INTRODUCCIÓN

Los ecosistemas marinos se encuentran entre los hábitats más ricos y diversos de la Tierra (^{Karl & Church, 2014}). En estos ambientes, existen condiciones particulares, que fungen como impulsores de los productos naturales bioactivos (^{Sang et al., 2019}). Los organismos marinos se destacan por la producción de una gran cantidad de compuestos activos (^{Raimundo, Silva, Costa & Keller-Costa, 2018}), utilizados como defensa química contra los depredadores, los invasores y los competidores, o para tolerar a los factores que provocan el estrés ambiental (^{Eskander, Al-Sofyani, El-Sherbiny, Ba-Akdah & Satheesh, 2018}; ^{Sang et al., 2019}). Sin embargo, puede ser que estos compuestos activos, aislados principalmente de invertebrados marinos, sean en su mayoría producidos por la comunidad microbiana asociada a ellos (^{Mehbub Lei, Franco & Zhang, 2014}; ^{Rizzo & Lo Giudice, 2018}; ^{Stincone & Brandelli, 2020}).

Las relaciones de simbiosis entre organismos marinos y bacterias proporcionan beneficios mutuos en los términos de protección y en producción de nutrientes (^{Rizzo & Lo Giudice, 2018}). Los ensamblajes bacterianos asociados a los octocorales, son los responsables de mantener diferentes procesos metabólicos y energéticos que requiere el organismo (^{Falkowski, Fenchel & Delong, 2008}; ^{Mouchka, Hewson & Harvell, 2010}). Además de proveer una respuesta de adaptación a los cambios ambientales y a la defensa contra los microorganismos patógenos (^{Correa, Haltli, Duque & Kerr, 2013}). Los octocorales del género Leptogorgia (Gorgoniidae) se consideran entre los más abundantes y frecuentes en los hábitats bentónicos de las zonas someras del Pacífico Oriental Tropical (POT) (^{Breedy & Guzman, 2007}; ^{de González, Shadid & Núñez, 2021}). En particular Leptogorgia alba (^{Duchassaing & Michelotti, 1864}) tiene una distribución amplia a lo largo de la costa del POT (^{Abeytia, Guzmán & Breedy, 2013}; ^{Breedy & Cortés, 2014}; ^{Ríos-Jara, 2016}; ^{de González et al., 2021}) e islas aledañas como la Isla del Coco (^{Breedy & Cortés, 2016}), Islas Galápagos (^{Breedy, Hickman & Williams, 2009}), e Isla Malpelo (^{Sánchez, Gómez, Escobar & Dueñas, 2011}). Esta especie posee el rango de profundidad más amplio de cualquier gorgonia registrada dentro del POT, desde los cinco metros (^{Breedy & Cortés, 2014}; ^{de González et al., 2021}) hasta los 60 metros (^{Abeytia et al., 2013}).

El ensamblaje bacteriano asociado a L. alba se ha estudiado en términos de bioprospección, destacando por su producción de compuestos bioactivos el género Pseudoalteromonas (^{Martínez-Luis, Ballesteros & Gutiérrez 2011}; ^{Moree et al., 2014}). En las cepas de este género aisladas de ambientes marinos, se ha comprobado su potencial de bioprospección, al producir compuestos bioactivos con propiedades antibacterianas, antifúngicas, alguicidas y antiincrustantes (^{Atencio et al., 2018}). ^{Martínez-Luis et al., (2011)} obtuvieron Pseudoalteromonas aisladas de L. alba, de las costas de Panamá, en el océano Pacífico y reportaron su actividad antimicrobiana en los patógenos Bacillus subtillis y Vibrio sp. ^{Moree et al. (2014)} demostraron también que Pseudoalteromonas sp. OT59, aislada del mismo octocoral, produce alteramidas antifúngicas y es dependiente de la luz. Estos autores plantearon la hipótesis de que este compuesto es producido para proporcionar protección durante la alimentación del octocoral, al ocurrir por la noche los pólipos están expuestos y el organismo es más vulnerable.

Otro género bacteriano reconocido por su potencial en la producción de compuestos con actividad biológica es Bacillus, los miembros de este grupo presentan actividades antibacterianas, anticancerígenas y antivirales (^{Bowman, 2007}; ^{Stincone & Brandelli, 2020}). ^{Garrido et al. (2020)} aislaron las cepas de Bacillus sp. BO53 y Pseudoalteromonas sp. GA327 de los octocorales Pseudopterogorgia acerosa y Muriceopsis sulphurea respectivamente, de las costas de Panamá en el mar Caribe. En su estudio reportaron a Bacillus sp. con la habilidad de inhibir el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa y reducir el crecimiento de Staphyloccocus aureus y el de Acinetobacter baumanni. Por su parte, Pseudoalteromonas sp. inhibió el crecimiento de P. aeruginosa y de A. baumanni.

La creciente resistencia a los antibióticos y la disminución en el descubrimiento de nuevos compuestos bioactivos en el medio terrestre (^{Debbab, Aly, Lin & Proksch, 2010}; ^{Sang et al., 2019}), ha llevado a la búsqueda de bioactivos en el medio marino. Especialmente de bacterias asociadas a los corales por su capacidad para producirlos (^{Shnit-Orland & Kushmaro, 2009}; ^{Sang et al., 2019}). Por lo que el objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antimicrobiana de las cepas de Bacillus australimaris y Pseudoalteromonas sp., aisladas del octocoral L. alba, en los patógenos humanos y acuícolas.

Materiales y Métodos

Área de estudio: La especie del octocoral fue identificada como L. alba con base en la morfología de la gorgonia y la estructura de las escleritas (^{Breedy & Guzman, 2007}; ^{Soler-Hurtado, Megina, Machordom & López-González, 2017}, Figura 1). Estos organismos fueron recolectados en dos sitios de las costas del Océano Pacífico, Jalisco, México: 1) islote El Mamut (19º 32’ 45” N y 105º 06’ 50” W) en Bahía Chamela a seis metros de profundidad; 2) Parque Nacional Marino Los Arcos (20º32’43”N 105º17’35”W) a una profundidad de 60 metros. Ambos sitios se muestrearon en septiembre del año 2018.

Figura 1 Leptogorgia alba y morfología de las escleritas obtenidas del organismo para la identificación del octocoral (^{Soler-Hurtado et al., 2017}). 

Recolección y aislamiento de las cepas bacterianas: Las muestras de L. alba se lavaron con agua de mar filtrada a 0.22 micras y estéril, para eliminar a los microorganismos exógenos y se mantuvieron a una temperatura de 4 ºC, en el laboratorio, se trituraron en un mortero y estuvieron en constante agitación. Las células se concentraron por centrifugación a 12,000 revoluciones por minuto (rpm) y el pellet resuspendido en un volumen de 1 mL en agua de mar estéril. Para cada una de las muestras se realizaron diluciones seriales de 10^-1 - 10^-8 también con agua de mar estéril. Finalmente, cada dilución se sembró por separado en Agar Zobell Marino [Levadura (1 g), bactopeptona (5 g), cloruro férrico (1 mL), agar (13 g), en 1 L de agua de mar filtrada a 0.22 micras)]. Las cajas Petri con el contenido antes mencionado se incubaron de cinco a siete días a 28 ºC. Posteriormente, se seleccionaron las bacterias asociadas al octocoral utilizando los códigos 1.2 (obtenida de la Isla Mamut) y 4.4 (obtenida del Parque Nacional Marino Los Arcos), las cuales se aislaron de la placa de agar y fueron resembradas en placas nuevas para su purificación.

Identificación bacteriana: La extracción del DNA genómico se realizó con el kit “InstaGene® Matrix”, siguiendo las indicaciones del fabricante. La calidad del DNA genómico se verificó con los geles de agarosa al 1% teñido con SYBR Safe DNA gel strain, (Invitrogen®), en un fotodocumentador de geles INFINITY-ST5.

Las muestras de ADN fueron enviadas a Macrogen, Inc. Corea del Sur, para la amplificación y secuenciación del gen ribosomal 16S [27F (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3´) y 1492R (5´-TAC CTT GTT ACG ACT T-3´)]. Las secuencias obtenidas fueron analizadas para determinar su calidad en el Software Chromas (Technelysium, DNA Squencing Software). Posteriormente, se compararon con las secuencias de la base de datos GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) para su identificación taxonómica. Se consideró un porcentaje de similitud de la secuencia por arriba del 98 % para la especie y una similitud de al menos 90 % para el género.

Patógenos humanos y acuícolas: En todas las pruebas realizadas se experimentó con las cepas bacterianas aisladas de L. alba para conocer su reacción sobre las especies bacterianas patógenas de los humanos y las patógenas acuícolas. Las bacterias de los humanos incluyeron a Escherichia coli (ATCC25922), Listeria monocytogenes (ATCC7644), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC29213) y Staphylococcus epidermidis (ATCC12223). Estas cepas se mantuvieron en agar tripticaseína de soya (TSA) Bacto [Tryptone (17 g), Bacto Soytone (3 g), glucosa (2.5 g), cloruro sódico (5 g), fosfato dipotásico de hidrógeno (2.5 g), en un litro de agua destilada]. Las patógenas acuícolas probadas fueron: Listonella  anguillarum (696),Streptococcus iniae (527), Vibrio  campbellii (M0702), Vibrio harveyi (CAIM333), Vibrio parahaemolyticus (M0904) y Vibrio diabolicus (CIBGEN002); que se mantuvieron en el medio TSA con NaCl al 2.5 %.

Tanto las cepas patógenas humanas como las acuícolas se transfirieron a un medio TSA y TSA-NaCl, 24 h antes de cada prueba y se incubaron a 35 ºC. Estos medios se utilizaron para preparar diluciones en 5 mL de solución salina (2.5 %) con una densidad óptica de 0.5 medida a una longitud de onda de 585 nm [(D.O₅₈₅) en un espectrofotómetro portátil Merck SQ 118].

Ensayos de actividad biológica: Las cepas aisladas de L. alba (1.2 y 4.4) fueron inoculadas en caldo TSA e incubadas a 35 ºC, 24 h antes de cada prueba. Posteriormente se centrifugaron a 14,000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se utilizó en las siguientes pruebas realizadas por duplicado.

Cross-Streak (CS): Las cajas Petri con agar TSA y TSA-NaCl se inocularon con las cepas bacterianas aisladas de L. alba, también por duplicado. Un solo estriado fue sembrado al centro de la caja Petri. Después de 24 h de ser incubadas a 35 ºC, las placas se estriaron perpendicularmente con los patógenos. Por último, nuevamente se incubaron por 24 h más a 35 ºC y el resultado fue la presencia de zonas de inhibición de los patógenos.

Difusión en agar por gota (DAG): Se inocularon las cajas Petri de medio TSA y TSA-NaCl con 50 µL de la suspensión de cada patógeno y se procedió a esparcirlas con un hisopo estéril. Las cepas duplicadas se inocularon con 20 μL de sobrenadante, y el grupo control positivo con estreptomicina 0.2 mg•mL. Se incubaron a 4 ºC por una hora y después por 24 y 48 h a 35 ºC. Transcurrido el tiempo se evaluó la presencia de las zonas de inhibición del crecimiento de las cepas patógenas.

Difusión en pozo (DP): Del mismo modo que las pruebas DAG, las cajas Petri con agar TSA y TSA-NaCl al 2.5 % fueron inoculadas con 50 µL de la suspensión de cada patógeno y se procedió a esparcir con un hisopo estéril. Posteriormente, se realizaron perforaciones con la ayuda de un sacabocados de 6 mm de diámetro en donde se depositó la suspensión bacteriana de cada una de las cepas aisladas de L. alba. Las cajas se mantuvieron por una hora a 4 ºC y después se incubaron a 35 ºC durante 48 h. Transcurridas las 24 y 48 h se determinó la interacción de las bacterias con la medición de los halos de inhibición.

Difusión en disco (DD): Los patógenos fueron inoculados en cajas Petri con agar TSA (a excepción de las cepas de Vibrio, que no se utilizaron en esta prueba), de la misma forma que los ensayos anteriores. Se utilizaron discos de papel filtro Whatman no.1 con un diámetro de 6 mm. Los discos fueron impregnados con 15 μL del sobrenadante de las cepas bacterianas aisladas de L. alba. Estos fueron colocados con pinzas estériles en las cajas Petri previamente inoculadas e incubados a 4 ºC por 1 h para permitir la difusión del compuesto. Posteriormente, las cajas fueron incubadas a 35 ºC por 24 y 48 h para evaluar la presencia de los halos de inhibición alrededor del disco.

Crecimiento sobre celulosa (CPC): En una caja Petri con agar TSA se colocó una membrana de celulosa vegetal previamente hidratada con agua destilada estéril. En ella se sembraron 50 μL de las cepas aisladas del octocoral, se incubaron a 35 ºC por 24 h. Posteriormente, se recuperó la biomasa con una espátula estéril y fue suspendida en PBS (NaCl 8 g/L, KCL 0.2 g/L, Na₂HPO₄ 1.44 g/L y KH₂PO₄ 0.24 g/L) en una relación de 0.2 g de biomasa bacteriana por 1 mL de PBS. La suspensión de biomasa fue centrifugada a 14,000 rpm. Por último, con el sobrenadante obtenido, se realizó la prueba DAG en los patógenos.

Microplaca de poliestireno (MP): A diferencia de las pruebas anteriores, el sobrenadante de las cepas bacterianas aisladas de L. alba fue filtrado con una membrana PVDF de 0.22 μm. Para confirmar que no hubiera crecimiento celular del sobrenadante filtrado, antes de realizar la prueba, fue inoculado en cajas Petri con agar TSA e incubado por 24 h a 35 ºC. Una vez confirmado que no hubo crecimiento celular se continuó con el ensayo. Cada pozo de la placa se inoculó con 100 μL del sobrenadante de la cepa a probar y 100 μL de la suspensión de cada patógeno, por triplicado. En la misma placa se colocaron controles por triplicado, para evaluar el porcentaje de antagonismo; el sobrenadante filtrado de las cepas bacterianas aisladas de L. alba (1.2 y 4.4), la suspensión del patógeno a una absorbancia de 0.5 nm, y el caldo de cultivo TSA y TSA-NaCl. Finalmente, la placa se incubó a 35 ºC y se tomaron lecturas a las 24 y 48 h de absorbancia a una D.O₆₂₀ en un lector de placas (Tecan).

Para evaluar el porcentaje de antagonismo, se utilizó la fórmula de ^{Martínez-Díaz (2010)} modificada:

donde PC es el porcentaje de crecimiento, PI es el porcentaje de inhibición, C es el crecimiento de la cepa pura sin adición de compuestos (control negativo) y CC es el resultado del crecimiento de la cepa en presencia del patógeno.

Resultados

Identificación de las bacterias marinas 1.2 y 4.4: La cepa 1.2 se aisló a partir de la muestra recolectada del islote El Mamut y la cepa 4.4 del Parque Nacional Marino Los Arcos. Ambas fueron identificadas por la secuencia del gen ARNr 16S. La cepa con el código 1.2 mostró un 100 % de similitud con Bacillus australimaris (SUB12992819 57_27F/OQ699139). La cepa 4.4 mostró un 98 % de similitud con Pseudoalteromonas sp. (SUB12992854 52_27F/ OQ699141) y no fue posible su identificación a nivel de especie.

Actividad biológica de las cepas de B. australimaris y Pseudoalteromonas sp.: Las cepas, B. australimaris y Pseudoalteromonas sp. aisladas de L. alba tuvieron una actividad antagónica frente a los patógenos humanos y los acuícolas. La bacteria B. australimaris demostró antagonismo frente a las cepas L. monocytogenes y V. campbellii por medio de los ensayos CS, DAG, DP, y CPC (Figura 2, Cuadro I). En cambio, un mayor número de antagonismos se detectó por medio de la prueba MP, en los patógenos E.coli, L. monocytogenes, P. aeruginosa, S. epidermidis, L. anguillarum, y S. iniae (Figura 3A), siendo L. monocytogenes la cepa con mayor porcentaje de inhibición a las 24 y 48 h (36.8 % y 42.6 %), seguido de E. coli (24.6 % y 42.6 %). Con los patógenos acuícolas L. anguillarum (30.3 %) y S. iniae (28.7 %) la inhibición se observó a las 24 h, y con los patógenos humanos P. aeruginosa (18.6 %) y S. epidermidis (24.6 %) hasta las 48 h.

Figura 2 Actividad antagónica de las cepas de B. australimaris (código 1.2) y Pseudoalteromonas sp. (código 4.4). Ensayos Cross-streak (CS), difusión en agar por gota (DAG), crecimiento sobre celulosa (CPC), difusión en disco (DD) y difusión en pozo (DP). 

Figura 3 Efecto inhibitorio de los sobrenadantes de las cepas B. australimaris (A) y Pseudoalteromonas sp. (B), en diferentes patógenos humanos y acuícolas a las 24 h (barras grises) y 48 h (barras negras). Ensayo en microplaca de poliestireno. 

La bacteria Pseudoalteromonas sp. mostró una gran capacidad para inhibir el crecimiento de diferentes patógenos como: L. monocytogenes, por medio de las pruebas DD y MP, en L. anguillarum con (CS, DAG, DP, CPC y MP), S. iniae con (CS, DAG, DP, DD y CPC) y V.   campbellii por medio del ensayo DAG (Figura 2). Sólo con la prueba MP se logró identificar el antagonismo a E. coli (Cuadro I), siendo este patógeno el que registró los mayores porcentajes de inhibición a las 24 h (21.3 %) y 48 h. (26.1 %). L. anguillarum presentó antagonismo a las 24 h (9.9 %) y L. monocytogenes hasta las 48 h (3.6 %, Figura 3B).

A excepción de la prueba de difusión en disco (DD) en la cepa B. australimaris, el resto de los ensayos realizados en este trabajo probaron que el efecto antagónico de las cepas B. australimaris y Pseudoalteromonas sp. fue entre siete y cinco patógenos, respectivamente. Los patógenos S. aureus, Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus y V. diabolicus no registraron inhibición de crecimiento ante los sobrenadantes de las cepas aisladas de L. alba (Cuadro I).

Discusión

Las bacterias, B. australimaris y Pseudoalteromonas sp. asociadas a L. alba de las zonas somera y mesofótica, inhibieron el crecimiento de los patógenos humanos y el de los acuícolas. Miembros de los géneros Bacillus y Pseudoalteromonas aislados de distintas fuentes marinas, han sido estudiados por su potencial actividad biológica, como es el caso de Bacillus recolectados del agua de mar, esponjas y mejillones, demostrando su capacidad antimicrobiana (^{Atencio et al., 2018}). Este género constituye uno de los grupos de microorganismos de alto potencial biomédico (^{Fenical & Jensen, 1993}; ^{Muscholl-Silberhorn, Thiel & Imhoff, 2008}), que se han obtenido con regularidad en ambientes marinos y son ampliamente estudiados por diversos autores por la producción de sus metabolitos con propiedades antimicrobianas, antiadherentes, alguicidas y de interés en la farmacología (^{Ivanova et al., 1999}; ^{Pabel et al., 2003}; ^{Zhang, Hua, Pei & Yao, 2004}). En cuanto a los miembros de Pseudoalteromonas provenientes de las esponjas, los octocorales y el sedimento en manglares, tienen una actividad antimicrobiana y antifúngica (^{Sticone & Brandelli, 2020}; ^{Handayani, Isnansetyo, Istiqomah & Jumina, 2022}). Sin embargo, los reportes de la bioactividad de estos géneros asociados a las gorgonias son pocos, a pesar de que estos organismos constituyen una de las mayores fuentes en producción de nuevos compuestos bioactivos (^{Raimundo et al., 2018}).

En las gorgonias, los miembros de Bacillus recolectados en Junceella juncea también son antibacterianos para los patógenos humanos B. subtilis, E. coli y S. aureus (^{Gao et al., 2010}; ^{Thangapaul, Praveevn & Chinnachamy, 2019}). De igual manera, ^{Garrido et al. (2020)} reportaron la inhibición de los patógenos P. aeruginosa, S. aureus y Acinetobacter baumanni por las cepas de Bacillus de los octocorales Pseudopterogorgia acerosa y Muriceopsis sulphurea. En este estudio B. australimaris como ya se mencionó impide el crecimiento de los patógenos humanos (E. coli, L. monocytogenes, P. aeruginosa, S. aureus y S. epidermidis) y el de los patógenos acuícolas (L. anguillarum, S. iniae y V. campbellii). Este trabajo es el primer reporte de la bacteria B. australimaris, antimicrobiana, encontrada en el octocoral L. alba de la zona somera. Asimismo, es importante continuar con los ensayos en diferentes líneas de investigación, en la búsqueda de nuevos compuestos activos. En este contexto, resulta relevante mencionar que Bacillus sp. aislada de L. alba, en las costas de Panamá por ^{Boya, Herrera, Guzman & Gutierrez, (2012)}, mostró actividad antiplasmodial, lo que representa un recurso prometedor para la investigación antipalúdica.

Pseudoalteromonas es otro grupo bacteriano que ha revelado actividad antibacteriana, antifúngica, alguicida y antiincrustante (^{Atencio et al., 2018}). Este género se encuentra en las gorgonias P. acerosa y M. sulphurea, y reprime el crecimiento de los patógenos humanos P. aeruginosa y A. baumannii (^{Garrido et al., 2020}). De manera similar, ^{Martínez-Luis et al. (2011)} registraron actividad antimicrobiana de Pseudoalteromonas sp., aislada de L. alba de las costas de Panamá, sobre el patógeno B. subtillis y el patógeno marino Vibrio sp. En este trabajo, Pseudoalteromonas sp. aislada de L. alba de la zona mesofótica (60 metros de profundidad), además de inhibir el crecimiento de dos cepas patógenas para el humano (E. coli y L. monocytogenes) demostró lo mismo para las cepas patógenas acuícolas (L. anguillarum, S. iniae y V. campbellii) lo que podría ser un indicio del rol que funge Pseudoalteromonas sp. dentro del ensamblaje bacteriano asociado a L. alba, proporcionando protección al octocoral frente a los microorganismos patógenos.

La relación entre los microorganismos y el huésped ha evidenciado, que las bacterias pueden ser responsables de mantener diferentes procesos metabólicos y energéticos que requiere el octocoral (^{Ledoux & Antunes, 2018}; ^{Sánchez et al., 2019}). También son fundamentales en diferentes procesos de los ciclos biogeoquímicos (^{Mouchka et al., 2010}; ^{Webster & Reusch, 2017}) y participan en la producción de compuestos antimicrobianos, antibiofilm, y antifouling. Los ensamblajes bacterianos aportan estrategias defensivas al organismo anfitrión mediante la capacidad de inhibición del crecimiento de los patógenos (^{Raimundo et al., 2018}; ^{Sang et al., 2019}). La capacidad antagónica que demostraron las bacterias, B. australimaris y Pseudoalteromonas sp. en este trabajo, es un indicio de su posible función dentro del ensamblaje bacteriano asociado a L. alba, para protegerlo de microorganismos patógenos, y evitar la colonización de otros microorganismos al producir compuestos naturales activos. Por lo que es importante continuar con estudios complementarios que ayuden a comprender el rol de la actividad biológica de las cepas bacterianas asociadas a las gorgonias en el medio ambiente y explorar el potencial biotecnológico que estos productos bioactivos pueden tener.

Conclusiones

Las especies bacterianas, B. australimaris y Pseudo-alteromonassp. aisladas del octocoral L. alba, demostraron que pueden suprimir el crecimiento de las cepas patógenas que afectan a los humanos, así como a las patógenas acuícolas. Estos resultados indican su función dentro del ensamblaje asociado al octocoral en el medio ambiente, y un recurso biotecnológico potencial en la búsqueda de nuevos compuestos con actividad antimicrobiana. Los métodos empleados para la evaluación de la actividad antagónica utilizados en este trabajo, involucran contacto directo o del sobrenadante con los patógenos, por lo que la comparación entre métodos no es viable, ya que todos crean diferentes condiciones en los que la bacteria puede o no producir el compuesto activo. Las pruebas que involucran estriados directos en el medio de cultivo, permiten a la cepa bacteriana crecer en el medio del que fue originalmente aislada, y en consecuencia obtener los recursos necesarios para la producción de compuestos antimicrobianos, aunque en algunos casos estos compuestos activos se producen cuando están en presencia del patógeno. Debido a ello, se resalta la importancia de utilizar más de un método para la evaluación de la actividad antimicrobiana y así brindar resultados certeros en la búsqueda de esta actividad y en la exploración de nuevos compuestos con potencial bioactivo.