Material biológico

Los hongos en estudio fueron previamente aislados e identificados de aguacates (Persea americana Mill) infectados. Las cepas de C. acutatum y C. gloeosporioides se mantuvieron en medio agar papa dextrosa (APD, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) a 25 °C (^{Ramos-Guerrero et al., 2018}).

Preparación de soluciones Quitosano

Las soluciones de quitosano se prepararon al 0.1, 0.5 y 1.0% de la siguiente manera: se realizaron soluciones disolviendo 0.1, 0.5 y 1.0 g de quitosano peso molecular medio (cp = 590, desacetilación al 75-85%) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), en 100 mL de ácido acético al 2% (v/v), se agitó por 24 horas a temperatura ambiente, las soluciones se ajustaron a pH de 5.5 agregando NaOH al 1N, se añadieron 100 μL de Tween 80 (^{El Ghaouth, Arul, Grenier & Asselin, 1992}).

Se esterilizaron las soluciones de quitosano por separado. Posteriormente, se preparó el medio APD de acuerdo a las instrucciones del proveedor, para mezclarlo con el quitosano a distintas concentraciones (0.1, 0.5 y 1.0%); lo obtenido se vació en diferentes cajas Petri y una vez solidificado se procedió a inocular este medio con los hongos de estudio, seguido de la evaluación de su crecimiento. El tratamiento control consistió en cajas Petri con medio APD sin quitosano.

Aceites esenciales de canela y eucalipto

Los aceites esenciales de eucalipto (Pronaur®, Guadalajara México, https://pronaur.negocio.site/) y canela (Pronaur®, Guadalajara México, https://pronaur.negocio.site/), se adquirieron en un centro de productos naturistas. Los aceites esenciales como parte de los tratamientos aplicados se prepararon de la siguiente manera: el medio de cultivo APD se esterilizó y cuando disminuyó su temperatura se mezcló con los aceites esenciales (canela y eucalipto) cada uno a las diferentes concentraciones evaluadas (0.1, 0.5 y 2.0%), una vez solidificados se utilizaron como medio de cultivo, inoculando los hongos de estudio. Por su parte el tratamiento control consisitió en un medio de cultivo APD sin aceites esenciales. Una vez determinada la concentración de aceite esencial con mayor actividad antifúngica, ésta se utilizó para la combinación con quitosano a bajas concentraciones. Con el fin de evaluar la efectividad de la combinación del quitosano con aceites esenciales se llevó a cabo el siguiente protocolo: se esterilizaron por separado el medio de cultivo APD y el quitosano, después se mezclaron, al disminuir la temperatura a 28 °C se incorporó cada aceite esencial al 2% y el quitosano a las diferentes concentraciones evaluadas (0.1 y 0.5%), una vez solidificado el medio de cultivo en la campana de flujo laminar, se inoculó con los hongos de estudio. El tratamiento control consistió en un medio de cultivo (APD) sin aceites esenciales ni quitosano.

Análisis de efectividad in vitro Evaluación de la inhibición del crecimiento micelial

En el medio de cultivo APD y utilizando un sacabocados se tomó un disco de 7mm de diámetro que contenía el micelio de cada uno de los hongos de estudio (con crecimiento activo de diez días), para inocularlos en el centro de las cajas de Petri que contenían los tratamientos descritos en el párrafo anterior, estas cajas fueron incubadas a 25 °C; el diámetro micelial se midió con un vernier (Truper^®) cada 24 horas durante 10 días. Los resultados se reportaron como porcentaje de inhibición en comparación con el control aplicando la fórmula propuesta por ^{Fagundes, Pérez-Gago, Monteiro & Palou (2013}).

Evaluación de la inhibición de la germinación de esporas

La efectividad de los tratamientos se evaluó de la siguiente manera: se cuadriculó el medio APD que contenían los tratamientos descritos, cada cuadro de 1 cm χ1 cm; y se preparó una suspensión de esporas empleando la metodología propuesta por ^{González-Estrada, Calderón-Santoyo, Ragazzo-Sánchez, Peyron & Chalier (2018}) a una concentración de 1x10⁶ esporas/mL, posteriormente se tomaron alícuotas de 20 μL para verterlas en los cuadros mencionados. Finalmente el medio APD inoculado se colocó en el microscopio para observar la germinación de las esporas. El conteo de la germinación de las esporas se realizó cada hora durante doce horas a partir de la inoculación, empleando un microscopio (Motic BA 300) a 40x en muestras de 200 esporas. Las esporas se consideraron germinadas cuando la longitud del tubo germinativo fue el doble del diámetro de la misma (^{Yao, Tian & Wang, 2004}). El control consistió en medio APD inoculado.

Esporulación

En la evaluación de la esporulación se utilizaron las mismas cajas Petri donde se midió el crecimiento micelial empleando el protocolo propuesto por ^{Ramos-Guerrero et al. (2018}). El procedimiento fue el siguiente: se agregaron 10 mL de agua destilada estéril a las cajas Petri y en consecuencia se raspó la superficie con ayuda de una varilla de vidrio estéril, posteriormente se filtró el contenido empleando una gasa para separar el micelio; enseguida se tomaron 100 μL de la solución filtrada y se vertieron en la cámara de Neubauer (Loptik labor®). El conteo se llevó a cabo empleando un microscopio óptico a 40x. Los resultados se expresaron en número de esporas/mL.

Análisis estadístico

El análisis se realizó utilizando cinco cajas de Petri por tratamiento con tres repeticiones. Cada experimento se realizó por duplicado, utilizando un diseño de bloques completamente al azar. Los datos se sometieron a análisis de varianza (ANOVA) y se utilizó una prueba de Tukey (P<0.05) para la comparación de medias, empleando el paquete estadístico SAS versión 9.4.

Efecto del quitosano sobre el crecimiento in vitro de C. acutatum y C. gloeosporioides

Los resultados del crecimiento micelial de los fitopatógenos se muestran en la Tabla I. Se observa una disminución del crecimiento micelial con respecto al control, con quitosano al 1.0% de tan solo un 17 y 21% de inhibición para C. acutatum y C. gloeosporioides, respectivamente. La germinación (Tabla I) fue totalmente inhibida con las diferentes concentraciones de quitosano evaluadas. Se observó diferencia significativa (P<0.05) entre los tratamientos para todos los parámetros evaluados (crecimiento micelial, germinación y esporulación). El efecto en la inhibición del desarrollo del micelio puede atribuirse primero al ablandamiento de la pared celular, con la posterior interacción del biopolímero (carácter catiónico) con la membrana plasmática, el cual provoca un cambio en la permeabilidad debido a que los grupos amino libres, cargados positivamente en medio ácido, interactúan con los residuos negativos de las macromoléculas expuestas en la pared celular del hongo, afectando también la entrada de nutrientes y afectando su desarrollo micelial (^{Romanazzi, Feliziani, Baños & Sivakumar, 2017}; ^{Verlee, Mincke & Stevens, 2017}; ^{Tovar, Chaves-Lopez, Serio, Rossi & Paparella, 2018}). Lo anterior fue recientemente reportado por ^{Ramos-Guerrero et al. (2018}) al evidenciar por microscopía electrónica de barrido hifas de C. gloeosporioides distorsionadas, presencia de nódulos, adelgazamiento de la pared celular y reducción del diámetro de las hifas expuestas al quitosano (1.0%) de peso molecular medio. Sin embargo, la efectividad de los resultados de esta investigación son inferiores a lo reportado por Ramos-Guerrero et al. (2018), debido a que las concentraciones de 1.0% de quitosano logran una inhibición del 100% en el desarrollo de C. gloeosporioides aislado de guanábana. En este sentido, existen reportes de baja efectividad del quitosano dependiendo de la cepa evaluada (^{Hosseinnejad & Jafari, 2016}), como es el caso de Colletotrichum sp. aislado del plátano (Musa sapientum) en el cual sólo se obtuvo un 49% de inhibición del crecimiento micelial empleando quitosano de medio peso molecular (^{Gutierrez-Martinez et al., 2018}). Para hongos resistentes, el quitosano es incapaz de permeabilizar la membrana celular y permanece en la superficie externa. ^{Palma-Guerrero et al. (2010}), mencionan que la resistencia de los hongos al quitosano se debe a que el biopolímero es incapaz de alterar la membrana celular, debido a la composición de fosfolípidos de la membrana. En su estudio demostraron que la disminución en la actividad del quitosano estaba relacionada con una menor cantidad de ácidos grasos insaturados en la membrana celular, por lo tanto la fluidez de la membrana afecta la actividad del quitosano y el mecanismo de acción depende en gran medida de la composición de los hongos. Por otra parte, el proceso de germinación de las esporas requiere de la ruptura de la latencia de la espora, y una serie de procesos que dan lugar a la formación de tubos germinativos, por lo que se requiere de la participación de enzimas (^{Barhoom & Sharon, 2004}). En este sentido, el quitosano actúa como agente quelante; secuestrando metales esenciales (Mg²⁺ y Ca²⁺), minerales o nutrientes esenciales inhibiendo las reacciones enzimáticas del patógeno (Tovar, Chaves-Lopez, Serio, Rossi & Paparella, 2018), causando alteraciones en la morfología de las esporas, inhibiendo el proceso de germinación, previamente reportado por ^{Ramos-Guerrero et al. (2018)}. Para C. gloeosporioides la producción de esporas es de importancia fundamental debido a que permitirá su diseminación y posterior infección (^{Ansari et al., 2018}). Los resultados muestran que para C. acutatum se disminuyó la producción de esporas en un rango de 4.00 χ 10⁷ a 9.50 χ 10⁶ esporas/mL, en comparación con el control sin tratamiento (4.11 χ 10⁷ esporas/mL) y para C. gloeosporioides en un rango de 4.02 χ 10⁴ a 9.50 χ 10³ esporas/mL) comparado con el control sin tratamiento (2.65 χ 10⁵ esporas/mL). Los resultados de esta investigación en la esporulación coinciden con lo reportado por Ramos-Guerrero et al. (2018) aplicando quitosano de peso molecular medio al 1.0%. Estos resultados podrían estar relacionados con la alteración en las estructuras reproductivas inducidos por el quitosano y previamente reportado por Ramos-Guerrero et al. (2018).

Efecto de los aceites esenciales de eucalipto y canela sobre el crecimiento in vitro de C. acutatum y C. gloeosporioides

El crecimiento micelial fue mayormente inhibido mediante la aplicación de aceite esencial de canela (al 2%) y en el hongo C. gloeosporioides se obtuvo un 50% de inhibición (Figura 1). Para el caso de C. acutatum los resultados muestran tan solo un 39% de inhibición. Se observó diferencia significativa (P<0.05) entre los tratamientos. En este sentido, se ha reportado que la efectividad de los aceites esenciales es mayor cuando se aplican en la fase gaseosa que en la fase líquida, lo que podría explicar la baja inhibición en las cepas evaluadas (^{Perumal, Sellamuthu, Nambiar & Sadiku, 2016}). La actividad antifúngica de los aceites esenciales depende tanto de las características fisicoquímicas de sus componentes, como de sus grupos funcionales (fenoles, terpenos, alcoholes y cetonas) y del efecto sinérgico entre sus componentes (^{Calo, Crandall, O'Bryan & Ricke, 2015}; ^{Taghavi, Kim & Rahemi, 2018}). En el caso del aceite esencial de canela, está reportado por ^{He et al. (2018}) que sus componentes afectan la integridad de la pared y membrana celular de C. acutatum modificando su estructura de manera irreversible, con la consecuente liberación de contenido celular como proteínas solubles, azúcares y ácidos nucleicos; el daño celular es dependiente de la concentración de aceite de canela utilizado, coincidiendo con los resultados de esta investigación. Para C. gloeosporioides se ha reportado que los compuestos lipofílicos en el aceite esencial de canela tienen la capacidad de penetrar y reducir la pared celular, afectando el tamaño de las hifas, causando un daño extensivo en la membrana celular; por otro lado alteran la actividad enzimática afectando la producción de proteínas y de energía (Perumal, Sellamuthu, Nambiar & Sadiku, 2016; ^{Rabari, Chudashama & Thaker, 2018}). El aceite esencial de eucalipto por su parte mostró una baja capacidad de inhibición en ambas cepas evaluadas, estos resultados coinciden con estudios previos (^{Combrinck, Regnier & Kamatou, 2011}; ^{España, Arboleda, Ribeiro, Abdelnur & Guzman, 2017}).

Figura 1 Efecto de los aceites esenciales en el crecimiento micelial. A) canela y B) eucalipto incubado a 25 °C durante 10 días. Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos (P<0.05). 

Efecto de la combinación de quitosano con aceites esenciales sobre el crecimiento in vitro de C. acutatum y C. gloeosporioides

La combinación de quitosano (0.5%) con aceite esencial de canela fue totalmente efectiva para evitar el crecimiento micelial de C. gloeosporioides y C. acutatum (100%) (Figura 2 y 3). La germinación fue totalmente inhibida aplicando la mayor concentración de quitosano (Tabla II). Por su parte la esporulación disminuyó con los tratamientos aplicados: Para C. acutatum en un rango de 2.98 χ 10⁷ a 2.17 χ 10⁷ esporas/mL en comparación con el control sin tratamiento (3.23 χ 10⁷ esporas/mL) y para C. gloeosporioides en un rango de 3.62 χ 10⁴ a 3.03 χ 10⁴ esporas/mL en comparación con el control sin tratamiento (1.91 χ 10⁵ esporas/mL) (Tabla II). Se observó diferencia significativa (P<0.05) entre los tratamientos. Existen reportes que indican que los aceites esenciales alteran la superficie y la estructura de la pared celular de los hongos, por su parte el quitosano puede alterar la síntesis de la pared celular causando liberación de contenido celular; afectando el desarrollo y supervivencia del patógeno (^{Mohammadi, Hashemi & Hosseini, 2015}).

Figura 2 Crecimiento micelial de hongos tratados con quitosano y en combinación con: A) canela y B) eucalipto incubado a 25 °C durante 10 días. Control: cajas Petri sin tratamientos, Q: quitosano, AE: aceite esencial. 

Figura 3 Efecto de la combinación del quitosano con aceites esenciales en la inhibición del crecimiento micelial. A) canela y B) eucalipto incubado a 25 °C durante 10 días. Letras diferentes indican diferencias significativas entre las concentraciones (P<0.05). 

La efectividad antimicrobiana del quitosano con el aceite esencial de canela ha sido previamente mencionado por (^{Ojagh, Rezaei, Razavi & Hosseini, 2010}). Los resultados reportados por ^{Ojagh, Rezaei, Razavi & Hosseini (2010)} coindicen con lo citado en esta investigación, al encontrar que la sola aplicación de quitosano no es suficiente para el control de Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sakei y Pseudomonas fluoresceins; debido a que el control microbiano efectivo se logró con la combinación del biopolímero y el aceite esencial de canela (al 2%). En este estudio, además se demostró que el aceite esencial de canela incorporado en la matriz polimérica del quitosano es capaz de difundirse, lo cual es promisorio considerando su potencial aplicación en frutos para el control de enfermedades. Sin embargo, aun cuando la actividad antimicrobiana del quitosano puede mejorarse con la formación de complejos con otros aditivos, con la aplicación del quitosano (0.5%) y el aceite esencial de eucalipto (2%) tan solo se obtuvo un 24% de inhibición del crecimiento micelial (Figura 3). En este sentido, en investigaciones previas se ha mencionado que la eficacia de la actividad antifúngica del quitosano en combinación con aceites esenciales depende no sólo de la capacidad de liberación del aceite esencial de la matriz del biopolímero y la cepa evaluada, sino también del aceite esencial utilizado con respecto a su polaridad, estructura química y la formación de entrecruzamientos entre moléculas (^{Mohammadi, Hashemi & Hosseini, 2015}; ^{Tovar, Chaves-Lopez, Serio, Rossi & Paparella, 2018}). Los resultados sugieren que la combinación del quitosano con el aceite esencial de eucalipto afecta la eficacia tanto del quitosano como del aceite esencial.