicional (Beneficio Primero de Mayo, Papantla, Veracruz) por el maestro beneficiador Veremundo Rodríguez.

Figura 1 Ubicación geográfica de los sitios de recolecta de estructuras de vainilla en la Huasteca Hidalguense, México. S1: Huizotlaco, S2: Coacuilco, S3: Contepec. 

Análisis cualitativo por cromatografía en capa fina (CCF)

Preparación de extractos. A partir de hojas, tallos y flores frescos triturados y hexano y metanol en proporción 1:5 (tejido: disolvente) se obtuvieron los extractos con diferente polaridad (^{Recio-Iglesias, 1999}); el extracto de vaina beneficiada se obtuvo sólo con metanol por la disponibilidad baja de la muestra (^{Jadhav et al., 2009}). Las muestras se colocaron en un sonicador (Auto Science, modelo A5515OB) por 30 min, a frecuencia de 5.5, se mantuvieron en maceración a temperatura ambiente por 24 h, se filtraron y almacenaron en viales de vidrio a -20 °C) hasta el momento de su análisis.

Identificación de los grupos de compuestos. A placas de gel de sílice 60, F₂₅₄ (Sigma-Aldrich) se aplicaron de 15 a 20 μL de los extractos. Los eluyentes y agentes cromogénicos fueron específicos para la detección de cada grupo de metabolito (^{Wagner y Bladl, 1996}), en el caso de flavonoides las placas se visualizaron con luz ultravioleta (UVLMS-38 El series 3UV™ Lamp) a365 nm.

Análisis cuantitativo

Hojas y tallo se obtuvieron de los extremos superior e inferior y de la región media de un metro de esqueje de la planta, se seccionaron en trozos pequeños, se extrajeron con metanol y se mantuvieron en la misma forma que se describió antes. A cada tejido se le determinó el contenido de humedad para expresar la concentración de los metabolitos secundarios con base en la materia seca (MS).

Compuestos fenólicos totales. Estos compuestos se cuantificaron con el método propuesto por ^{Singleton et al. (1999)}, a 725 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Evolution 300, Thermo Scientific). La curva estándar (y=1.6571x-0.016, R²=0.9932) se preparó con ácido gálico (Sigma). Los resultados se expresaron en mg equivalentes de ácido gálico por 100 g de materia seca.

Taninos totales. Estos compuestos se cuantificaron con el método descrito por ^{Makkar et al. (1993)}, a 725 nm en un espectrofotómetro UV/VIS (Evolution 300 Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en mg de ácido tánico (Sigma) por 100 g de materia seca, con base en la ecuación de la curva estándar (y=1.6571x-0.016, R²=0.9932).

Taninos condensados. Estos compuestos se cuantificaron con el método propuesto por ^{Makkar et al. (1993)}, a 550 nm en un espectrofotómetro UV/VIS (Evolution 300 Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en mg de ácido tánico (Sigma) por 100 g de materia seca de acuerdo con la ecuación:

dónde A es absorbancia, 78.26 es el factor de corrección, % MS es porcentaje de materia seca.

Flavonoides. Estos compuestos se cuantificaron con el método de ^{Chang et al. (2002)} a 415 nm en un espectrofotómetro UV/VIS (Evolution 300, Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en mg equivalentes de quercetina (Sigma) por 100 g de materia seca de acuerdo con la ecuación de la curva estándar (y=6.0143x-0.0084, R²=0.9984).

El beneficiado del fruto se realizó siguiendo la descripción de ^{Xochipa-Morante et al. (2016)}.

Análisis estadístico

Para analizar los resultados de las pruebas cualitativas por cromatografía en capa fina se obtuvieron tablas de contingencia. La concentración de los compuestos fenólicos totales, taninos totales, taninos condensados y flavonoides, de nueve repeticiones de hoja y tallo, y cuatro de flor y vaina beneficiada, de cada sitio de recolecta, se realizó ANDEVA. La diferencia entre medias por recolecta y entre tejidos se evaluó con la prueba de Tukey (α=0.05) con el paquete estadístico SAS versión 9.0 (^{SAS Institute Inc., 2002}).

Análisis cualitativo por cromatografía en capa fina

Los grupos de fitoquímicos más abundantes, identificados por CCF, variaron entre los tejido (Cuadro 2): 1) los terpenoides (17 a 20 bandas) se producen comúnmente en tejidos vegetales, flores y ocasionalmente en raíces (^{Dudareva et al., 2004}), su presencia en vainilla pudo deberse a que es el grupo de metabolitos secundarios vegetales más abundante y diverso en estructura química, y su papel es importante en la interacciones planta-insecto, planta-patógeno y planta-planta (^{Paschold et al. 2006}); 2) las saponinas (16 a 18 bandas) son un tipo de terpenoide, habitualmente participan activamente en los procesos de regulación del crecimiento vegetal y las variaciones en su distribución, composición y concentración en las plantas también se atribuyen a las reacciones de las especies al ambiente (^{Moses et al., 2014}) y 3) flavonoides (14-18 bandas), su síntesis en las plantas se reconoce como una reacción a infección por microorganismos (^{Dixon et al., 1983}), ayudan a combatir el estrés oxidativo y actúan como reguladores del crecimiento (^{Kumar y Pandey, 2013}). En general, las hojas presentaron diversidad mayor de metabolitos (19 a 22 bandas), quizá por su actividad metabólica mayor, que además de la fotosíntesis, la exposición a la luz modula la síntesis y presencia de fitoquímicos que protegen a las plantas contra patógenos o herbívoros; esos compuestos pueden incluso depositarse en el exterior de las hojas, como ceras y cutina (^{Vivanco et al., 2005}).

La presencia de metabolitos por tejido dependió del sitio de recolecta. Los flavonoides mostraron más bandas (6) en hojas y tallos de Coacuilco; las hojas y tallos de Contepec destacaron por el número mayor correspondiente a saponinas (7 bandas), terpenoides en hoja (7) y compuestos fenólicos totales en vaina beneficiada (3). En los tejidos de los tres sitios de recolecta hubo menos bandas (1-2) de taninos y alcaloides (Cuadro 2). ^{Shanmugavalli et al. (2009)} documentaron resultados similares, ya que detectaron trazas de estos dos grupos en hojas y tallos de V. planifolia, en condiciones naturales, en India.

Análisis cuantitativo

Los principales grupos de fitoquímicos en tejidos mostraron coeficientes de variación (CV) entre 7 y 15 %, el mayor correspondió a los taninos condensados. En todas las variables se observaron diferencias altamente significativas (p<0.0001) (Cuadro 3).

La concentración de los componentes fitoquímicos varió ampliamente entre los sitios de recolecta. El material vegetal de Contepec tuvo la concentración mayor de compuestos fenólicos totales y taninos totales. El de Coacuilco tuvo la concentración mayor de flavonoides y taninos condensados, y el de Huizotlaco presentó la concentración menor de todos los componentes evaluados (Cuadro 4).

La vaina beneficiada presentó la concentración mayor de compuestos fenólicos totales (Cuadro 4), aparentemente porque contribuyen ampliamente (1 000 a 3 000 mg 100 g^-1 MS) al aroma de las vainas beneficiadas (Shina et al., 2008) y favorecen la actividad antioxidante de extractos de vainas curadas (^{Rojas-López y Cañizares-Macías, 2013}).

La hoja fue el tejido con concentración mayor de flavonoides, pero su contenido fue considerablemente menor al del té (Camelia sinensis) (611 mg 100 g^-1 MS), el cual tiene gran capacidad antioxidante (^{Pereira et al., 2014}) (Cuadro 4). La vaina beneficiada mostró la concentración mayor de taninos totales, pero correspondió a menos de la mitad en algunos frutos frescos, como el arándano (233 mg 100 g^-1) (^{Vázquez-Flores et al., 2012}), o incluso frutos que tienen un proceso de beneficio, como el café tostado (270 mg 100 g^-1) (^{Savolainen, 1992}). Las hoja mostraron la concentración mayor de taninos condensados y les siguieron los tallos; estos compuestos pueden contribuir a la protección de los tejidos, que como otros están expuestos a patógenos, herbívoros y radiación UV (^{Brillouet et al., 2013}).

La concentración mayor de compuestos fenólicos totales se observó en flores y vaina beneficiada de Contepec, respecto a los otros sitios de recolecta y tejidos. Esto coincidió con los resultados de los componentes del aroma (principalmente compuestos fenólicos) en vainas beneficiadas del mismo sitio de recolecta, que mostraron concentración alta de ácido vaníllico y media de vainillina (^{Delgado-Alvarado et al., 2016}). Hojas, tallos y flores de Coacuilco y la vaina beneficiada de Contepec mostraron concentración mayor de flavonoides y taninos totales (Cuadro 5). La concentración mayor de taninos condensados la presentaron los tallos de Coacuilco, las hojas procedentes de Huizotlaco y las flores y la vaina beneficiada de Contepec (Cuadro 5). Estas diferencias entre sitios de recolecta pueden atribuirse a las condiciones de cada sitio; Coacuilco está a altitud mayor, respecto a los otros sitios (Cuadro 1), por lo que la temperatura difiere y puede generar estrés en las plantas y favorecer la producción de esos compuestos.

Cola parchycarpa y Cola lepidota crecen en condiciones geográficas y ambientales diferentes y el sitios de recolecta determina la presencia y concentración de fitoquímicos en las estructuras vegetales (^{Ene-Obong et al., 2016}). Además, en V. planifolia las diferencias entre tejidos también pueden asociarse a la etapa de desarrollo y condiciones de crecimiento de la planta, puesto que los tejidos más jóvenes tienden a concentrar cantidad mayor de fitoquímicos (^{Palama et al., 2010}). Esos metabolitos suelen transportarse de la raíz a los tallos y las hojas, vía xilema o floema, y almacenarse en estructuras reproductivas, como flores y vainas (^{Wink y Schimmer, 2010}).

Con base en lo anterior, la región de recolecta de mayor interés podrían ser Coacuilco, porque las hojas y tallos recolectados ahí presentaron la concentración mayor de flavonoides y taninos totales, y Contepec porque las vainas y las flores presentaron la concentración mayor de compuestos fenólicos totales y taninos condensados. En contraste, en Huizotlaco todos los tejidos vegetales mostraron la concentración menor de metabolitos secundarios. Estos resultados permiten sugerir la conveniencia de investigar el efecto de otros factores que favorezcan la síntesis de metabolitos en la planta de vainilla.