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Introducción
La miel es un alimento constituido principalmente de azúcares y en menores cantidades de compuestos como: enzimas, aminoácidos, ácidos orgánicos, carotenoides, vitaminas, minerales y compuestos fenólicos, entre ellos flavonoides. Es producida por diferentes tipos de abejas, a partir de exudados de plantas que se recogen, modifican y almacenan (da Silva, Gauche, Gonzaga, Oliveira & Fett, 2016). En la mayoría de las antiguas civilizaciones, la miel se utilizaba con fines nutricionales, medicinales y religiosos. En la actualidad, este producto de importancia económica, nutricional y farmacológica se incorpora en recetas caseras (dulces típicos, endulzante de bebidas o en infusiones) con propósito terapéutico (Álvarez-Suárez et al., 2010). A nivel industrial se utiliza para endulzar fórmulas lácteas, como vehículo para la preparación de jarabes, cosméticos y productos de higiene personal (Jones, 2001). Una de sus principales propiedades tecno-funcionales es su poder edulcorante debido a la alta concentración de carbohidratos (más del 95%), destacando la fructosa y glucosa, aunque también se han identificado otros oligosacáridos en menor concentración (Bogdanov, Jurendic, Sieber & Gallmann, 2008). Entre sus compuestos con actividad biológica se reportan los fenólicos, los ácidos orgánicos, los aminoácidos y las proteínas (Baltrusaityté, Venskutonis & Ceksteryté, 2007). La composición de la miel está estrechamente relacionada con la especie de abeja que la produce y el origen geográfico y floral, lo que genera variedad de olores, sabores, colores, así como propiedades funcionales y terapéuticas, entre las que se encuentran las antimicrobianas, antifúngicas y antivirales (Kujumgiev et al., 1999; Viuda-Martos, Ruiz-Navajas, Fernández-López & Pérez-Álvarez, 2008; Silici, Sagdic & Ekici, 2010; Alzahrani et al, 2012; Anthimidou & Mossialos, 2013).
Además de la miel producida por A. mellifera, existen otro tipo de mieles que son producidas por abejas sin aguijón pertenecientes a la tribu Meliponini (Amin et al., 2018). A nivel mundial, se conocen aproximadamente 400 especies de abejas, ubicadas en 50 géneros, su distribución se encuentra en las regiones tropicales y subtropicales del mundo. En México, se reporta la presencia de 46 especies principalmente en los estados de Yucatán, Chiapas, Tabasco, Puebla, Colima, Guerrero y Veracruz, sin embargo, son pocos los estudios reportados sobre sus mieles. En Tabasco, actualmente se está realizando un esfuerzo por retomar la meliponicultura (Aldasoro, Arnold & Burguete, 2015). En 2018 se registraron 101 meliponicultores en 15 de los 17 municipios del estado, destacandoTenosique con el 37% del total registrado. El mayor número de colmenas corresponde a Melipona beecheii, de hecho, entre los meliponinos es la más reconocida y estudiada (Chan, Aldasoro, Sotelo & Vera, 2018). Otras especies reportadas son: Nannotrigona perilampoides, Frieseomelitta nigra, Trigona fulviventris, Scaptotrigona mexicana y algunas especies del género Plebeia sp. (Ayala, Gonzalez & Engel, 2013; Cauich, Ruiz- Ruiz, Ortiz & Segura, 2015).
En estas mieles también destaca la presencia de compuestos fenólicos, que confieren propiedades sensoriales, como olor, sabor y color característicos, además de actividades biológicas, entre otras, antioxidante que les permite actuar como agentes reductores, donar iones de hidrógeno o quelar metales (Islam, Pervin, Hossain, Saha & Hossain, 2017). También se ha propuesto que tienen actividades biológicas contra diversas patologías actuando como agentes antibacterianos, anticancerígenos, antiinflamatorios, antivirales, antialérgicos, estrogénicos e inmunoestimulantes (Viuda-Martos, Ruiz-Navajas, Fernández-López & Pérez-Álvarez, 2008; Amensour, Sendra, Abrini, Pérez-Álvarez & Fernández-López, 2010). En México, la meliponicultura ha sufrido un proceso de abandono como resultado de cambios en los factores culturales, económicos y ecológicos, sin embargo, ahora se pretende recuperar esta práctica (Quezada-Euán, de Jesús May-Itzá & González-Acereto, 2001), lo que beneficiaría en primera instancia al ecosistema debido a la actividad polinizadora de las abejas, impactaría positivamente en la economía de los productores, ya que esta miel es bien cotizada en el mercado y fomentaría la conservación del patrimonio biocultural del país. El objetivo de este trabajo fue determinar el origen floral, la concentración de proteína soluble y de compuestos fenólicos, así como la actividad antioxidante y quelante de las mieles de M. beecheii y F. nigra, producidas en Tenosique, Tabasco, México.
Materiales y métodos
Se utilizaron mieles de M. beecheii (MB) y de F. nigra (FN) cosechadas en el mes de febrero del 2017 en la comunidad San Marcos, Tenosique, Tabasco, México (18°20'38"N, 91°20'56" W). Para la extracción de la miel, se destaparon las colmenas y se eligieron potes completamente cerrados, a los que se les introdujo una jeringa equipada con aguja de acero inoxidable, para succionar la miel. Después de la extracción, la miel se colocó en recipientes de vidrio color ámbar, herméticamente cerrados para proceder a su análisis.
Análisis mesopalinológico
Se realizó el análisis mesopalinológico (origen floral) por el método modificado de Erdtman (1969). Los granos de polen recuperados fueron descritos e identificados utilizando la colección de referencia del Laboratorio de Palinología: Paleopalinología y Actuopalinología depositada en el Instituto de Geología, de la Universidad Nacional Autónoma de México y mediante catálogos de polen (Ramírez-Arriaga & Martínez-Hernández, 2007). Se contaron 500 granos de polen para calcular los porcentajes para cada taxón.
Cuantificación de proteínas solubles
La cuantificación de proteínas solubles se realizó de acuerdo con el método de Bradford (1976) adaptado a microplacas (Zor & Selinger, 1996). 1 g de miel se diluyó en 10 mL de agua destilada (100 mg/mL), de esta solución se tomaron 50 μL y se mezclaron con 150 μL del reactivo de Bradford (Sigma, No.cat B6916). La solución se incubó a 37 °C/10 min y se leyó la absorbancia a 595 nm. Se realizó una curva estándar (0-100 μg/mL) usando albúmina sérica bovina como proteína de referencia.
Determinación de compuestos fenólicos totales
La concentración de compuestos fenólicos totales se determinó mediante el método de Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi, 1965) adaptado a microplacas (Oomah, Cardador-Martínez & Loarca-Piña, 2005). Para la cuantificación de estos compuestos se preparó una solución de 100 mg/mL de miel en metanol acidificado al 1% con HCl; se tomaron 20 μL de esta solución y se mezclaron con 100 μL del reactivo Folin-Ciocalteu (diluido 1:2 con agua destilada) y se combinaron con 80 μL de Na2CO3 (10%). La mezcla se incubó, protegida de la luz a temperatura ambiente durante 30 min, se leyó la absorbancia a 760 nm y el cálculo se realizó por comparación con una curva de calibración utilizando ácido gálico como estándar de referencia. Los resultados se expresaron en mg equivalentes de ácido gálico/100g.
Actividad quelante de Fe2+ y Cu2+
La actividad quelante del Fe2+ se determinó mediante la formación del complejo Fe2+-ferrocina que genera un color cuyo pico máximo de absorción es a 562 nm (Carter, 1971). La miel fue diluida con agua destilada (100 mg/mL) y se tomaron 20 μL de esta dilución, misma que fue mezclada con 200 μL de una solución compuesta por 100 mM de acetato de sodio (pH 4.9) y 30 μL de FeCl2 (p/v), y se incubó a 23 °C durante 30 min, al término de los cuales se adicionaron 12.5 μL de ferrocina 40 mM.
Para determinar la actividad quelante de Cu2+,20 μL de miel diluida con agua destilada (100 mg/mL) fue mezclada con 290 μL de un buffer de acetatos (50 mM, pH 6.0), 6 μL de pirocatecol violeta 4 mM y 10 μg de CuSO4«5H2O (Saiga, Soichi & Nishimura, 2003). El cambio de color fue medido a 632 nm. Los resultados de ambas técnicas fueron comparados con ácido etilen diamino tetra acético (EDTA) como estándar, con una concentración de 100 μg/mL y fueron calculados utilizando la siguiente ecuación:
% de actividad quelante = Abs control-Abs muestra/Abs control x100
Actividad antioxidante Método DPPH y ABTS
El efecto de las muestras de miel analizadas sobre la neutralización de radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). Se determinó de acuerdo con Udenigwe, Lu, Han, Hou & Aluko, (2009), de la siguiente manera: 40 μL de la solución acuosa de miel (1 g/mL) fueron colocados en placas de 96 pozos y se añadieron 160 μL de DPPH (100 μM). Las microplacas se incubaron a temperatura ambiente protegidas de la luz por 30 min. La decoloración fue medida a 515 nm en un lector de microplacas. La actividad antioxidante se percibe con la pérdida de la coloración y se reporta como el porcentaje de inhibición del radical.
La decoloración del radical ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico (ABTS) provocado por la interacción con especies donantes de hidrógeno o de electrones, fue determinada de acuerdo con el método reportado por Re, Pellegrini, Proteggente, Pannala, Yang & Rice-Evans (1999). El radical se generó por medio de la reacción del ABTS (7 mM) con K2S4O8 (2.45 mM) en 10 mL de agua destilada, e incubado por 17 h en oscuridad, a temperatura ambiente. Posteriormente se ajustó la concentración para que a 734 nm, la absorbancia fuera de 0.7, finalmente se adicionaron 180 μL de la solución de ABTS+ y 20 μL de las muestras de miel (1 g/ mL). La absorbancia fue medida al tiempo cero y seis minutos después, los resultados se reportaron como el porcentaje de inhibición del radical de acuerdo con la siguiente fórmula.
% de inhibición = Abscontrol-Absmuestra/Abscontrol x100
Atrapamiento del radical hidroxilo (ARH)
Para determinar la actividad de atrapamiento del radical hidroxilo de las muestras de la miel se utilizó el método descrito por Li, Jiang, Zhang, Mu & Liu, (2008), adaptado a microplacas. Para ello 40 μL de la muestra de miel diluida (1g/mL) se mezclaron con 50 μL de 1,10-fenantrolina (2 mM), 50 μL de sulfato ferroso (FeSO4, 2 mM), 30 μL de buffer de fosfatos (0.2 M, pH 7.4), y 50 μL de peróxido de hidrógeno (0.01%). La mezcla fue incubada a 37 °C/60 min y las absorbancias fueron medidas a 536 nm. Los resultados fueron determinados de acuerdo con la siguiente fórmula:
ARH (%) = (As-A1)/A0-A1)
Donde: As= absorbancia de la muestra, A1= Absorbancia del control de la solución de 1,10-fenantrolina, FeSO4 y H2O2; A0= Absorbancia del blanco que contiene 1,10 fenantrolina y FeSO4.
Radical superóxido
La actividad de inhibición del radical superóxido (O2 -) se determinó mediante la inhibición de la autooxidación del pirogalol, descrita por Marklund & Marklund (1974) cuyo fundamento se basa en la polimerización de O2 - inducida por pirogalol, desarrolla un compuesto colorido que se lee a 320 nm y es estable durante 4 min a 23 °C. Para ello, se mezclaron 80 μL de Tris-HCl, 50 mM (pH 8.3), 40 μL de EDTA 1 mM y 1.5 mM pirogalol disuelto en HCl, 10 mM y las muestras de prueba. Los resultados se expresan como el porcentaje de inhibición de la oxidación del pirogalol mediante la diferencia entre la presencia y ausencia de pirogalol en las muestras.
Análisis estadístico
Todos los análisis se realizaron por triplicado y se reportó el promedio de estas determinaciones ± error estándar. Para determinar si hubo diferencias estadísticas (p<0.05) significativas entre los diferentes tratamientos se realizó un ANOVA y una comparación de medias de Tukey utilizando el software estadístico Statgraphics centurion®.
Resultados
Origen floral
La miel proveniente de M.beecheii se clasificó como monofloral de Eugenia sp. (72.8%). Otras especies encontradas en esta miel fueron Lonchocarpus sp. (5.9%), Mimosa púdica 4.3%) y Zizipus sp. (2.3%), mientras que la miel de F. nigra se clasificó como multifloral o polifloral destacando la presencia de Piper sp. (31.9%), aff. Brosimum sp. (19.0%), y de la familia Asteraceae (12.9%), otras especies encontradas fueron Zizipus sp. (7.2%) y Haematoxylum campechianum L. (6.9%).
Concentración de proteínas y compuestos fenólicos
El análisis de proteína permitió determinar que las mieles de M. beecheii y F. nigra presentaron concentraciones de 214± 26 y 592 ± 15 mg de proteína soluble/100 g, respectivamente. Otros compuestos importantes en las mieles, que también dependen del origen floral, son los compuestos fenólicos cuyo contenido en mieles de M. beecheii y F. nigra estudiadas fue de 48.53 ± 3.92 y 170 ± 8.7 mg equivalentes de ácido gálico/100 g de miel, respectivamente.
Actividad quelante de Cu2+ y Fe2+
Los valores obtenidos al determinar la actividad quelante de metales en las mieles se observa en la Figura 1. La miel de M. beecheii presentó una mayor capacidad para quelar Fe2+ (93.76%), apenas por debajo del EDTA (98.26%), que de Cu2+ (32.64%), mientras que la miel de F. nigra tuvo mayor
capacidad para quelar el Cu2+ (85.37%), que Fe2+ (47.34%), el porcentaje de quelación del EDTA para el Cu2+ fue de 93.68%.
Capacidad antioxidante
El porcentaje de inhibición para el atrapamiento de los radicales estudiados se puede observar en la Figura 2, la cual muestra que la miel de F. nigra tuvo mayor capacidad para neutralizar los radicales DPPH y O2 -, que la miel de M. beecheii, en cuanto a la inactivación de los radicales ABTS·+ e hidroxilo no se encontró diferencia significativa entre las mieles analizadas, pero ambas tuvieron mayor capacidad para neutralizar el radical OH.
Figura 2 Actividad antioxidante (% de inhibición) de mieles de M. beecheii y F. nigra, colectadas en San Marcos, Tenosique, Tabasco, México, 2017. Los resultados representan la media de tres repeticiones ± EE., representa diferencia significativa (p<0.05), ANOVA y una comparación de medias de Tukey.
Discusión
Aunque ambas colmenas se ubican en el mismo lugar geográfico, cada especie mostró predilección por diferentes especies florales. La miel proveniente de M. beecheii se clasificó como monofloral, ya que presenta más del 45% de polen de una misma especie, mientras que la miel de F. nigra se caracterizó como multifloral o polifloral debido a que tres taxas se presentan con porcentajes > 10% (Ramírez-Arriaga, Navarro-Calvo & Díaz-Carbajal, 2011). El origen floral de la miel determina, además del sabor y color, otras propiedades como la concentración de proteínas, aminoácidos libres y compuestos fenólicos, lo que a su vez confiere actividad biológica, antimicrobiana y antioxidante (Cimpoiu, Hosu, Miclaus & Puscas, 2013).
El contenido de proteínas en la miel es normalmente menor al 0.5%, en su mayoría son enzimas y aminoácidos libres (Álvarez-Suárez et al., 2010). La concentración de proteínas encontradas en las mieles analizadas fue similar a las encontradas para mieles comerciales de A. mellifera que varía de 217-631 μg proteína/g en mieles poliflorales y de 173-692 μg proteína/g para mieles monoflorales (Cimpoiu, Hosu, Miclaus & Puscas, 2013). Esta variación entre ambas mieles se debe al origen floral (Pirini, Conte, Francioso & Lercker, 1992). En general las mieles de origen multifloral presentan mayor contenido de proteína; otros factores que pueden influir sobre las propiedades de la miel son el área geográfica en que fue cultivada y el tipo de abeja productora (González, Gómez, Cordón, García-Villanova & Sánchez, 2006).
Además del valor nutricional, las proteínas pueden contribuir a la actividad antioxidante debido a la estructura de sus grupos funcionales (Elías, Kellerby & Decker, 2008). Por otro lado, las proteínas juegan un papel importante, principalmente las de origen catalítico como las enzimas (glucosidasa y catalasa), a las que se les atribuye actividad antimicrobiana relacionada con la producción sostenida de H2O2. La miel contiene aminoácidos libres, en especial prolina y bajas concentraciones de ácido glutámico, alanina, fenilalanina, tirosina, leucina e isoleucina (Chua, Lee & Chan, 2015).
En cuanto al contenido de compuestos fenólicos totales, la miel de M. beecheii se mostró por debajo del valor reportado para esta misma especie, proveniente de Yucatán, México, con 63.22 mg de equivalentes de ácido gálico/100 g de miel, de los cuales 3.61 mg son atribuidos al contenido de flavonoides y 3.16 mg/100 g a flavonoles (Ruiz-Ruiz, Matus-Basto, Acereto-Escoffié & Segura-Campos, 2017). Ambas mieles mostraron un contenido de flavonoides de entre 45.42 y 327 mg equivalentes de ácido gálico/100 g de miel, encontrándose dentro de los intervalos reportados para mieles de A. mellifera de origen monofloral (Gül & Pehlivan, 2018) por lo que se infiere que las mieles estudiadas podrían tener efectos biológicos similares. Los principales compuestos fenólicos reportados en la miel son los ácidos vanílico, cafeíco, siríngico, p-cumárico, ferúlico, elágico, 3-hidroxibenzoico, 4-hidroxibenzoico, clorogénico, gálico, benzoico, además de quercetina, kaempferol, miricetina, pinobansquina, pinocembrina, crisina, galangina, ácido rosmárico y hesperetina, entre otros (Trautvetter, Koelling-Speer & Speer, 2009; Álvarez-Suárez et al., 2012). Aunque existen pocos reportes sobre la caracterización de miel de meliponinos, se ha informado sobre la presencia de quercetina, kaempferol, naringenina y luteolina en la miel M. beecheii; compuestos que son de importancia biológica, ya que son inductores del sistema antioxidante endógeno (Cauich, Ruiz-Ruiz, Ortiz & Segura, 2015). Con respecto a la actividad antioxidante, ambas mieles tuvieron mejor capacidad de atrapamiento del radical OH'implicado en el estrés oxidativo y relacionado con enfermedades crónico-degenerativas no transmisibles: enfermedades cardíacas, pulmonares, cáncer, Alzheimer y las enfermedades neurodegenerativas en los seres humanos (Varadharaj et al., 2017). Por ello es importante identificar aquellos alimentos que puedan neutralizar estos radicales. Ambas mieles tienen también capacidad de neutralizar al radical O2 -, identificado en diferentes procesos patológicos y en la muerte celular asociada a la oxidación de DNA, proteínas, lípidos (Patlevic, Janka, Pavol, Ladislav & Pavol, 2016). La quelación de metales por la miel ha sido poco reportada y en este trabajo se evidenció que ambas mieles estudiadas quelan el fierro y el cobre. Que, Linchun & Xiaojie (2007) reportaron que los compuestos fenólicos provenientes de flores tenían capacidad de quelar Fe2+, con concentraciones entre 40-160 μg/mL de extracto etanólico. Por otro lado, se ha propuesto que los péptidos (fragmentos de proteína de bajo peso molecular) son capaces de quelar cobre (90.6%) y el hierro (51.8%), efecto correlacionado con el contenido de aminoácidos antioxidantes His, Arg, Tyr y Phe (Gallegos-Tintoré, Chel, Corzo-Ríos & Matínez, 2013).
Como se mencionó anteriormente, la miel contiene tanto compuestos fenólicos como proteínas, que podrían conferirle la capacidad de quelar los metales y con ello la función biológica.
Conclusiones
Cada especie de abeja es atraída por diferentes especies florales, el contenido de compuestos fenólicos y proteínas de la miel se relaciona con la especie de abeja que la produjo y su origen floral. La miel polifloral tiene mayor concentración de compuestos fenólicos y proteínas solubles lo que podría deberse a mayor cantidad y diversidad de polen. La miel de M. beecheii, presentó menor concentración de compuestos fenólicos y proteínas solubles; pero mostró actividad antioxidante contra los radicales estudiados, en especial contra el hidroxilo, así como la quelación del ion Cu2+.
Este trabajo constituye además un acercamiento a la determinación del potencial funcional de la miel de dos especies de abejas sin aguijón en el estado de Tabasco. Con base en los resultados obtenidos y la prometedora capacidad antioxidante, se sugiere continuar la investigación de las propiedades de estas mieles y de otras especies de abejas sin aguijón, su composición, su perfil de origen floral, sus compuestos fenólicos e identificar otras moléculas que podrían conferir esta actividad, además de hacer pruebas en líneas celulares y/o modelos animales, buscando con esto determinar su potencial como agente quimiopreventivo contra enfermedades crónico degenerativas.
