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En el estado de Oaxaca se conoce la existencia de 25 géneros y 157 especies de la familia de las Lamiaceae Martinov; en esta familia se encuentra el género Clinopodium L., y las especies de este estudio Clinopodium macrostemum (Moc. & Sessé ex Benth.) Kuntze y Clinopodium mexicanum (Benth.) Govaerts, ambas endémicas de México (García-Mendoza & Meave del Castillo, 2011; Martínez-Gordillo et al., 2017). El registro que se tiene es el de un total de 14 especies que se distribuyen principalmente en el norte del país (Martín-Mosquero, Pastor Díaz & Rodríguez, 2004).
Estas especies son consideradas de importancia medicinal y ceremonial-religiosa. En las regiones donde se localiza C. mexicanum, está documentada para el tratamiento de enfermedades nerviosas, la inducción al sueño y como agente sedante o analgésico; sus efectos terapéuticos se deben a la presencia de flavonoides identificados por estudios fitoquímicos realizados en las especies del género Clinopodium (Opalchenova & Obreshkova, 1999; García Rivas, 2000; Estrada-Reyes, Martínez-Vázquez, Gallegos-Solís, Heinze & Moreno, 2010); en las afecciones de las vías respiratorias es utilizada para tratar el asma, la sinusitis y favorecer la expulsión de las flemas (Juárez-Pérez & Cabrera-Luna, 2019), además de altas posibilidades para el desarrollo de analgésicos y ansiolíticos (Cassani et al., 2013).
C. macrostemum es también de uso medicinal, alivia el dolor estomacal y la resaca; la recolectan en la festividad del día de muertos, pero también se obsequia a los invitados en diferentes festividades durante el año, principalmente en las mayordomías y las bodas (Arrazola-Guendulay, Hernández-Santiago & Rodríguez-Ortiz, 2018). Con respecto a los estudios farmacológicos y fitoquímicos efectuados a las especies mencionadas se tiene información de que los extractos de C. macrostemum inhiben a las bacterias patógenas, capacidad atribuida a los terpenos; también tiene efectos relajantes y antiinflamatorios (Bello-González, Salgado-Garciglia & Carmona-Fernández, 2013). En el aceite esencial de la especie antes mencionada, Rojas-Olivos et al. (2018) encontraron un efecto larvicida sobre la especie de Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) y Villa-Ruano, Pacheco-Hernández, Cruz-Durán & Lozoya-Gloria. (2015) demostraron que presenta una alta inhibición en el crecimiento de las bacterias y los hongos fitopatógenos. En la misma especie sus extractos obtenidos con diferentes solventes (hexano, acetato de etilo y metanol) dan lugar a la presencia de varios tipos de flavonoides relacionados con la CA (Estrada-Reyes et al., 2010), característica que los califica como “compuestos que retardan o previenen la oxidación de otras moléculas y su acción principal es terminar con las reacciones de oxidación” (Zenil-Lugo, Colinas-León, Bautista-Bañuelos, Vázquez-Rojas & Lozoya-Saldaña, 2014), por ende, se conoce como actividad antioxidante a la capacidad de una sustancia para inhibir la degradación oxidativa provocada por la acción de los radicales libres (Londoño Londoño, 2012).
Aun con la importancia cultural y tradicional que tienen estas especies vegetales dentro del estado de Oaxaca, la falta de estudios fitoquímicos comparativos entre las dos especies seleccionadas en este estudio, así como el inadecuado aprovechamiento de éstas ponen en riesgo la conservación de los conocimientos tradicionales y la diversidad florística. En consecuencia, esta investigación se enfocó en generar un mapa para conocer la distribución de las dos especies de Clinopodium dentro del estado de Oaxaca, registrar y comparar los usos tradicionales en dos comunidades de la Región Mixteca y determinar su CA a partir de dos tipos de extractos: los hidrometanólicos (HMet) e hidroetanólicos (HEt), con el fin de contrastar su efecto en ambas e identificar el potencial de uso de las especies, como una aportación al conocimiento y a su valor etnobotánico al relacionarse con la utilidad tradicional reportada en este trabajo.
Materiales y métodos
Conocimiento tradicional
Se aplicaron entrevistas semiestructuradas y aleatorias a los pobladores de las localidades de Santiago Apoala Nochixtlán y de la Heroica ciudad de Tlaxiaco, del estado de Oaxaca, para obtener información sobre el nombre común y el conocimiento del uso tradicional de las especies seleccionadas para este estudio.
Distribución de las dos especies del género Clinopodium
El mapa de distribución de las especies de este trabajo, se elaboró a partir de 356 registros de la colección científica del Herbario Nacional Mexicano (MEXU) del portal de datos abiertos de la UNAM; filtrando sólo las colectas correspondientes al estado de Oaxaca con el fin de obtener una base de datos e integrarla mediante la herramienta del Sistema de Información Geográfica (SIG) ArCGis versión 10.4.1, al tema municipios que se tomó del Geoportal del Sistema Nacional de Información sobre Biodiversidad de la Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO).
Obtención y preparación de los extractos vegetales
La recolección de ejemplares y muestras vegetales del género Clinopodium se realizaron en las localidades de Santiago Apoala Nochixtlán y la Heroica Ciudad de Tlaxiaco, ambas ubicadas en la región Mixteca Alta Oaxaqueña. Una vez colectadas, se procedió a lavar las muestras con agua destilada y se colocaron bajo la sombra a temperatura ambiente hasta su deshidratación.
Las hojas secas se trituraron y maceraron en soluciones de metanol y etanol al 80% en una relación 1:10 (w/V) durante siete días, a temperatura ambiente sin exposición directa al sol. El resultado fueron los siguientes extractos Cmc-HEt: extracto de C. macrostemum hidroetanólico; Cmc-HMet: Extracto de C. macrostemum hidrometanólico; Cmx-HEt: Extracto de C. mexicanum hidroetanólico; Cmx-HMet: Extracto de C. mexicanum hidrometanólico; las cuatro muestras se filtraron, primero, al vacío con papel Whatman grado 41 y después se colocaron en frascos esterilizados para evitar la proliferación de los microorganismos, el solvente se dejó evaporar en una campana de extracción. El rendimiento del extracto se obtuvo mediante la Ecuación 1.
Determinación de la capacidad antioxidante por el método ABTS
Se aplicó la metodología propuesta por Re et al. (1999), y en frascos ámbar se mezclaron 4 mL de la solución del radical ABTS con 40 μL de la serie de disoluciones de cada extracto comparando con ácido ascórbico como estándar (AA). Para el blanco se emplearon 40 μL de etanol al 96% y se incubó a temperatura ambiente en una zona oscura por seis minutos. Los experimentos control se realizaron con ácido ascórbico como referencia para comparar los resultados obtenidos. La lectura de todas las muestras se llevó a cabo a 734 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Velaquin VE-5600UV). Con los datos se elaboró la curva estándar, así como el % de inhibición de ABTS mediante la Ecuación 2:
Donde Acontrol es la absorbancia de la solución ABTS con etanol y Amuestra es la absorbancia registrada después de la reacción de cada extracto, todas las determinaciones se efectuaron por triplicado.
Determinación de la capacidad antioxidante por el método FRAP
La CA de los extractos se determinó por triplicado mediante la adaptación de la técnica FRAP propuesta por Benzie & Strain (1996); donde a 3,600 μL de la disolución FRAP, se agregaron 120 μL de las disoluciones de cada extracto y 360 μL de agua destilada, utilizando ácido ascórbico como grupo control. Las muestras se incubaron a 37 °C por 30 minutos y las lecturas se tomaron a 593 nm con el espectrofotómetro UV-Vis (Velaquin VE-5600UV). Se elaboró una curva estándar de FeSO4*7H2O y los resultados fueron reportados como mmol/L de Fe2+.
Análisis de los datos
Los datos obtenidos de la CA como media ± desviación estándar (DE) se evaluaron con el software Minitab 19.1. La significancia estadística se determinó con un análisis de varianza (ANOVA); y una prueba de rango múltiple de Tukey para detectar diferencias significativas entre los diferentes tipos de extractos evaluados. Para todos los análisis, el nivel de significancia fue de p<0.05.
Resultados
Distribución geográfica de las especies de Clinopodium en el estado de Oaxaca
Mediante el análisis de los datos abiertos de colectas del herbario MEXU, las especies de Clinopodium se distribuyen como sigue: C. mexicanum en los estados de: Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Oaxaca, Puebla, Querétaro, San Luis Potosí y Veracruz. C. macrostemum en 15 estados: Ciudad de México, Durango, Estado de México, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacán, Morelos, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Sinaloa, Tamaulipas, Tlaxcala y Veracruz. En el estado de Oaxaca se registró un total de 107 colectas (58 de C. mexicanum, que en la región mixteca se establece principalmente en la localidad de Nochixtlán y 49 de C. macrostemum con mayor proporción en la región de Tlaxiaco (Figura 1).
Conocimiento tradicional
Con base en las entrevistas (hojas y ramas son las más utilizadas) y los resultados fueron los siguientes:
ocho nombres comunes para cada una de las especies, dos en el dialecto Mixteco: “Itanduku” (flor de leña) para C. mexicanum y “Chaa ntajini” para C. macrostemum (Tabla I).
una gran variedad de usos: el medicinal es el más frecuente en ambas especies para tratar once enfermedades; el tratamiento más destacable es para C. mexicanum como cataplasma para dolores de hueso, dando masajes en la zona del dolor. En la preparación de alimentos destacan las comunidades cercanas a Tlaxiaco, C. macrostemum se emplea como condimento y saborizante y en las celebraciones religiosas (Tabla II).
Tabla I Nombres comunes de C. mexicanum y C. macrostemum en las localidades de la Mixteca Oaxaqueña.
| Especie | Nombres |
|---|---|
| C. mexicanum | Hierba del borrachito Itanduku (mixteco) Poleo Flor de leña |
| C. macrostemum | Hierba del borrachito Hierba del borracho Chaa ntajini (mixteco) Poleo Borrachito |
Tabla II Usos de las especies de Clinopodium en la Región Mixteca Oaxaqueña.
| Tipo de usos | Usos | Especies | Preparación | Partes utilizadas |
|---|---|---|---|---|
| Medicinal | Dolor de huesos | Cmx | C | H |
| Baño relajante | Cmx | I | HR | |
| Baño post-parto | Cmx | I | HR | |
| Fiebre | Cmx | I | HR | |
| Resaca | Cmx / Cmc | I | HR | |
| Cólicos | Cmx / Cmc | I | HR | |
| Frialdad (frío en el cuerpo) | Cmx / Cmc | I | HR | |
| Dolor de estómago | Cmx / Cmc | I | HR | |
| Mareos | Cmx / Cmc | I | HR | |
| Vómito | Cmx / Cmc | I | HR | |
| Diarrea | Cmx / Cmc | I | HR | |
| Religioso | Mayordomías y fiestas | Cmx / Cmc | - | HR |
| Alimento | Agua de tiempo | Cmx / Cmc | I | H |
| Empoleadas | Cmc | E | H | |
| Nieve tradicional | Cmc | M | H |
Cmx: C. mexicanum; Cmc: C. macrostemum; C: Cataplasma; I: Infusión; E: Especia; M: Molienda; H: Hojas; HR: Hojas y ramas.
Rendimiento de los extractos
En la Tabla III, se muestran los resultados en porcentajes del rendimiento de ambas especies, a partir de los extractos obtenidos por maceración y donde HMet fue mayor en comparación con los de HEt.
Tabla III Resultados del rendimiento de los extractos en las dos especies de Clinopodium con los solventes hidroalcohólicos.
| Muestras | Extracto seco obtenido (g) | Rendimiento (%) |
|---|---|---|
| Cmc-HEt | 8.02 | 16.04 |
| Cmc-HMet | 8.84 | 17.68 |
| Cmx-HEt | 4.97 | 9.94 |
| Cmx-HMet | 6.77 | 13.54 |
Cmc-HEt: Extracto de C. macrostemum hidroetanólico; Cmc-HMet: Extracto de C. macrostemum hidrometanólico; Cmx-HEt: Extracto de C. mexicanum hidroetanólico; Cmx-HMet: Extracto de C. mexicanum hidrometanólico.
Capacidad antioxidante de los extractos
Con base en los porcentajes de inhibición del ácido ascórbico reportados en el Tabla IV y en la Figura 2, en este trabajo el resultado para la dosis-respuesta es que a una mayor concentración de extracto hidroalcohólico y de ácido ascórbico aumenta el porcentaje de inhibición de los radicales libres debido a la capacidad antioxidante tanto de los extractos como del grupo control. En comparación al IC50 del ácido ascórbico con un valor estándar de 0.1703 mg/mL, los extractos de las especies del género Clinopodium muestran un potencial menor para la inhibición de los radicales ABTS; sin embargo, del extracto Cmx-HMet para la especie C. mexicanum se determinó un valor de 0.7869 mg/mL, siendo la muestra que demostró mayor inhibición, seguido por el extracto Cmx-HEt de esta misma especie con valor de 0.8161 mg/mL.
Tabla IV Comparación de la capacidad antioxidante de los extractos evaluada por el método ABTS en porcentaje de inhibición y el IC50.
| Muestra | Concentración (mg/mL) | % de inhibición | IC50 (mg/mL) |
|---|---|---|---|
| AA | 0.1 | 29.8877 | 0.1703 (R2 = 0.9816) |
| 0.01 | 4.177 ± 0.356 | ||
| 0.001 | 1.482 ± 0.587 | ||
| Cmc-HEt | 1 | 11.281 ± 0.974 | 5.479 (R2 = 0.9378) |
| 0.6 | 5.942 ± 1.316 | ||
| 0.1 | 2.321 ± 1.408 | ||
| Cmc-HMet | 1 | 11.384 ± 1.381 | 4.945 (R2 = 0.9888) |
| 0.6 | 7.923 ± 0.492 | ||
| 0.1 | 3.187 ± 0.479 | ||
| Cmx-HEt | 1 | 59.4405 ± 0.609 | 0.8161 (R2 = 0.9983) |
| 0.6 | 39.3006 ± 1.648 | ||
| 0.1 | 9.2307 ± 2.486 | ||
| Cmx-HMet | 1 | 63.404 ± 3.971 | 0.7869 (R2 = 0.9864) |
| 0.6 | 41.513 ± 1.656 | ||
| 0.1 | 9.787 ± 1.211 |
Los valores del % de inhibición de las muestras Cmx-HMet, Cmx-HEt, Cmc-HMet y Cmc-HEt representan la media ± DE y son significativamente diferentes en comparación con los valores de la muestra AA según lo reveló la prueba Tukey (p <0.05).
Cmc-HEt: Extracto de C. macrostemum hidroetanólico; Cmc-HMet: Extracto de C. macrostemum hidrometanólico; Cmx-HEt: Extracto de C. mexicanum hidroetanólico; Cmx-HMet: Extracto de C. mexicanum hidrometanólico; AA: ácido ascórbico.
Determinación de la capacidad antioxidante mediante FRAP
En el ensayo con FRAP, los resultados obtenidos de las concentraciones de Fe2+ (Tabla V) equivalentes de la curva estándar y las absorbancias registradas (Figura 3), la dosis-respuesta indica que a una mayor concentración del extracto vegetal o del ácido ascórbico aumenta su absorbancia y la concentración de Fe2+. Por consiguiente, si en relación a 5 mg/mL, el valor estándar del ácido ascórbico es de 1610.622 ± 2.341 mmol/L, se determina que los extractos de C. mexicanum muestran un mayor poder reductor de TPTZ, y la extracción hidrometanólica es la del valor más alto con 1687.066 ± 7.055 mmol/L de Fe2+, seguido del extracto Cmx-HEt con 1660.177 ± 6.049 mmol/L de Fe2+.
Tabla V Comparación de la capacidad antioxidante de los extractos obtenidos evaluada por el ensayo FRAP.
| Muestra | Concentración (mg/mL) | Equivalente de Fe (II) mmol/L |
|---|---|---|
| AA | 5 | 1610.622 ± 2.341 |
| 0.5 | 1511.511 ± 43.021 | |
| 0.05 | 200.622 ± 18.285 | |
| Cmc-HEt | 5 | 1587.288 ± 26.585 |
| 1 | 435.955 ± 18.102 | |
| 0.1 | 46.844 ± 14.256 | |
| Cmc-HMet | 5 | 1605.066 ± 16.772 |
| 1 | 457.288 ± 54.427 | |
| 0.1 | 44.4 ± 12.719 | |
| Cmx-HEt | 5 | 1660.177 ± 6.049 |
| 1 | 1458.844 ± 11.591 | |
| 0.1 | 130.844 ± 4.537 | |
| Cmx-HMet | 5 | 1687.066 ± 7.055 |
| 1 | 1424.622 ± 49.532 | |
| 0.1 | 164.844 ± 20.399 |
Los valores del equivalente Fe(II) de las muestras Cmx-HMet, Cmx-HEt, Cmc-HMet y Cmc-HEt representan la media ± DE y son significativamente diferentes en comparación con los valores de la muestra AA según lo reveló la prueba Tukey (p <0.05).
Cmc-HEt: Extracto de C. macrostemum hidroetanólico; Cmc-HMet: Extracto de C. macrostemum hidrometanólico; Cmx-HEt: Extracto de C. mexicanum hidroetanólico; Cmx-HMet: Extracto de C. mexicanum hidrometanólico; AA: ácido ascórbico.
Discusión
A través de la dependencia e interacción con los recursos naturales, los pobladores de las comunidades indígenas adquieren conocimientos de su entorno, que les permiten adoptar técnicas de uso y manejo del género Clinopodium, del que se tienen registrados diferentes formas de empleo, en el estado de Oaxaca, como medicinales y religioso-ceremonial reportados por Arrazola-Guendulay et al. (2018) para el municipio de Ayoquezco de Aldama. En este trabajo, no sólo, se resalta la importancia del conocimiento tradicional sobre la utilidad de las especies de C. mexicanum y de C. macrostemum resultado de las entrevistas semiestructuradas, sino también por primera vez el aprovechamiento de las especies en los sitios de colecta indicados. Además, la determinación del análisis de la bioactividad de la capacidad antioxidante de estas plantas reportado en esta investigación, demuestra la importancia de considerar los extractos evaluados para futuras investigaciones relacionadas con su potencial de inhibición de los radicales libres, y el de mayor relevancia el extracto hidrometanólico de C. mexicanum por sus propiedades antioxidantes que pueden retrasar o inhibir la acción de los compuestos oxidantes en una reacción en cadena para favorecer la salud de las personas o bien para el desarrollo de los procesos de la conocida química verde.
Los resultados de esta investigación son comparables con los estudios que indican que los extractos preparados a partir de solventes de naturaleza polar, presentan una mayor cantidad de antioxidantes debido al aumento de la solubilidad fenólica; en plantas medicinales como Pluchea indica (Widyawati, Budianta, Kusuma & Wijaya, 2014), Paramignya trimera (Nguyen, Bowyer, Vuong, Altena & Scarlett, 2015), Silybum marianum (Benchaachoua, Bessam & Saidi, 2018), Cyclopia intermedia (Dube, Meyer & Marnewick, 2017) y Bassia muricata (Mohammedi, Idjeri-Mecherara, Menaceur & Hassani, 2019), describen circunstancias que coinciden con esta investigación en relación a lo siguiente: el conocimiento tradicional de las plantas medicinales, con los parámetros de la bioactividad de la capacidad antioxidante que permiten sustentar científicamente su uso potencial, la utilidad del metanol un solvente para aumentar el rendimiento de extracción y la concentración de los metabolitos secundarios que incrementan la capacidad antioxidante. Lee et al., 2011 y Benabdallah, Rahmoune, Boumendjel, Aissi & Messaoud, 2016, mencionan que la CA de los extractos crudos de las plantas es el efecto sinérgico de todos sus componentes; sin embargo, se atribuye principalmente al contenido de fenoles totales presentes en los extractos metanólicos como es el caso de Clinopodium vulgare (Tepe, Sihoglu-Tepe, Daferera, Polissiou & Sokmen, 2007), Clinopodium bolivianum (Chirinos, Huamán, Betalleluz-Pallardel, Pedreschi & Campos, 2011), Clinopodium chínense (Zhang et al., 2018), Clinopodium nubigenum (Muñoz, 2018) y Clinopodium pulchellum (Manrique, Chuquicaña & Luna, 2017; Muñoz & Anataly, 2019), en los que se correlaciona la CA con el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides de cada una de las especies, con base en lo anterior y a la familia a la que pertenecen las especies evaluadas en este trabajo, la capacidad antioxidante de los extractos es por este grupo de compuestos fitoquímicos y como lo mencionan los autores (Lee et al., 2011), ser responsables de otros usos medicinales atribuidos a las especies de la familia Lamiaceae entre los que destacan: sus propiedades antitumorales, antibacteriales, antiinflamatorios y de protección a la radiación de los rayos UV, por lo que es posible que las especies de Clinopodium analizadas en este trabajo tengan también las mismas propiedades y el resultado de los valores de la capacidad antioxidante evaluados en los extractos de las especies de Clinopodium fueron mayores que los reportados para la especie Sthachys officinalis (Paun et al., 2018), que también pertenece a la familia Lamiceae, con actividad antiinflamatoria in vitro en las fracciones del extracto etanólico de las hojas y un efecto contra infecciones por patógenos o lesiones tisulares, por lo tanto, es posible que los extractos obtenidos en este trabajo al demostrar una elevada capacidad antioxidante tengan un efecto antiinflamatorio de uso medicinal para síntomas de infecciones estomacales (dolor de estómago, fiebre, vómito; registro para C. macrostemum que se menciona en la Introducción) ver la Tabla II.
Conclusiones
Este trabajo contribuye al valor etnobotánico de las especies evaluadas del género Clinopodium, primero, al adquirir la información de usos y costumbres tradicionales a partir de las encuestas realizadas a los pobladores de las comunidades, entre los que se destacan su uso medicinal, así como los nombres en dialecto mixteco para Clinopodium macrostemum y Clinopodium mexicanum. Además, se reporta por primera vez la bioactividad de la capacidad antioxidante de los extractos de estas plantas, al mencionar que el hidrometanólico de la especie C. mexicanum demostró mayor porcentaje de inhibición de la CA. Se corrobora también que el tipo de solvente utilizado en la maceración determina la CA de los extractos evaluados; con posibilidad de ser considerados para valorar las propiedades de uso potencial que aún no han sido exploradas y su relación con la capacidad antioxidante determinada en este trabajo de investigación, por lo que se sugiere realizar más evaluaciones específicas del uso potencial de los extractos con actividad antioxidante, antiinflamatoria y analgésicas para uso medicinal e industrial. Lo anterior, por la cantidad de formas de empleo a las que son destinadas estas especies en las comunidades encuestadas y generar estudios y análisis de los patrones de distribución de C. mexicanum, para su conservación y provecho sostenible en el desarrollo comunitario.
