Introducción

El infarto agudo de miocardio (IAM) es causado por la interacción de factores ambientales y genéticos¹. De hecho, la incidencia de IAM se incrementa aditivamente en función del número de factores de riesgo cardiovascular (FRCV) convencionales, como la hipertensión arterial, la diabetes mellitus y la hipercolesterolemia. Si bien cada FRCV en sí mismo está parcialmente bajo control genético, varios estudios sugieren la existencia de genes de susceptibilidad adicionales en el desarrollo del infarto². Muchos estudios epidemiológicos han sugerido que diversas variantes genéticas incrementan el riesgo de IAM. En virtud de ello, el principal objetivo de las investigaciones genéticas es proporcionar una evaluación del riesgo completa, adicionado a los factores de riesgo clínico y bioquímico tradicionales. Existe evidencia creciente de que la inflamación tiene un papel central en la génesis de la aterosclerosis, principal mecanismo etiopatogénico del IAM³. La inflamación parece estar involucrada en todas las etapas del desarrollo aterosclerótico, incluyendo el daño oxidativo, la proliferación celular y la evolución y desestabilización de la placa de ateroma. No obstante, a pesar de la evidencia que implica que un grupo de marcadores están relacionados con la inflamación y el IAM, las interacciones con factores ambientales y los mecanismos involucrados son pobremente entendidos⁴,⁵. Mientras que la inflamación en la pared vascular puede ser consecuencia de algunos factores ambientales (infecciones bacterianas o virales, daño tisular, hábitos alimenticios, etc.), es posible que los factores genéticos puedan contribuir con una respuesta inflamatoria alterada o exacerbada. Los estudios en personas mayores han demostrado que algunas citocinas inflamatorias, como la interleucina 6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), predicen el resultado cardiovascular². Además, la variabilidad de estos genes inflamatorios puede influir en la longevidad de los humanos, al afectar las respuestas inflamatorias asociadas a enfermedades relacionadas con la edad, como la enfermedad arterial coronaria⁶. Es importante señalar que las variantes genéticas, a diferencia de los marcadores bioquímicos, son menos influenciadas por factores ambientales, por lo que constituyen un mejor marcador individual de susceptibilidad al IAM, en particular con antecedentes familiares⁷. Otra citocina importante en la enfermedad arterial coronaria y que tiene actividad antiinflamatoria es la interleucina 10 (IL-10), la cual es capaz de inhibir la adhesión de las lipoproteínas de baja densidad al endotelio y regular negativamente la biosíntesis de fibrinógeno. Se ha descrito que la concentración de IL-10 disminuye en el suero de pacientes con síndrome coronario agudo (SCA) y está inversamente relacionada con futuros eventos en pacientes con IAM, lo que sugiere un importante papel antiinflamatorio que compensa las respuestas proinflamatorias². Fundamentados en que los polimorfismos localizados en la región promotora de los genes de citocinas determinan sus concentraciones y afectan el proceso inflamatorio involucrado en la génesis de la aterosclerosis, en el presente trabajo examinamos si los polimorfismos de los genes IL6, TNFA e IL10 representan un marcador de riesgo de IAM en la población mestiza venezolana. Asimismo, se analiza la posible correlación de estos polimorfismos con los factores de riesgo tradicionales, la edad de ocurrencia y el tipo de IAM.

Método

Se realizó un estudio retrospectivo y de asociación de casos y controles, que incluyó 310 individuos venezolanos, no relacionados, clasificados en dos grupos:

Las muestras de ambos grupos fueron colectadas durante el periodo comprendido entre marzo de 2010 y noviembre de 2013. Una vez obtenidas todas las muestras, se realizó la genotipificación de los polimorfismos de genes de citocinas.

En ambos grupos se excluyeron los individuos con antecedentes de enfermedades hepáticas, autoinmunitarias, neoplásicas o IAM secundario a otras causas. Todas las personas participantes firmaron un consentimiento aprobado por el Comité de Bioética del Hospital General del Este Dr. Domingo Luciani, Caracas, Venezuela. (oficio No. 00211).

Para la determinación de los polimorfismos, el ADN genómico fue extraído de los leucocitos y linfocitos de sangre periférica utilizando el protocolo de Bunce⁸. Los polimorfismos de los genes IL6, TNFA e IL10 se determinaron mediante la técnica reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con iniciadores de secuencias específicas. Las variantes IL6-174 G/C (rs1800795), TNF A-308 G/A (rs1800629) e IL10-1082 A/G (rs1800896), -819 C/T (rs1800871) y -592 C/A (rs1800872) se determinaron empleando los iniciadores descritos por Ambruzova, et al.⁹, Verjans, et al.¹⁰ y Kingkeow, et al.¹¹, respectivamente. Para cada uno de los polimorfismos se prepararon dos mezclas de reacción, una para el alelo ancestral o silvestre (-308 G, -174 G, -1082G, -819 C y -592 C, respectivamente) y otra para el alelo mutado o poco frecuente (-308 A, -174 C, -1082 A, -819 T y -592 A, respectivamente). En todas las reacciones se incluyeron, como control interno de la PCR, los iniciadores del grupo sanguíneo ABO descritos por Olsson, et al.¹².

Las frecuencias alélicas y genotípicas se calcularon por conteo directo. La fuerza de asociación se determinó mediante la odds ratio (OR), con el correspondiente intervalo de confianza del 95% (IC 95%). La significancia estadística de las diferencias de frecuencias (genotipos, haplotipos) entre los grupos fue estimada por la prueba de ji al cuadrado, usando tablas de contingencia 2 × 2. Los valores de p se consideraron significativos cuando eran < 0.05. La determinación del equilibrio de Hardy-Weinberg de los haplotipos de los polimorfismos de la región promotora del gen del IL10 (-1082, -819, -592), los modelos de herencia y la interacción con los FRCV fueron determinados utilizando la herramienta SNPStats¹³. Las correlaciones entre los polimorfismos estudiados, los FRCV tradicionales, la ocurrencia y el tipo de IAM se realizaron utilizando el paquete estadístico SPSS Statistic versión 20¹⁴.

Resultados

De los 190 pacientes incluidos, el 33.7% eran mujeres y el 66.3% eran hombres, con un rango de edad comprendido entre 34 y 90 años (promedio de 54 ± 12.26 años). Con respecto a los 120 controles, el 45.8% eran mujeres y el 54.2% eran hombres, con un rango de edad comprendido entre 33 y 83 años (promedio de 47.5 ± 2.12 años). En cuanto a la presentación clínica del infarto, el 37.9% de los pacientes se clasificaron clínicamente como SCASEST y el 62.1% como SCACEST. Al establecer comparaciones entre los grupos observamos en el grupo de pacientes una frecuencia significativamente incrementada de hombres (OR: 1.66; IC 95%: 1.04-2.66; p = 0.016), hipertensión (OR: 6.3; IC 95%: 3.79-10.48; p < 0.00001), obesidad (OR: 6.1; IC 95%: 3.65-10.03; p < 0.00001) y hábito tabáquico (OR: 5.7; IC 95%: 3.01-10.91; p < 0.00001), así como un mayor promedio de edad (IC 95%: 6.26-11.57; p < 0.00001), con respecto a los controles (Tabla 1).

Utilizando el programa SNPstats se confirmó la existencia de equilibrio de Hardy-Weinberg para la distribución genotípica de los polimorfismos estudiados. Conjuntamente, se determinó el modelo de herencia de cada uno de los polimorfismos, estableciéndose como modelo de herencia más ajustado aquel que presentaba el valor de probabilidad (p) más bajo, siendo el modelo de herencia sobredominante el más ajustado para las variantes TNFA-308 G/A e IL10-592 C/A, codominante para la variante IL6-174 G/C y dominante para las variantes IL10-1082 A/G e IL10-819 C/T. Al realizar la comparación de frecuencias genotípicas entre pacientes y controles, considerando el modelo de herencia de cada variante y mediante el análisis de regresión logística ajustado por sexo, edad, hipertensión arterial, hábito tabáquico, obesidad, dislipidemia, diabetes y sedentarismo, observamos en los pacientes con IAM una frecuencia significativamente incrementada de la combinación de genotipos G/G-A/A de la variante TNFA-308 G/A (90.2 vs. 70.6%; OR: 3.8; IC 95%: 1.87-7.93; p = 0.00007), GG/-C/C de la variante IL6-174 G/C (86.2 vs. 73.5%; OR: 2.3; IC 95%: 1.13-4.48; p = 0.009) y A/G-G/G de la variante IL10-1082 A/G (54 vs. 23.5%; OR: 3.8; IC 95%: 2.02-7.20; p = 0.00001) con respecto a los controles. Por otra parte, al comparar las frecuencias de los genotipos de cada variante entre los pacientes que sufrieron IAM con edades ≥ 56 años y los pacientes que lo sufrieron con edades ≤ 55 años, y entre pacientes con SCACEST y con SCASEST, no se observaron diferencias significativas (Tabla 2).

Al realizar el análisis de haplotipos formados por las variantes IL10-1082, -819 C/T y -592 C/A se observaron ocho haplotipos en los pacientes y siete haplotipos en los controles, presentando el haplotipo formado por los alelos silvestre (ACC) la mayor frecuencia en ambos grupos. En contraste, el haplotipo formado por los alelos mutados (GTC) solo estaba presente en los pacientes. El análisis de asociación entre los haplotipos IL10 y el IAM mediante regresión logística ajustando por los FRCV mostró una frecuencia significativamente incrementada del haplotipo GCC en los pacientes con respecto a los controles (27.5 vs. 16.0%; OR: 3.71; IC 95%: 1.49 - 9.26; p = 0.0053). Sin embargo, al comparar las frecuencias de los haplotipos entre los pacientes que sufrieron IAM con edades ≥ 56 años y los que los sufrieron con edades ≤ 55 años, y entre pacientes con SCACEST y con SCASEST, no se observaron diferencias significativas. Finalmente, el análisis de interacción, entre pacientes y controles, de los polimorfismos de los genes de citocinas con los FRCV mostró la interacción del polimorfismo IL10-1082 A/G con la hipertensión (p de interacción = 0.015). Conjuntamente, el análisis de interacción entre pacientes que sufrieron IAM con edades ≤ 55 años y pacientes que lo sufrieron con edades ≥ 56 años mostró la interacción del polimorfismo TNFA-308 G/A y la hipertensión (p de interacción = 0.019).

Discusión

El IAM es una enfermedad multifactorial y con frecuencia está causado por una placa inestable de las arterias coronarias epicárdicas, donde los procesos inflamatorios desempeñan un papel central. En este sentido, varias moléculas proinflamatorias en circulación han sido asociadas con eventos cardiovasculares trombóticos, incluyendo proteínas de fase aguda, moléculas de adhesión celular y citocinas¹⁵. Los estudios han demostrado que las citocinas proinflamatorias, como el TNF-α, la IL-1 y la IL-6 tienen una función importante en el desarrollo de la placa aterosclerótica y, en consecuencia, en el desarrollo de la enfermedad arterial coronaria. Asimismo, distintos estudios han demostrado que la IL-10 es crucial en la regulación de la inflamación. Esta citocina es un inhibidor importante de la síntesis de citocinas proinflamatorias y se ha detectado dentro de las placas ateroscleróticas humanas, asociándose sus altas concentraciones con una disminución significativa de la muerte celular y la expresión de la enzima óxido nítrico sintasa inducible¹⁶. Dada la importancia de las citocinas en la patogenia de la enfermedad, se planteó estudiar si los polimorfismos de los genes TNFA, IL6 e IL10 representan un marcador de riesgo de IAM en la población mestiza venezolana, y analizar su correlación con los factores de riesgo, la edad de ocurrencia y el tipo de IAM.

En el presente estudio se observó una frecuencia significativamente incrementada de la combinación de genotipos G/G-A/A de la variante TNFA-308 y GG/-C/C de la variante IL6-174 en los pacientes con respecto a los controles. Los estudios funcionales han demostrado que el alelo silvestre G de la variante TNFA-308 y el alelo silvestre G de la variante IL6-174 están correlacionados con una baja producción de TNF-α y una alta producción de IL-6, respectivamente. En contraste, el alelo mutado A de la variante TNFA-308 y el alelo mutado C de la variante IL6-174 están correlacionados con una alta producción de TNF-α y una baja producción de IL-6, respectivamente. Estas citocinas proinflamatorias desempeñan un papel importante en la regulación de la síntesis de proteínas de fase aguda, tales como el fibrinógeno y el factor VIII, que son factores de riesgo de aterosclerosis¹⁵. Por lo tanto, una desregulación en la producción de estas citocinas pudiese estar confiriendo riesgo de desarrollar IAM. Por otra parte, los resultados sugieren la ventaja del genotipo heterocigoto, observándose en los individuos controles una frecuencia incrementada de los genotipos heterocigotos G/A y G/C de los polimorfismos TNFA-308 e IL6-174, respectivamente. Ambos genotipos estarían asociados con producciones moderadas de estas citocinas, confiriendo protección frente al desarrollo de IAM. Diferentes estudios han descrito que los pacientes con SCA presentan concentraciones incrementadas de IL-6¹⁷-²¹ y TNF²²-²⁷. La producción incrementada de IL-6 puede estar promoviendo la aterogénesis, contribuyendo al riesgo de IAM, o puede ser el resultado de la aterosclerosis, asociada con fuertes reacciones inflamatorias²⁸. Simultáneamente, la IL-6 regula la respuesta de fase aguda, constituyendo un activador importante en la producción de proteína C reactiva, que es una proteína de fase aguda cuyas concentraciones predicen el riego de desarrollar IAM. De hecho, se ha descrito un incremento de las concentraciones de IL-6 y de proteína C reactiva en pacientes con enfermedad cardiovascular, llegándose a establecer la relación entre la IL-6, la proteína C reactiva y la necrosis miocárdica o tamaño del infarto, confirmando la conexión entre este y la inflamación²⁹,³⁰. Conjuntamente, los estudios en pacientes con SCA sugieren que la IL-6 se asocia con lesión miocárdica por isquemia-reperfusión y mortalidad³⁰. Por otra parte, el TNF-α, producido por las células endoteliales, las células de músculo liso y los macrófagos asociados con ateroma coronario, ha sido involucrado en varios procesos cardiovasculares y es sobreexpresado en el miocardio en respuesta a la isquemia miocárdica transitoria y la reperfusión. Además, se ha hipotetizado que su sobreexpresión persistente, después de la isquemia, podría conducir a resultados coronarios adversos, y se ha sugerido que las concentraciones de TNF-α aumentan agudamente con la isquemia coronaria²⁴. Además, esta citocina induce en las células endoteliales la secreción de sustancias vasoactivas, que producen vasorrelajación o vasoconstricción, y en consecuencia influyen en la regulación de la presión arterial, observándose en el suero de los pacientes hipertensos altas concentraciones de TNF-α con respecto a los individuos normotensos³¹, lo que explicaría la interacción del polimorfismo TNF-308 y la hipertensión en los pacientes con IAM. En relación con los polimorfismos del gen IL10, se observó una frecuencia significativamente incrementada de la combinación de genotipos A/G-G/G de la variante IL10-1082 y del haplotipo IL10 GCC en los pacientes con respecto a los controles. Tres de los polimorfismos más importantes del gen IL10 (-1082, -819 y -592) generan tres haplotipos frecuentes, GCC, ACC y ATA, que determinan una expresión alta, intermedia y baja del gen, afectando así las concentraciones de esta citocina³². Específicamente, el alelo G en la posición -1082 y los haplotipos que contienen este alelo han sido asociados con una alta producción de IL-10, mientras que el alelo A y los haplotipos que contienen este alelo se han asociado con una baja producción de esta citocina³³. En la presente investigación se observó en los pacientes una frecuencia significativamente incrementada de la combinación de genotipos A/G-G/G y del haplotipo GCC, los cuales se han asociado con una alta expresión de IL-10. Estos resultados concuerdan con lo descrito en la literatura, tal como muestra un metaanálisis de 12 estudios elegibles, en el cual se describió una asociación entre altas concentraciones de IL-10 y eventos adversos en pacientes con SCA³⁴. Además, Mälarstig, et al.³⁵ demostraron que los pacientes con SCA tenían mayores concentraciones de IL-10 plasmática que los individuos sanos, y que dicha elevación en admisión estaba asociada con el número de FRCV, concluyendo que la IL-10 refleja un estado proinflamatorio en pacientes con SCA y sugiriendo que la IL-10 es un biomarcador tan eficaz para la predicción del riesgo de futuros eventos cardiovasculares como otros marcadores de inflamación sistémica. Esto estaría en concordancia con la interacción observada entre el polimorfismo IL10-1082 y la hipertensión. A pesar de la plausibilidad biológica de la IL-10 como una citocina cardioprotectora, unas elevadas concentraciones plasmáticas podrían ser un predictor, fuerte e independiente, de los resultados cardiovasculares adversos a largo plazo en los pacientes con SCA³⁶,³⁷. Una posible explicación es que numerosas citocinas tienen propiedades tanto proinflamatorias como antiinflamatorias, dependiendo dichas propiedades de las células diana, de la cantidad de citocinas y de la vía de señalización activada³⁴. Otra explicación es que el aumento de las concentraciones de IL-10 en los pacientes con enfermedad cardiovascular pudiese ser una respuesta compensatoria contra la elevación de mediadores proinflamatorios y la lesión vascular³⁶. De hecho, un estudio realizado en una cohorte pequeña de pacientes con IAM mostró que la producción espontánea de IL-10 por leucocitos en cultivos, obtenidos de pacientes con IAM, pero no las concentraciones incrementadas de IL-10 plasmática, predice un remodelado cardiaco más favorable después del IAM con el elevación del segmento ST, lo que sugiere que la asociación entre altas concentraciones plasmáticas de IL-10 y eventos cardiacos recurrentes, remodelación adversa o falla cardiaca pudiese ser espuria³⁸. Asimismo, los estudios realizados en modelos animales han demostrado la importancia de la IL-10 en el remodelado cardiaco después del infarto. En la terapia de la isquemia cardiaca múrida con células madre, la deficiencia de IL-10 en el miocardio isquémico afecta la supervivencia y la función de los exosomas derivados de la célula progenitora endotelial originada de medula ósea, mientras que el tratamiento con IL-10 mejora la remodelación y la función cardiaca, y disminuye la fibrosis³⁹. Por otra parte, el tejido adiposo pericárdico de los ratones se encuentra enriquecido con células B productoras de IL-10, las cuales facilitan la terminación de la inflamación inducida por el infarto, impactan en el balance entre monocitos proinflamatorios y antiinflamatorios después del infarto y reducen el daño del miocardio, para preservar la función cardiaca después del infarto⁴⁰. Consecuentemente, estos resultados sugieren que el uso de IL-10 recombinante pudiese ser oportuno para la prevención del remodelado cardiaco adverso en pacientes con IAM con elevación del segmento ST³⁹, y las células B productoras de IL-10 en el tejido adiposo pericárdico podrían constituir una diana terapéutica para mejorar el resultado del IAM⁴⁰.

Por lo tanto, los polimorfismos del gen IL10 pueden tener un papel importante en la patogénesis del IAM, apoyando que la IL-10 sería un biomarcador pronóstico del remodelado cardiaco tras el IAM.

Conclusiones

Los resultados del presente estudio, basados en las variantes de los genes TNFA, IL6 e IL10 asociadas con riesgo de desarrollar IAM, sugieren la existencia de un desbalance en la producción de citocinas, promoviendo un proceso inflamatorio exacerbado, lo que apoya el papel fundamental de la inflamación en todas las etapas del proceso aterosclerótico, desde su iniciación hasta la progresión de sus complicaciones.