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Introducción
Una de las causas principales que evitan el establecimiento de una preñez nueva en la vaca, durante el postparto temprano, es un ambiente uterino inadecuado (Walsh et al., 2011). Para que la gestación inicie, es necesario que el endometrio pueda nutrir al embrión en la etapa pre y post implantación (Donofrio et al., 2008); esto es posible por las secreciones nutritivas de las glándulas endometriales (Gunin et al., 2001). Esas glándulas están sujetas a los cambios en el endometrio, que se remodela en cada ciclo estral, al ocurrir proliferación celular (mitosis) y el subsecuente desarrollo glandular.
Factores antinutricionales en la dieta del animal como fitohormonas, alcaloides y taninos, pueden actuar indirectamente sobre el endometrio, interrumpiendo la síntesis y secreción de estradiol y progesterona, que son las principales responsables de estimular el crecimiento de glándulas endometriales (Gonella et al., 2010; Benbia et al., 2013) o actuar de manera directa disminuyendo o bloqueando la proliferación celular y la secreción de las glándulas endometriales (Oluyemi et al., 2007; Iranloye y Bolarinwa, 2008). La consecuencia de cualquiera de estas acciones es la alteración del desarrollo glandular impidiendo la implantación u ocasionando muerte embrionaria.
El principal origen de los factores antinutricionales y fuente de alimentación de los herbívoros son los forrajes (James et al., 1992). En el trópico, los sistemas de producción de carne y leche están en sistemas silvopastoriles (SSP) asociando gramíneas con árboles o arbustos leguminosos con el objetivo de disminuir la oferta de concentrados (Murgueitio et al., 2011; Naranjo et al., 2014).
Una de las asociaciones más utilizadas en la región tropical de Latinoamérica es la de gramínea con leucaena (Leucaena leucocephala), para mejorar el consumo de proteína y mantener la productividad del rebaño (Murgueitio et al., 2011; Cuartas et al., 2013). Sin embargo, la leucaena contiene el alcaloide mimosina, cuyos metabolitos 3,4 y 2,3 dihidroxypiridona (DHP) podrían ocasionar muerte embrionaria o muerte fetal temprana (Jones et al., 1989; Akande et al., 2010).
Estudios in vitro demostraron que la mimosina tiene un efecto antimitótico sobre varios tipos de células, incluyendo las del ovario (Feldman y Schönthal, 1994; Hughes y Cook, 1996). Según Sahlu et al. (1995) y Reis et al. (1999), la mimosina puede acumularse en algunos órganos y el folículo piloso de cabras impidiendo la multiplicación celular. Sin embargo, en la literatura revisada no se encontró información sobre la probable acumulación de mimosina en el tejido uterino, y si esto tiene algún efecto sobre el desarrollo de las glándulas endometriales de vacas durante el posparto temprano. El objetivo de este estudio fue determinar la acumulación de mimosina en el tejido endometrial, por consumo de L. leucocephala, y observar su efecto en el desarrollo de las glándulas endometriales de vacas en postparto temprano en un sistema silvopastoril, con altas densidades de esta leguminosa.
Materiales y Métodos
El estudio se realizó de marzo de 2013 a marzo de 2014 en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Yucatán, localizada al este de la Península de Yucatán, México, entre 16° 06’ y 21° 37’ N, y 87° 32’ y 90° 23’ E.
Animales y tratamiento
El estudio incluyó 24 vacas adultas durante el posparto temprano (45 a 90 d), cruzas de Bos indicusxBos taurus, de tres a cinco partos, con peso vivo promedio de 509±74 kg y condición corporal de 6±0.3 puntos, de acuerdo con la escala 1-9 establecida por Ayala et al. (1995). Inmediatamente después del parto, las vacas se asignaron a uno de los dos tratamientos: pastoreo en sistema silvopastoril (SSP, n=12), asociación de pasto estrella de África (Cynodon nlemfuensis) y leucaena var. Cunningham, con densidad de 36 000 plantas de leucaena ha-1; y pastoreo en sistema de monocultivo (SM, n=12) de pasto estrella de África. El pastoreo en ambos sistemas fue de 8:00 a 13:00 h y de 17:00 a 5:00 h, el consumo estimado de forraje fue de 50 al 70 % de la dieta. En el ordeño, las vacas recibieron un suplemento para cubrir sus requerimientos energéticos y proteicos según el nivel de producción láctea, sin pérdida o ganancia de peso (Cuadro 1 y 2), empleando las tablas de la AFRC-CAB-INTERNATIONAL (1995). El suplemento constituyó entre el 30 y 50 % del consumo total.
Cuadro 1 Composición nutricional de los forrajes y suplementos consumidos por vacas en un sistema silvopastoril intensivo (SSP) y un sistema de monocultivo de gramínea (SM).
| Variable | SSP | SM | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Pasto estrella de África | Leucaena | Sorgo | Pasto estrella de África | Concentrado | |
| MS (%MF) | 27.4 | 32.1 | 95.0 | 27.4 | 89.0 |
| PC (%MS) | 8.0 | 15.3 | 8.6 | 6.2 | 12.3 |
| FAD (% MS) | 36.1 | 24.7 | - | 36.1 | - |
| Ceniza (% MS) | 9.9 | 7.8 | 1.3 | 9.9 | 3.8 |
| EM (%MS) | 9.2 | 9.3 | 12.4 | 8.9 | 11.2 |
MF: materia fresca, MS: materia seca, PC: proteína cruda, FAD: fibra ácido detergente, EM: energía metabolizable.
Cuadro 2 Consumo de forraje estimado y cantidad de suplemento ofrecido (kg MS vaca-1 d-1) según el nivel de producción de leche de vacas en un sistema silvopastoril intensivo (SSP) y un sistema de monocultivo de gramínea (SM).
| kg leche vaca-1 d-1 | SSP | SM | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Pasto estrella de África |
Leucaena | Sorgo | Pasto estrella de África |
Concentrado | |
| 10 | 4.6 | 3.8 | 3.5 | 7.3 | 3.4 |
| 15 | 6.2 | 4.2 | 4.8 | 6.7 | 5.4 |
| 20 | 2.7 | 6.4 | 7.0 | 7.5 | 6.7 |
| 25 | 2.7 | 6.4 | 9.5 | 7.5 | 10.7 |
Consumo de mimosina por peso vivo (CMPV)
El consumo de mimosina se estimó a partir del consumo de materia seca de leucaena y el contenido de mimosina en hojas y tallos tiernos. El primero se determinó con el método de n-alcanos (Dove y Mayes, 1991) y se expresó en kg de MS vaca-1 d-1, y el contenido de mimosina en la L. leucocephala se determinó mediante cromatografía líquida y se expresó en g kg-1 de MS leucaena; después, el consumo de mimosina se reportó como g vaca-1 d-1 (Bottini-Luzardo et al., 2015). El CMPV se calculó con la ecuación:
donde CMPV es el consumo de mimosina en gramos por kg de peso vivo, por día (g kg-1 d-1); CM es el consumo de mimosina en g vaca-1 d-1; y PV es el peso vivo de la vaca en kg.
Biopsias endometriales
Al momento de realizar las biopsias todas las vacas tenían al menos 45 d pastando en el tratamiento asignado y presentaban completa involución uterina.
Desde el día 45 postparto se observaron los ovarios, usando un ecógrafo (MINDRAY-50) trasductor lineal de 7.5 MHz (Shenzhen, Mindray Bio-Medical Electronics, Co. Ltd. Nanshan, Shenzhen, China). Las biopsias se tomaron de la capa funcional del endometrio el día cinco después de la observación ecográfica del cuerpo lúteo (CL), cuando se esperaba hubiese ocurrido el total desarrollo de las glándulas endometriales por presencia de la progesterona secretada por el CL (Kojima y Selander, 1970), y se realizaron biopsias sólo de la capa funcional del endometrio.
Dos muestras de tejido endometrial se tomaron con una pinza para biopsias, la cual se introdujo en la vagina y guiada transrectalmente hasta la parte craneal de uno de los cuernos uterinos. La primera muestra se colocó en un contenedor plástico estéril y congelada a -20 °C hasta su procesamiento para la determinación de mimosina. La segunda se colocó en un contenedor plástico estéril con una solución de formalina al 10 % para su estudio histológico.
Después de cada biopsia, la pinza se lavó 5 min con solución de yodo al 10 % y se enjuagó con agua estéril antes de su uso en la siguiente vaca.
Concentración de mimosina en tejido endometrial
Las muestras de endometrio se descongelaron en el laboratorio a 24 °C. Después se cortaron finamente y se colocaron en un tubo de ensayo, donde se adicionaron 2 mL de acetonitrilo (Sigma-Aldrich®) y se centrifugaron 15 min a 16 000 g min-1. El acetonitrilo se evaporó con una placa de calentamiento a 50 °C bajo una atmósfera de nitrógeno. Una vez realizada la evaporación se añadieron 2 mL de ácido clorhídrico (HCL 0.1 N), el tubo se agitó manualmente durante 30 s para homogeneizar la muestra, que se filtró utilizando una membrana de acetato de celulosa con porosidad de 0.45 μm. La detección de mimosina se realizó mediante cromatografía líquida (KNAUER Smartline, degasificador Manager smartline 5000, pump smartline 1000, autosampler smartline 3950, Germany), usando una columna LUNA C18 de 4.6x150 mm y 5 μm, y detector UV smartline con temperatura de 30 °C. Se inyectaron 0.5 μL de extracto de mimosina. La fase móvil fue una solución de ácido ortofosfórico (0.02 M) y la longitud de onda fue de 275 nm (Wu et al., 2012). El gradiente usado fue de 1.0 mL min-1. El resultado se expresó como μg g-1 de tejido endometrial (TE).
Funcionalidad del tejido endometrial
La funcionalidad del tejido endometrial se evaluó con el método de inclusión en parafina y tinción con hematoxilina-eosina (Tinciones Alvarez®, Granada-España). Las muestran se observaron en un microscopio Labomed LX40 (Lab. América Inc-USA) con aumento de 10 y 40X. Las fotografías se tomaron de 10 campos de un mismo corte histológico, utilizando una cámara Lamine 117 Histología de Ross Rowell con resolución de 1024x768 pp, 24 bit de color, adaptada al microscopio. Como indicativo de un endometrio funcional (EF) se consideró la presencia de glándulas hipertrofiadas y productivas, caracterizadas por el lumen dilatado y la presencia de material eosinofílico, donde el epitelio glandular presentó grandes vacuolas en la porción apical de su citoplasma, desplazando el núcleo hacia la membrana basal (Kojima y Selander, 1970; Gonella et al., 2010). Se calificó como endometrio no funcional (ENF) si no se observaban esas características.
Diseño experimental y análisis estadístico
Proc GENMOD se usó para determinar diferencias entre sistemas con respecto al número de vacas con endometrio funcional y no funcional. La correlación simple se calculó entre el CMPV y la concentración de mimosina en tejido uterino (μg g-1 TE) de vacas en el SSP.
Para determinar la normalidad de la concentración de mimosina en vacas en el SSP, se usó la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Los datos concentración de mimosina se transformaron a Log10 para cumplir con el supuesto de normalidad y se realizó una prueba de t de Student para contrastar diferencias entre la concentración de mimosina en el tejido endometrial funcional y no funcional en vacas en el SSP. Los resultados fueron significativos si p≤0.05. El programa SAS (SAS, 2009) se usó para el análisis de datos.
Resultados y Discusión
Mimosina se encontró en el endometrio de vacas en el SSP. Este es el primer reporte de acumulación de mimosina en órganos reproductivos de rumiantes.
Cuatro vacas en el SSP y 10 vacas en el SM (Figura 1) presentaron endometrio funcional, caracterizado por presentar glándulas maduras y funcionales. En el SSP sólo seis vacas desarrollaron CL y en el SM dos vacas fueron retiradas del experimento debido a la presencia de quistes foliculares, las restantes 10 desarrollaron CL.
Figura 1 Capa glandular endometrial funcional representativa de cuatro vacas en el SSP y 10 vacas en el SM, caracterizada por proliferación de glándulas maduras funcionales. A) Glándulas maduras. B) Lumen glandular dilatado con presencia de material eosinofílico (40 X).
Solo dos vacas en el SSP presentaron atrofia severa de las glándulas endometriales (Figura 2). No hubo diferencias entre sistemas, con respecto al número de hembras con EF (p˃0.05), lo que podría ser consecuencia del bajo número de hembras que desarrollaron CL en el SSP.
Figura 2 Capa glandular endometrial representativa de dos vacas en el sistema silvopastoril, caracterizada por atrofia severa de glándulas y estroma formado por fibras de colágeno inmaduras, fibroblastos y fibrocitos. A) Glándulas atrofiadas. B) Fibras de colágeno. C) Proliferación de fibroblastos y fibrocitos (40X).
La concentración de mimosina almacenada en el tejido endometrial de las vacas en el SSP con ENF fue mayor (p≤0.05) que el de las vacas con EF (Cuadro 3). El coeficiente de correlación entre la cantidad de mimosina ingerida y la almacenada no fue diferente de cero (r=-0.019).
Cuadro 3 Concentración de mimosina en el tejido endometrial de vacas en postparto temprano consumiendo Leucaena leucocephala en un sistema silvopastoril intensivo.
| Variable | Concentración de mimosina en tejido endometrial μg g-1 de TE | ||
|---|---|---|---|
| Media | Mínimo | Máximo | |
| Endometrio funcional (EF) | 51.98 | 51.02 | 53.73 |
| Endometrio no funcional (ENF) | 60.87 | 60.81 | 63.45 |
El consumo estimado, promedio diario, de mimosina por vaca fue 10.1±1 g, con un mínimo de 7.6 y un máximo de 12.1 g (Bottini-Luzardo et al., 2015), el CMPV promedio fue 0.019 g kg-1 d-1 con mínimo de 0.01 y máximo de 0.03 g kg-1 d-1. Este consumo es inferior a los valores relacionados con toxicidad clínica (≥0.18 g kg-1 d-1) por mimosina en vacas (Sethi y Kulkarni, 1995). Sin embargo, estos autores indican que el consumo de mimosina menor a 0.18 g kg-1 d-1, puede causar toxicidad subclínica en vacas, lo que coincide con Phaikaew et al. (2012) y Halliday et al. (2013) quienes establecen que el consumo de mimosina puede tener efectos adversos en la salud del animal, aunque no se manifiesten clínicamente, como ocurrió en otros estudios que señalan efectos negativos sobre la eficiencia reproductiva de ratas y toros consumiendo alcaloides, sin manifestación clínica de toxicidad (Yakubu, 2012; Burnett et al., 2017).
Klotz (2015) reporta la acumulación de alcaloides en los tejidos de órganos reproductivos de animales que consumen forrajes con estos factores antinutricionales. Además señala que su consumo constante puede ocasionar trastornos en diversas funciones fisiológicas, incluyendo las reproductivas.
En este sentido es posible entonces que la acumulación de este alcaloide en la capa funcional del tejido endometrial, en concentraciones iguales o superiores a 60 μg g-1 TE, pueda ocasionar atrofia glandular (Figura 2). Esto podría atribuirse al efecto antimitótico de la mimosina sobre las células (Hughes y Cook, 1996; Krude, 1999; Bianco et al., 2006; Hallak et al., 2008) o a la acción inhibitoria de los alcaloides sobre los receptores de estradiol y progesterona, hormonas responsables de estimular el desarrollo de las glándulas en el endometrio (Lessey et al., 1996; Lecce et al., 2001). Según investigaciones en África, el consumo de plantas con alcaloides, como la mimosina, altera el desarrollo glandular y la estructura del tejido endometrial en mujeres y animales (Dabhadkar et al., 2012; Udoh, 2012; Elshawarby et al., 2014).
Leucaena es el arbusto forrajero más utilizado en la alimentación de rumiantes en el mundo (Shelton y Dalzell, 2007). El consumo de este arbusto forrajero, puede disminuir los costos de producción y el impacto ambiental (Murgueitio et al., 2011; Yacout, 2016). Sin embargo, es necesario comprender los efectos que sobre la salud reproductiva puedan tener los factores antinutricionales contenidos en esta leguminosa, ya que la disminución en los rendimientos reproductivos repercute negativamente los rendimientos económicos del sistema de producción.
Conclusión
La mimosina proveniente del consumo de leucaena se acumula en el tejido endometrial y puede causar atrofia de las glándulas endometriales en vacas en postparto temprano. Este es el primer estudio que muestra la acumulación de mimosina en el tejido endometrial de las vacas y que establece una probable acción de este alcaloide sobre el desarrollo glandular.
