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Introducción
Las películas orales son matrices compuestas generalmente por polímeros, se les considera un nuevo sistema de liberación de fármacos, que además de ser eficaces están orientadas al paciente y representan una alternativa a las formas de dosificación sólidas tradicionales (comprimidos o cápsulas) especialmente para pacientes con disfagia (dificultad para deglutir) (Castro et al., 2015; Gupta & Kumar, 2020). También son definidas como láminas delgadas que se colocan en la cavidad bucal, de una o más capas y que pueden o no contener un ingrediente activo (USP, 2017). Actualmente ha crecido el interés en el uso de polímeros naturales para el desarrollo de películas orales, como los alginatos, por ser biocompatibles, de nula toxicidad y fácil disponibilidad, su aplicación se extiende desde pequeñas moléculas químicas hasta proteínas macromoleculares (Santos, Correia, Silva & Mano, 2018).
El uso de estos polímeros permite el desarrollo de películas orales ultradelgadas consideradas así por su grosor que ronda entre 50 y 150 µm, esto les ayuda a disolverse rápidamente en contacto con la saliva mejorando la absorción de los compuestos activos, los cuales pueden ser sintéticos o de fuentes naturales como los extractos de las plantas medicinales (Alshhab & Yilmaz, 2020; Bodini, Pugine, de Melo & de Carvalho, 2020; Gupta et al., 2020). Las películas ultradelgadas se integran, sin problema, con los extractos de las plantas en comparación a otros sistemas de liberación que solo admiten un componente, esto es de suma importancia debido a que el efecto terapéutico de algunas plantas medicinales se debe al sinergismo de sus múltiples metabolitos y en ocasiones su purificación o separación puede conducir a una pérdida parcial o completa de la actividad (Kesarwani & Gupta, 2013), por ejemplo, el extracto de la planta Agastache mexicana usado contra el insomnio, tiene un mayor efecto hipnótico que el flavonoide (tilianina) al que se le atribuye esta característica (González-Trujano, Ponce-Muñoz, Hidalgo-Figueroa, Navarrete-Vázquez & Estrada-Soto, 2015). Además, la administración de compuestos activos a través de películas ultradelgadas tiene ciertas ventajas frente a las formas líquidas, como una dosificación más cómoda y precisa, ya que no es necesaria su agitación y medición antes de la ingesta, es práctica y se puede usar de manera segura incluso cuando no se tiene acceso al agua (Özakar & Özakar, 2021).
Las películas orales ultradelgadas representan una posible forma de administración de los extractos de A. mexicana con efecto hipnótico para tratar problemas de insomnio, sin embargo, las propiedades fisicoquímicas características de las películas ultradelgadas pueden verse afectadas después de la incorporación de los compuestos bioactivos, sobre todo cuando se emplean moléculas complejas como las de los extractos naturales (fenoles, flavonoides, taninos, alcaloides, etc.), por lo tanto es necesario caracterizar sus propiedades para asegurar su integridad y evaluar su capacidad como sistema de administración de extractos con actividad terapéutica (Bodini et al., 2020; Tedesco, Monaco-Laurenço & Carvalho, 2017).
Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue desarrollar y caracterizar fisicoquímicamente películas ultradelgadas de alginato de sodio antes y después de la adición de los extractos de Agastache mexicana mexicana y Agastache mexicana xolocotziana, así como la evaluación del efecto hipnótico para corroborar que se mantenga inalterable.
Materiales y métodos
Materiales vegetales
Las plantas A. mexicana ssp. mexicana (Kunth) Lin & Epling y A. mexicana ssp. xolocotziana Bye, Linares & Ramamoorthy fueron adquiridas en el “Mercado de Sonora” de la Ciudad de México e identificadas en el Herbario Medicinal del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) con el número de registro 16,257 y 16,259, respectivamente.
Preparación de los extractos de A. mexicana mexicana y A. mexicana xolocotziana
Se llevó a cabo una extracción sólido líquido de acuerdo con la metodología modificada de Hernández-Abreu et al. (2011), por lo que en 250 mL de etanol se vertieron 20 g de A. mexicana mexicana (AM) y A. mexicana xolocotziana (AX) secas y molidas. Se mantuvieron en agitación a temperatura ambiente por 24 horas y posteriormente se removieron los sólidos. Se realizó un proceso de microfiltración, empleando un módulo de filtración Mintrech (modelo Fiber flow) de 0.05 micras.
Obtención de películas orales
Las películas se obtuvieron con la técnica solvent casting, al preparar 15 mL de una solución de alginato de sodio al 1.5%, en agitación durante 24 horas. Las soluciones se depositaron en moldes de teflón de 30 cm2 y se secaron en una estufa de vacío a 45 °C y 15 inHg. Las películas con extractos se obtuvieron al adicionar 1mg de sólidos de extracto por mL de solución de alginato de sodio.
Caracterización de las películas orales
Aspecto visual
Las películas se evaluaron en el inicio visualmente para detectar posibles alteraciones después de la incorporación de los extractos de Agastache mexicana.
Microscopía electrónica de barrido
La estructura superficial de las películas fue observada a través de un microscopio electrónico de barrido JEOL JCM-6000 plus. Las películas se recubrieron con grafito coloidal para su procesamiento.
Microscopía de fuerza atómica
La topografía de la superficie de las películas de 225 µm cada una, se analizó con un Microscopio de Fuerza Atómica (diMultimode V conectado a un microcontrolador di Nanoscope V, Veeco, USA), escaneadas, usando el modo “tapping air” a una velocidad de escaneo de 1 Hz. Para procesar las imágenes se utilizó el software NanoScope Versión 1.5.
Grosor
El espesor de las películas se midió con un micrómetro digital (Big Horn) de una sensibilidad de 0.001 mm y fueron colocadas entre los palpadores del micrómetro, la medición se tomó en la primera indicación de contacto entre la película y los palpadores. De acuerdo con Ashikin, Wong & Law (2010), se realizaron 15 mediciones en distintos puntos de cada película.
Solubilidad
Para determinar el tiempo de solubilidad se adaptó la metodología propuesta por Dinge & Nagarsenker (2008). Las películas se colocaron en una canastilla y ésta en el centro de un vaso de precipitados de vidrio de 50 mL que contenía 20 mL de buffer de fosfatos pH 6.4, a 37 ± 0.5 °C y agitación a 100 rpm con un agitador magnético que no tocara la canastilla. Se tomaron alícuotas cada minuto y se midió la absorbancia a 205 nm para las películas de alginato y 560 nm para las películas de alginato con extractos, hasta obtener mediciones constantes.
Color
El color de las películas se midió con una esfera de integración en un espectrofotómetro (GBC, modelo Cintra 10), las mediciones se realizaron de acuerdo con el espacio de color CIE L*a*b* utilizando un observador de 2º y un iluminante A.
Propiedades mecánicas por nanoindentación
Las propiedades mecánicas de las películas orales de alginato se obtuvieron con un Nano-Hardness Tester (NHT) desarrollado por CSM Instruments (Suiza). Los parámetros empleados fueron; valor de carga máxima 5 mN, tiempo de pausa 10 s y velocidad de carga y descarga 15 mN/min. Se utilizó una punta de diamante piramidal y base triangular conocida como Berkovich.
Prueba de inducción al sueño con dosis hipnótica de pentobarbital sódico
Todos los animales fueron manipulados de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, la directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y la declaración de Helsinki sobre el bienestar de los animales en experimentación.
Para la prueba de potenciación de sueño inducido con pentobarbital sódico se utilizaron seis grupos de siete ratones macho CD1. Dos grupos fueron tratados con los extractos de A. mexicana mexicana (AM) y A. mexicana xolocotziana (AX) respectivamente, por vía oral a dosis de 100 mg/kg de peso del ratón. Dos grupos más fueron tratados con las películas que contenían los extractos de A. mexicana mexicana (AMF) y A. mexicana xolocotziana (AXF), por lo que se cortaron fragmentos de las películas para administrar la misma dosis de cada extracto. Como control, en un grupo se usó el fármaco clonazepam (CL) por vía intraperitoneal (0.5 mg/kg i.p.) y el último grupo no recibió tratamiento. Después de treinta minutos de administrar los tratamientos, a todos los ratones se les inyectó una dosis hipnótica de pentobarbital sódico (PB; 42 mg/kg i.p.) y se evaluó el tiempo en que tardaron en dormirse (pérdida del enderezamiento o latencia) y el tiempo que permanecieron dormidos (tiempo que tardan en recobrar el conocimiento y el equilibrio).
Análisis estadístico
A los resultados obtenidos de las pruebas de potenciación de sueño inducido con pentobarbital sódico se les aplicó un análisis de varianza de una vía (ANOVA), seguido de la prueba de Dunnett. Los valores de p<0.05 se consideraron significativos. El análisis se realizó con ayuda del software OriginLab 2015.
Resultados y discusión
Caracterización de las películas
Aspecto visual
Se formularon películas de alginato de sodio (SAF) delgadas, sin poros, sin fracturas visibles, translúcidas y sin color, con la incorporación de los extractos de A. mexicana mexicana (AM) A. mexicana xolocotziana (AX) (Figura 1), hubo un cambio de coloración a amarillo olivo, conservando su integridad física y al igual que las películas sin extracto presentaron un aspecto homogéneo, translúcido y sin problemas de adhesión al material en el que se elaboraron, por lo que no fue necesario el uso de plastificantes.
Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)
Debido a que las películas con y sin extracto mostraron un aspecto homogéneo, se decidió analizar su superficie mediante MEB con el fin de observar diferencias en la estructura y morfología superficial. En la micrografía de SAF (Figura 2a), se observó una superficie lisa y homogénea con ligeras marcas atribuidas al molde de teflón empleado para su formación. Por otra parte, después de la incorporación de los extractos, las películas AMF (Figura 2b) y AXF (Figura 2c) conservaron su estructura homogénea y ligeros relieves en la superficie, que de acuerdo con Bodini et al. (2020), se deben a la disminución en la compactación polimérica de la matriz, causados por los metabolitos de los extractos. En otras investigaciones se ha reportado que los extractos de plantas se distribuyen también de forma homogénea y al integrarse a las películas de alginato, mejoran su estructura interna y la apariencia es más uniforme (Bashir et al., 2018; Kim, Baek, Song & Bin, 2018; Synowiec et al., 2014).
Figura 2 Morfología superficial de las películas de alginato de sodio (SAF, a), alginato de sodio con extractos de Agastache mexicana mexicana (AMF, b) y alginato de sodio con Agastache mexicana xolocotziana (AXF, c) obtenidas mediante Microscopía Electrónica de Barrido, y de SAF (d), AMF (e) y AXF (f) obtenidas por Microscopía de Fuerza Atómica.
Microscopía de Fuerza Atómica (MFA)
Como un complemento al estudio de la morfología superficial de las películas se empleó la MFA, donde las imágenes topográficas obtenidas (Figura 2d-2f) muestran la presencia de valles (zonas más obscuras) y crestas (zonas más claras). La homogeneidad mencionada se corroboró al ver en las imágenes de MFA de SAF, AMF y AXF una disminución de los parámetros de rugosidad, o sea una rugosidad promedio aritmética (Ra) de 72.8 nm, 21.3 nm y 33.7 nm, respectivamente y rugosidad media cuadrática (Rq) de 93.6 nm, 27.5 nm y 45.1 nm, respectivamente. Otras investigaciones también relacionan la disminución de la rugosidad de las películas y sus óptimas propiedades físicas con la adición de ingredientes activos (Wang et al., 2017).
Propiedades físicas de las películas orales
Medir las propiedades físicas de las películas es importante cuando se adicionan sustancias complejas como los extractos de las plantas, porque pueden beneficiar o alterar la estructura y composición de las películas (Mir, Dar, Wani & Shah, 2018).
Debido a que el grosor de las películas ultradelgadas garantiza una administración más cómoda (Niese & Quodbach, 2018; Özakar & Özakar, 2021), éstas se midieron con y sin extractos. Los valores obtenidos (Tabla I) indican que las películas SAF, AMF y AXF son ultradelgadas por presentar un grosor inferior a 50 µm, esta característica es relevante porque las películas de menor grosor permiten una rápida adsorción del compuesto activo al disolverse fácilmente en la boca cuando entran en contacto con la saliva (Gupta et al., 2020). Es importante resaltar que las películas de alginato (SAF) no presentaron un cambio significativo en el grosor después de la incorporación de los extractos, a diferencia de otros trabajos en los que se han reportado incrementos de hasta el doble de su grosor después de adicionar el compuesto activo o el fármaco (Ho et al., 2020; Pacheco, da Silva, Tomoda & de Moraes, 2020). Por esto inferimos que el grosor característico de las películas ultradelgadas se conserva gracias a que los metabolitos de las plantas se mezclaron con la matriz polimérica, evaporando el medio en el que estaban disueltos.
Tabla I Grosor, solubilidad, y valores de color (CIELAB) de las películas.
| Grosor (µm) | Solubilidad (min) | Color | |||
|---|---|---|---|---|---|
| L* | a* | b* | |||
| SAF | 46 ± 7.09 | 8 ± 1.3 | 98.121 | 0.324 | 2.138 |
| AMF | 48 ± 6.90 | 9.5 ± 0.7 | 65.359 | -1.728 | 32.381 |
| AXF | 47 ± 4.31 | 10 ± 0.8 | 69.284 | -3.623 | 54.402 |
Película de alginato de sodio (SAF) y películas con extractos de Agastache mexicana mexicana (AMF) y Agastache mexicana xolocotziana (AXF). Los resultados se muestran como la media ± DE.
En cuanto al ensayo de solubilidad, las películas se disolvieron completamente en un intervalo de 8 a 10 min., y aunque no corresponde al tiempo real en que se disuelven en la boca por todas las variables fisiológicas involucradas (Borges & De Carvalho, 2015; Speer et al., 2019), sí es posible comparar ese tiempo con y sin un compuesto activo, al observarse su incremento, aunque, ligero en AMF y AXF respecto a SAF debido a la similitud del grosor de las películas y a la afinidad de los metabolitos con el buffer empleado.
Adicional, se midió el parámetro de color, los resultados concuerdan con los aspectos visuales ya descritos. La película SAF presentó valores de a* y b* cercanos a cero e indica que es incolora y translúcida, mientras que L* con un valor de 98 hace referencia a que es luminosa. Después de la adición de los extractos las películas AMF y AXF mostraron valores correspondientes al color verde (-a) y amarillo (+b), además de baja luminosidad (L*), el cambio en las coordenadas L*a*b* se debe a la presencia de los compuestos fenólicos de los extractos, que además de conferirles color les proporcionan propiedades antioxidantes y de protección ante la radiación UV (Kim et al., 2018; Tedesco et al., 2017).
Propiedades mecánicas al utilizar nanoindentación
La dureza, módulo elástico y desplazamiento de la indentación a nanoescala, son parámetros relevantes relacionados con la estructura química y propiedades mecánicas de las películas. Los resultados obtenidos (Tabla II) sugieren que la adición de los extractos (AM y AX), disminuyen el desplazamiento de la indentación reflejado en el aumento de la dureza en las películas AMF (42%) y AXF (46%), así como en un incremento del módulo elástico en un 69% (AMF) y un 64% (AXF) respecto a SAF. Si bien es cierto que la incorporación de extractos en las películas poliméricas puede afectar o beneficiar sus propiedades mecánicas (Mir et al., 2018), nosotros observamos que AMF y AXF mejoraron las propiedades de dureza y elasticidad, al mantener su integridad, aspectos importantes para su manipulación, administración, almacenamiento y transporte (Alaei & Omidian, 2021; Pimparade et al., 2017). En otros trabajos también se reporta que la adición de los extractos mejora las propiedades mecánicas de las películas, atribuidas principalmente a la formación de puentes de hidrógeno de los grupos hidroxilo de los metabolitos con los biopolímeros usados (Kaczmarek, 2020; Mir et al., 2018; Torres Vargas, Galeano Loaiza & González, 2021).
Tabla II Propiedades mecánicas de las películas obtenidas mediante nanoindentación.
| Dureza (MPa) | Módulo elástico (GPa) | Desplazamiento de indentación (%) | |
|---|---|---|---|
| SAF | 71.88 ± 13.50 | 0.53 ± 0.07 | 9.20 ± 1.40 |
| AMF | 123.57 ± 3.42 | 1.73 ± 0.05 | 7.71 ± 0.33 |
| AXF | 133.97 ± 12.73 | 1.49 ± 0.05 | 7.94 ± 0.48 |
Película de alginato de sodio (SAF) y películas con extractos de Agastache mexicana mexicana (AMF) y Agastache mexicana xolocotziana (AXF). Los resultados se muestran como la media ± DE.
Espectroscopía Infrarroja
A través de FT-IR se analizó la composición macroestructural de las películas después de la adición de los extractos de A. mexicana. Los espectros de las tres películas (Figura 2) con señales típicas del alginato presentaron cerca de 1,605 y 1,410 cm-1 vibraciones de estiramiento asimétricas y simétricas de los aniones carboxilato, respectivamente, con una banda fuerte y ancha a 3,293 cm-1 relacionada al estiramiento de los grupos O-H y una banda de estiramiento C-H alifático débil alrededor de 2,926 cm-1, además de los picos en 1,298 cm -1 (estiramiento en C-O), 1,124 cm-1 (estiramiento en C-C), 1,086 cm-1 (estiramiento en C-O), 1,031 cm-1 (C-O-C estiramiento) y 948 cm -1 (estiramiento C-O) (Kulig, Zimoch- Korzycka & Jarmoluk, 2017; Mahcene et al., 2020; Pacheco et al., 2020; Sibaja et al., 2015) . La identificación de los grupos funcionales del alginato nos permitió comprobar que se logró la incorporación de los extractos sin cambios en la composición química de las películas, además se observa un incremento en la intensidad de las señales que se pueden atribuir a la presencia de los compuestos de A. mexicana, como fenoles, flavonoides, taninos y saponinas (Estrada-Reyes et al., 2014), específicamente, la banda de 3,262 cm-1 corresponde al grupo funcional OH característico de la familia de compuestos fenoles y alcoholes en las bandas de 3,200 cm-1 - 3,400 cm-1, el pico a 1,625 cm-1 pertenece al grupo carbonilo (C=O) de los ácidos fenólicos, el pico a 1,263 cm-1 confirma la presencia de grupos hidroxilo debido a compuestos fenoles y la señal a 1,015 cm-1 indica la existencia de aminas, del grupo C-N (Kaczmarek, 2020; Petenatti et al., 2014; Sundaramurthy & Parthiban, 2015). Estos resultados también nos permiten inferir que los extractos mantienen su composición macroestructural sin alteraciones que pudieran perjudicar su actividad biológica.
Prueba de inducción al sueño con dosis hipnótica de pentobarbital sódico
Con el fin de comprobar que las películas de alginato son capaces de preservar los metabolitos de A. mexicana mexicana y A. mexicana xolocotziana sin alterar su actividad biológica, se evaluó el efecto hipnótico de los extractos y de las películas con los extractos en un modelo in vivo. En este ensayo se encontró que los grupos tratados con los extractos y los grupos tratados con las películas con extractos (Figura 4), tardaron menos tiempo en dormirse (tiempo de latencia), que aquellos que fueron tratados con el fármaco control CL y los que no tuvieron tratamiento (solo PB). Se observó también que, los grupos AM, AX, AMF y AXF, no presentaron diferencia significativa, al demostrar que los metabolitos de las plantas antes y después de ser incorporados en las películas favorecen la inducción al sueño. Los tiempos de latencia de AM (2.4 min.), AX (2.9 min.), AMF (2.2 min.) y AXF (2.5 min.), fueron similares a lo reportado por González-Trujano et al., (2015) con un extracto metanólico de A. mexicana (2.3 min.).
Figura 3 Composición macroestructural de películas de alginato de sodio (SAF) y de alginato de sodio con extractos de Agastache mexicana mexicana (AMF) y Agastache mexicana xolocotziana (AXF), mediante espectroscopía infrarroja.
Figura 4 Tiempo de latencia (A) y de duración del sueño (B), con extractos etanólicos de Agastache mexicana mexicana (AM), Agastache mexicana xolocotziana (AX) y películas ultradelgadas con extracto (AMF y AXF), en ratones inducidos al sueño por dosis hipnóticas de pentobarbital (PB), usando como fármaco de referencia clonazepam (CL). Cada columna representa la media ± DE (n = 7). *indica diferencia significativa respecto al grupo control PB.
De igual manera el tiempo total de sueño de los grupos tratados con AXF y AMF no presentaron diferencia significativa respecto a los extractos AM y AX en medio líquido, con más de 120 minutos de duración del sueño. Estos resultados fueron mayores a lo reportado por González-Trujano et al. (2015) con un extracto metanólico de A. mexicana (40 min.). Este incremento en la duración del tiempo del sueño puede ser atribuida al tipo de extracción (etanólico) que empleamos, ya que se ha reportado que algunos flavonoides presentes en los extractos etanólicos de A. mexicana son efectivos en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central como la ansiedad y el insomnio (Argueta, Cano & Rodarte, 1994; Estrada-Reyes et al., 2014; González-Trujano et al., 2015). Además, existe la evidencia de que algunos flavonoides interaccionan con sistemas de neurotransmisores como la adenosina, la dopamina, la glicina y GABA, este último, el principal neurotransmisor involucrado en la iniciación y mantenimiento del sueño (Johnston, 2015; Park et al., 2020).
Los resultados obtenidos con la prueba de inducción al sueño nos permitieron comprobar que las películas de alginato de sodio son capaces de preservar la actividad farmacológica de los compuestos bioactivos. Además, comparado con el uso de extractos, las películas permiten transportar, administrar y almacenar (ocupan menos volumen) fácilmente los metabolitos incorporados, al mantener intacta la identidad química tanto de los extractos como de la matriz polimérica (analizada mediante FT-IR). También se ha reportado que las películas de alginato pueden mejorar las propiedades farmacocinéticas, proporcionar estabilidad, aumentar la biodisponibilidad y alargar la vida de anaquel de los compuestos bioactivos (Irfan et al., 2016; Karki et al., 2016; Laffleur & Keckeis, 2020).
Conclusiones
En este trabajo se lograron formular películas orales de alginato de sodio ultradelgadas, capaces de mantener su estructura, tamaño y solubilidad, después de la adición de los extractos de A. mexicana mexicana y A. mexicana xolocotziana, que mejoraron la homogeneidad, resistencia y elasticidad de la matriz polimérica. Se demostró que las películas preservan la identidad química de los bioactivos de los extractos y se corroboró mediante la prueba de inducción al sueño que son capaces de conservar la actividad hipnótica de los metabolitos de la planta. Debido a esto, consideramos a las películas ultradelgadas de alginato de sodio como un potencial sistema de administración de plantas medicinales como Agastache mexicana para el tratamiento del insomnio.
