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Introducción
Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews es una planta hemiepífita o terrestre de la familia Orchidaceae, de clima cálido, que se desarrolla en condiciones de luz y sombra bajo temperaturas de entre 20 y 30 °C, y para su desarrollo necesita un sostén (otra planta o un árbol, la cual es llamada tutor) (Hernández-Hernández, 2011). Su ciclo de vida inicia a los dos años de crecimiento vegetativo, y durante el tercer año inicia la producción de las vainas de donde se obtiene la esencia comercial mundialmente conocida como vainilla (Kelso-Bucio et al., 2012).
Esta planta posee su centro de origen en México, siendo los principales productores de vainilla los estados de Veracruz, Oaxaca, Puebla y San Luis Potosí (Luna-Guevara et al., 2016). En San Luis Potosí, los municipios con mayor producción de vainilla son Axtla de Terrazas, Tamazunchale, Aquismón, Matlapa, Coxcatlán, Huehuetlán y Xilitla, situados en la Huasteca Potosina, los cuales han desarrollado sistemas de cultivo y producción de vainilla tradicionales (Vargas-Hernández y Gámez-Vázquez, 2014; Reyes-Hernández et al., 2018).
Actualmente, la vainilla se considera una especie amenazada (NOM-059-SEMARNAT-2010), debido a la sobreexplotación, lo que ha reducido las poblaciones silvestres y mermado la diversidad genética (Soto-Arenas 1999; SAGARPA, 2010). Además, la propagación de la vainilla se encuentra limitada por problemas naturales como la reducida viabilidad de las semillas y las bajas tasas de germinación (Soto-Arenas 2006; Torres-González et al., 2011). Por esta razón, se propaga asexualmente, sin embargo, este método no garantiza la calidad de las nuevas plantaciones, y se limita a un pequeño número de esquejes por planta donante. Esta problemática afecta principalmente a los productores que dependen de este cultivo tradicional, por lo que es importante establecer alternativas que contribuyan no sólo al rescate de la especie vegetal, sino también a crear metodologías de propagación que garanticen la disponibilidad de material para solucionar las necesidades de los distintos sectores de interés (Flores-Castaños et al., 2017).
En este sentido, el cultivo de tejidos vegetales (CTV) es una herramienta biotecnológica útil para producir una gran cantidad de plantas en un tiempo relativamente corto, con calidad y rendimiento uniforme, con independencia de las variaciones geográficas, estacionales y ambientales, y sin uso de pesticidas y/o herbicidas (Rao y Ravishankar, 2002; Debnath, 2009; Espinosa-Leal et al., 2018). En la actualidad, mediante el CTV es posible micropropagar especies con problemas de conservación como las orquídeas (Gaudencio-Sedano et al., 2015). La micropropagación de orquídeas es una herramienta del CTV indispensable para la propagación in vitro de semillas y clones, especialmente con fines comerciales (Thammasiri et al., 2020).
Por lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue establecer un protocolo de regeneración in vitro de V. planifolia a través del uso de extractos orgánicos naturales (agua de coco, jugo de piña y pulpa de plátano), para garantizar la producción de plántulas de vainilla de manera orgánica.
Materiales y métodos
Material vegetal
Los especímenes de V. planifolia fueron recolectados en la comunidad de Cuichapa, Matlapa, San Luis Potosí, México (coordenadas: 21º19’4.00’’ LN y 98°49’33.99’’ LW), y proporcionados por el Centro de Acopio y beneficiado de vainilla, palmilla, café, piloncillo y derivados GANCA, S.P.R de R.L. (Grupo Antonio Calderón). Las plantas fueron colocadas en maceta con tierra de jardín, y adaptadas en condiciones de invernadero (25 °C y 70 % de humedad). La polinización de estas plantas se realizó de forma manual siguiendo la metodología establecida por Menchaca-García (2011). Para inducir la germinación de las semillas se utilizó el medio basal con vitaminas MS (Murashige y Skoog, 1962; Phyto Technology Laboratories, LLC., Lenexa, Kansas) suplementado con 30 g L−1 de sacarosa, 5.0 g L-1 de carbón activado (Karal S.A. de C.V, León, México) y 8 g L−1 de agar (Phyto Technology Laboratories, LLC., Lenexa, Kansas, Shawnee Mission, Kansas; Plant Tissue Culture grade).
El pH de los medios de cultivo se ajustó a 5.7 y se esterilizaron a 120 °C por 20 minutos (1.37×105 Pa). Los cultivos se mantuvieron a 25 °C con un fotoperiodo de 16 horas de luz a 45 μmol m−2 s−1 y 8 horas de oscuridad, la luz fue suministrada con lámparas fluorescentes blanco frío (Phillips, Saltillo, México).
Asepsia de la cápsula y protocolo de germinación
En el presente trabajo, la micropropagación in vitro se realizó utilizando semillas inmaduras de V. planifolia provenientes de frutos de 15 cm de longitud, obtenidos por polinización artificial en condiciones de cultivo de malla-sombra.
Las cápsulas de V. planifolia antes de la dehiscencia fueron desinfectadas de forma superficial con jabón antibacterial al 40 % por 20 min, AgNO3 al 10 % por 15 minutos, etanol al 70 % por 2 min, con hipoclorito de sodio al 10 % y tres gotas de Tween® 80 en 100 mL de agua durante 10 min. Finalmente, se lavaron tres veces con agua destilada estéril. Las semillas fueron cultivadas para germinar en medio MS basal adicionado con 5 % (p/v) de carbón activado (Karal S.A. de C.V, León, México) sin reguladores de crecimiento vegetal.
Los medios de cultivo con las semillas inoculadas se mantuvieron en oscuridad por cuatro semanas dentro del cuarto de cultivo del Laboratorio de Investigación en Ciencias Ambientales de la U.A.S.L.P., a una temperatura de 25 °C, y posteriormente otras cuatro semanas con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad, la luz fue suministrada con lámparas fluorescentes blanco frío (Phillips, Saltillo, México).
Inducción de brotes a partir de protocormos
Para inducir el desarrollo de brotes, se utilizaron protocormos de 16 semanas de edad. Las vitroplantas se cultivaron en medio MS con 15 g L−1 de sacarosa, 0.5 % de carbón activado, 8 g L−1 de agar phytagel (Phyto Technology, Shawnee Mission, KS; Plant Tissue Culture grade), y se suplementaron con extractos orgánicos naturales, resultando las siguientes combinaciones: medio MS sin extractos (control), medio MS con 10 g L−1 de extracto de piña (MPI), medio MS con 10 g L−1 de extracto de plátano (MPL) y medio MS con 30 mL L−1 de agua de coco (MCO). Los sustratos naturales utilizados fueron obtenidos de Phyto Technology Laboratories.
El pH de los medios se ajustó a 5.7 con NaOH 1N y/o HCl 1N. Los protocormos se sembraron en estos medios de cultivo durante 60 días, y se mantuvieron a 25 °C con un fotoperiodo de 16 h de luz a 45 μmol m−2 s−1 y 8 horas de oscuridad, la luz fue suministrada con lámparas fluorescentes blanco frío (Phillips, Saltillo, México). Se realizaron evaluaciones mensuales del número y altura de los brotes nuevos producidos.
Enraizamiento de los brotes
Los brotes de V. planifolia mayores a 4 cm se retiraron del medio de cultivo, se enjuagaron en agua destilada estéril para eliminar por completo los restos del medio de cultivo, y se sembraron en recipientes de vidrio de 100 mL con diferentes tratamientos para inducir la formación de la raíz. Los tratamientos fueron los siguientes: i) medio MS basal (Tratamiento Control); ii) medio MS con 10 g L−1 de extracto de piña más 1 mg L−1 de 6-bencilaminopurina (BAP) más 0.5 mg L−1 de AIA (Tratamiento 0.5 AIA) y iii) medio MS con 10 g L−1 de extracto de piña más 1 mg L−1 6-bencilaminopurina (BAP) más 1.0 mg L−1 de AIA (Tratamiento 1.0 AIA). Los diferentes tratamientos se preservaron en condiciones del cuarto de cultivo, y se registró el número y la longitud de raíces, y el porcentaje de oxidación durante 60 días.
Preaclimatación in vitro
Las plántulas de V. planifolia mayores a 6 cm y con mayor número y longitud de raíces se retiraron de los medios de cultivo, se enjuagaron en agua destilada estéril, y se sometieron a un proceso de pre aclimatación in vitro, para lo cual se sembraron en frascos de vidrio con capacidad de 500 mL con diferentes tratamientos: i) suelo orgánica estéril (control), ii) suelo orgánico estéril con 1.0 mg L−1 de AIA (Tratamiento TAIA1.0) y iii) suelo orgánico estéril con 2.0 mg L−1 de AIA (Tratamiento TAIA2.0). Las vitroplantas se preservaron en condiciones del cuarto de cultivo, y se registró la longitud, el número de hojas, el porcentaje de oxidación y el porcentaje de contaminación semanalmente durante 41 días de cultivo.
Diseño experimental y análisis estadístico
Se utilizó un diseño completamente al azar para comparar los tratamientos. En cada tratamiento evaluado se establecieron 10 frascos como repetición, en cada frasco se sembraron cinco vitroplantas, para un total de 50 vitroplantas por tratamiento. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar. Su desarrollo en cada tratamiento fue evaluado mensualmente. Se registraron tres variables en la primera etapa de inducción de brotes (número de brotes, altura de los brotes, formación de yemas), en la segunda etapa denominada enraizamiento se registraron dos variables (número de raíces y longitud de raíces), y en la última etapa denominada pre aclimatación se evaluaron dos variables adicionales (altura de las plantas y formación de hojas nuevas).
Todos los datos fueron registrados como media ± error estándar de la media (SEM). Posteriormente, para cada variable se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía tipo modelo lineal general (MLG), verificando previamente los supuestos de normalidad (prueba de Kolmogorov-Simirnov) y homogeneidad de varianzas (prueba de Levene). Adicionalmente, se utilizó la prueba de Tukey (p < 0.05) para comparar las medias entre los diferentes tratamientos. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa Statistic para Windows, versión 8.0.
Resultados
Germinación de las semillas
La germinación asimbiótica de las semillas de V. planifolia se logró a los 90 días de cultivo in vitro, en donde se observó un porcentaje de germinación mayor al 90 % (Figura 1). La germinación se indujo al colocar las semillas en la oscuridad durante los primeros 30 días. Posterior a los 60 días de cultivo, se observó un hinchamiento y cambio de coloración de las semillas, que culminó con la formación de protocormos (PLB´s: Protocorm Like Bodies) a los 90 días (Figura 2A).
Figura 1 Germinación de semillas y crecimiento de plántulas de V. planifolia.
Las semillas germinaron en medio MS basal adicionado con 1 % (p/v)
de carbón activado.
Figure 1. Seed germination
and seedling growth of V. planifolia. Seeds
germinated in basal MS medium added with 1 % (w/v) of activated
charcoal.
Figura 2 Desarrollo morfológico de V. planifolia. (A) Protocormo; (B)
Formación de brote a partir de protocormo; (C) Aparición de yemas en
los brotes; (D), Formación de raíces y hojas. Barra 1 cm.
Figure 2. Morphological development of V.
planifolia. (A) Protocorm; (B) Outbreak formation from
protocorm; (C) Bud appearance; (D), Roots and leaves formation.
Bar 1 cm.
Efecto de sustratos naturales sobre la formación de brotes a partir de protocormos
Una vez formados los protocormos de V. planifolia, se observó el crecimiento de pequeños brotes apicales de color verde oscuro a los 28 días de cultivo, como resultado del cultivo de éstos en los tratamientos con diferentes sustratos orgánicos. El porcentaje de respuesta fue dependiente del tratamiento empleado. Se observó un 100 %, 93.4 %, 33.5 % y 33 % de respuesta en los MCO, MPI, MPL y control, respectivamente.
La formación de brotes definidos se presentó hasta los 120 días de cultivo, después de dos subcultivos realizados cada 60 días (Figura 2B). Se consideraron brotes definidos, aquellos que presentaron al menos una yema con dos hojas. El tratamiento suplementado con extracto de piña (MPI) fue en donde se observó la mayor producción de brotes (5.7 ± 3.5), resultado significativamente diferente con respecto al control. El tratamiento MCO produjo 4.6 ± 2.7 brotes, seguido del control (4.6 ± 3.3 brotes) y el tratamiento con extracto de plátano (MPL) el cual produjo 4.2 ± 2.7 brotes. Los tratamientos MCO y MPL no mostraron diferencia estadística significativa, respecto al control (Figura 3A).
Figura 3 Respuesta de las vitroplantas de V. planifolia a la adición de EO.
(A) Producción media del número de brotes; (B) Altura media de los
brotes producidos; (C) Producción media del número de yemas. Las
barras de error representan el error estándar de las concentraciones
(n = 50). Las medias con diferentes letras muestran diferencias
significativas (p < 0.05) de acuerdo con el análisis de Tukey.
Extractos orgánicos: MPI (piña); MPL (plátano); MCO (agua de coco.)
Figure 3.
V. planifolia vitroplants response to OE addition.
(A) Average production of shoots; (B) Average height of shoots
produced; (C) Average production of buds. Error bars represent the
standard error of the concentrations (n = 50). Means with different
letters show significant differences (p < 0.05) according to
Tukey’s analysis. Organic extracts: MPI (pineapple); MPL (banana);
MCO (coconut water).
En relación con la altura de los brotes, se observó un mayor incremento en los tratamientos MPI y MCO, cuyas alturas oscilaron entre 36.9 ± 17.3 y 35.1 ± 18.8 mm respectivamente, resultados estadísticamente significativos respecto al control (p < 0.05). Los brotes desarrollados en el tratamiento control y el MPL alcanzaron una altura de 20 ± 19 mm y 24 ± 18.8 mm, respectivamente (Figura 3B).
A los 120 días de cultivo, se presentó la formación de yemas en los brotes. El tratamiento MPI desarrolló 2.2 ± 0.5 yemas, lo cual fue estadísticamente significativo (p < 0.05) respecto al control, el cual desarrollo sólo 1.5 ± 0.3 yemas. Los tratamientos MCO y MPL registraron el desarrollo de 1.5 ± 0.2 y 1.0 ± 0.3 yemas por explante, sin mostrar diferencias estadísticamente significativas con respecto al control (Figura 3C).
Efecto de la concentración de ácido indol acético (AIA) sobre la rizogénesis de los brotes
Para el proceso de rizogénesis de los brotes de V. planifolia, en los tratamientos adicionados con AIA se evaluaron dos variables: 1) la producción del número de raíces y 2) la longitud que alcanzaron las raíces desarrolladas. Los resultados mostraron que el máximo porcentaje de brotes con raíces se obtuvo a los 66 días de cultivo en el tratamiento 0.5 AIA el cual presentó un 61 % de respuesta, mientras que el control presentó un 41 % y un 17 % en el tratamiento 1.0 AIA. La mayor producción del número de raíces se obtuvo en el tratamiento adicionado con 0.5 mg L-1 de AIA, en el cual se desarrollaron 13.0 ± 0.9 raíces por brote. Los tratamientos control y el adicionado con 1.0 mg L-1 de AIA mostraron los valores más bajos para la producción de raíces (5.0 ± 1.0 y 3.0 ± 0.4 raíces por brote, respectivamente) sin diferencias significativas entre ellos (p > 0.05).
Los resultados observados en el tratamiento 0.5 AIA fueron estadísticamente significativos (p < 0.05) respecto a los dos tratamientos restantes (Figura 4A). La longitud de las raíces también fue mayor en el tratamiento adicionado con 0.5 mg L-1 de AIA, en el cual las vitroplantas desarrollaron una longitud promedio de 23.0 ± 0.9 mm. Este resultado fue estadísticamente significativo (p < 0.05) cuando se comparó con los otros dos tratamientos. Finalmente, el tratamiento adicionado con 1.0 mg L-1 de AIA registró la menor longitud radicular (15.0 ± 2.8 mm), seguido del tratamiento control (20.0 ± 1.5 mm) (Figura 4B).
Figura 4 Efecto de las concentraciones de ácido indol acético (0.5 mg L-1 y 1.0 mg
L-1) sobre la rizogénesis de brotes obtenidos de
V. planifolia. (A) Producción media del número
de raíces desarrolladas; (B) Longitud media de las raíces
desarrolladas. Las barras de error representan el error estándar de
las concentraciones (n = 50). Las medias con diferentes letras
muestran diferencias significativas (p < 0.05).
Figure 4. Indol acetic acid concentrations
effect (0.5 mg L-1 and 1.0 mg L-1) on the rhizogenesis of V.
planifolia vitroplants. (A) Average production of
developed roots; (B) Average length of developed roots. Error bars
represent the standard error of the concentrations (n = 50). Means
with different letters show significant differences (p <
0.05).
Preaclimatación in vitro de las plántulas
Después de 45 días del proceso de aclimatación de las vitroplantas de V. planifolia, se observó que las plántulas mostraron un incremento en la altura de 18.0 ± 1.2 mm, de 15.0 ± 1.0 mm y de 14.0 ± 0.8 mm en los tratamientos TAIA0.5, control TAIA1.0, respectivamente (Figura 5A). La respuesta observada en el tratamiento TAIA0.5 fue estadísticamente diferente respecto al control (p < 0.05).
Figura 5 Efecto de las concentraciones de AIA (0.5 mg L-1 y 1.0 mg L-1)
sobre la pre-aclimatación de vitroplantas de V.
planifolia. (A) Incremento de la altura desarrollada;
(B) Promedio del número de hojas desarrolladas. Las barras de error
representan el error estándar de las concentraciones (n = 50). Las
medias con diferentes letras muestran diferencias significativas (p
< 0.05).
Figure 5. IAA concentrations effect
(0.5 mg L-1 and 1.0 mg L-1) on the pre-acclimatization of V.
planifolia vitroplants. (A) Increase in developed
height; (B) Average number of leaves developed. Error bars represent
the concentrations standard error (n = 50). Means with different
letters show significant differences (p < 0.05).
En cuanto a la formación de hojas nuevas (Figura 5B), se observó la producción de 1.8 ± 0.5 hojas por planta en los tratamientos TAIA0.5 y TAIA1.0, a diferencia del control (1.0 ± 0.5), resultando estadísticamente significativos (p < 0.05).
Discusión
En el entorno natural, las orquídeas necesitan de la simbiosis con micorrizas tanto en la etapa de germinación de las semillas como en la etapa de desarrollo de las plántulas (Rasmussen et al., 2015). Sin embargo, a través del cultivo in vitro, la mayoría de las orquídeas pueden germinar de manera asimbiótica en un medio de cultivo estéril en el cual se les proporcionan todos los nutrientes necesarios para su desarrollo (Yang et al., 2017). En el caso de V. planifolia, sus semillas presentan las mismas limitantes que el resto de las orquídeas para poder germinar. Menchaca, 2019, indica que la germinación de las semillas depende de la etapa de maduración del fruto, por ejemplo, se ha logrado un 50% de germinación in vitro en semillas obtenidas después de 154-200 días de polinización natural, y más de un 80% de germinación in vitro en semillas producidas después de 44 días de la polinización artificial.
En el presente estudio, la germinación se vio favorecida al colocar las semillas durante 30 días en la oscuridad, lo cual redujo el fenómeno de fotoxidación (Flores-Castaños et al., 2017), y permitió que las semillas comenzaron a germinar a los 60 días, alcanzando un máximo de germinación del 90% a los 90 días de cultivo in vitro, y sin la adición de reguladores de crecimiento. Además, el porcentaje de germinación obtenido en este estudio, también se puede atribuir al tamaño del fruto empleado (15 cm), considerándose como un porcentaje alto al compararse con otros estudios realizados con esta misma especie vegetal, en donde se han obtenido porcentajes de germinación del 85 % al añadir otros componentes al medio de cultivo como glutamina y sulfato de adenina (Menchaca-García, 2011), y de un 90 % cuando se utilizaron semillas inmaduras de V. planifolia provenientes de frutos con un tamaño máximo de 10 cm, en condiciones similares a las evaluadas en el presente estudio (Flores-Castaños et al., 2017).
En cuanto al tiempo de germinación, éste depende del tipo de especie o híbridos de vainilla con los que se trabaje, por ejemplo se ha reportado que para V. planifolia la germinación ocurre de 100 a 130 días, para V. insignis ocurre a los 70 días, mientras que para los híbridos de Vainilla planifolia x Vanilla pompona la germinación ocurre a los 40 días (Menchaca, 2019). Los resultados de germinación observados en esta investigación concuerdan con los tiempos de germinación establecidos para V. planifolia, lo cual demuestra que el protocolo establecido fue adecuado para iniciar con la micropropagación de la vainilla.
Existen otros estudios sobre la propagación in vitro de vainilla a través del uso de yemas axilares (Lozano-Rodríguez et al., 2015), segmentos nodales (Ayele et al., 2017), esquejes y explantes nodales (Biradar et al., 2016), ápices y brotes apicales (Morwal et al., 2015; Gätjens-Boniche et al., 2018). Sin embargo, en dichos trabajos se utilizan fitohormonas sintéticas para inducir la morfogénesis de los brotes, y no existen reportes en donde se hayan utilizado sustratos naturales como el extracto de plátano, piña y agua de coco en todas las etapas del cultivo in vitro como se realizó en el presente estudio.
La adición de sustratos orgánicos naturales como el agua de coco, peptona, homogeneizado de papa, homogeneizado de plátano, jugos, y extracto de levadura puede promover el desarrollo de los brotes cultivados in vitro dado que representan una fuente de vitaminas, aminoácidos, ácidos grasos, carbohidratos, péptidos y hormonas de crecimiento (Edy & Sucipto, 2020). En el presente estudio la adición de los extractos naturales favoreció la formación y elongación de brotes a partir de protocormos de V. planifolia, al proveerles los nutrientes necesarios para su desarrollo.
En estudios similares, se observó un incremento en el número y longitud de los brotes cuando se utilizó agua de coco en la propagación in vitro de la orquídea Vanda pumil (Maharjan et al., 2019), así como un incremento significativo en la altura de las plántulas de Phalaenopsis amboinensis cuando se utilizó una combinación de extracto de plátano y agua de coco (Utami & Hariyanto, 2019). Además, la adición de jugo de piña durante la micropropagación de Dendrobium ovatum y Laelia rubescens Lindl, promovió el desarrollo de las plántulas (Thejaswini y Narasimhan, 2017; Mayo-Mosqueda et al., 2020). Los sustratos naturales favorecen la organogénesis a su vez contribuyen con la disminución de costos en el proceso de propagación in vitro (Velázquez-Kú et al., 2016). Además, se ha demostrado que los sustratos orgánicos como la piña, el plátano y el agua de coco, promueven la morfogénesis y rizogénesis dado que producen efectos similares al de las auxinas y citocininas (Menezes et al., 2016).
En la etapa de la rizogénesis de V. panifolia evaluada en este estudio, las raíces que se produjeron en los tratamientos con AIA mostraron vigorosidad y buena calidad, dado que se observaron de un color verde brillante y con desarrollo de velamen (Figura 2D). Estos resultados coinciden con lo reportado por Castillo-Pérez et al. (2020), quienes también lograron la producción de velamen en condiciones in vitro al propagar la orquídea Laelia anceps subsp. anceps, además de sugerir que la formación de estas estructuras en las raíces favorece el proceso de aclimatación. Por otro lado, es importante mencionar que la auxina AIA es ampliamente utilizada en procesos de micropropagación in vitro, tanto en orquídeas, como en diversas especies forestales y de importancia comercial, dado que promueve y favorece el desarrollo de raíces laterales y adventicias (Jainol y Gansau, 2016; Liao et al., 2017; Elmongy et al., 2018; Seon et al., 2018).
La longitud de las raíces es otra característica favorable que produce el uso del AIA cuando es adicionado a los medios de cultivo para la propagación in vitro de plantas. Este efecto se debe principalmente al estímulo que se lleva a cabo en la biosíntesis de proteínas y que repercute de forma positiva en el crecimiento de las raíces (Shahab et al., 2009; Boivin et al., 2016). Interesantemente, los resultados de esta investigación concuerdan con lo reportado por Maharjan et al. (2019) quienes establecieron la propagación in vitro de la orquídea epífita Vanda pumila, y encontraron que la adición de 0.5 mg L-1 de AIA favorece la producción y elongación de raíces. Sin embargo, observaron también que al agregar concentraciones mayores a 1.0 mg L-1 de AIA disminuía el desarrollo y la longitud de las vitroplantas. Además, Maharjan et al. (2020) encontraron que al adicionar 1.5 mg/L IAA al medio (½ M.S) se promovía el enraizamiento de las orquídeas Dendrobium chryseum.
Finalmente, es importante mencionar que este efecto se ha observado también en el cultivo in vitro de otras especies que no pertenecen a la familia Orchidaceae, por ejemplo, en el cultivo in vitro de Dahlia sp. se observó que las concentraciones mayores a 1 mg L-1 de AIA disminuyeron la producción y elongación de la raíz (Jiménez-Mariña, 2020). La concentración de AIA a emplear, dependerá del tipo de especie vegetal, y del tipo de morfogénesis que se quiera lograr durante la micropropagación. En este estudio, las concentraciones de 0.5 y 1.0 mg L-1 de AIA favorecieron también la etapa de pre aclimatación in vitro en otros soportes empleados como la tierra de jardín, al promover la elongación y maduración de las raíces.
El cultivo de tejidos sigue siendo una herramienta indispensable para la producción comercial de orquídeas, debido a su bajo costo, uniformidad, rápida propagación y alto rendimiento en poco tiempo período de tiempo. Por ejemplo, la mayoría de las orquídeas de flores cortadas (Dendrobium, Oncidium, Mokara, Aranda, Ascocenda, y Cattleya alliances) se propagan con éxito a través de la micropropagación, obteniendo hasta más de 10,000 plántulas a nivel de laboratorio listas para crecer en condiciones de invernadero (Kanchit et al., 2020). Los resultados observados en este estudio demostraron los efectos benéficos de los extractos naturales sobre la micropropagación in vitro de V. planifolia, el cual en un futuro podría desarrollarse a gran escala para producir de manera comercial esta especie vegetal en la Huasteca Potosina. Además, por tratarse de la única orquídea que produce frutos comestibles, se justifica el uso de sustratos naturales para la producción orgánica de la vainilla. Sin embargo, aún faltan realizar estudios sobre la aclimatación de las plantas en el medio ambiente natural, y determinar si esta aclimatación requerirá de la simbiosis con las micorrizas de las plantaciones naturales. Por ello, es importante la vinculación con los sectores sociales y productivos, de manera que en un futuro cercano se logre la transferencia de tecnología desarrollada a los productores de vainilla de la región Huasteca.
Conclusiones
Se logró el 90% de germinación in vitro asimbiótica para las semillas de V. planifolia, y la formación de protocormos. La adición de extractos naturales a los medios de cultivo favoreció la formación de brotes y de plantas in vitro, reduciendo así el uso de fitohormonas sintéticas. Los resultados mostraron que el mejor tratamiento fue el extracto de piña, en donde se observó la formación de 5.7 ± 3.5 brotes de 36.9 ± 7.3 mm de altura, y de 2.2 ± 0.5 yemas por brote. Además, se logró la formación de 13.0 ± 1.1 raíces por brote con la adición de 0.5 mg L-1 de AIA, y la pre aclimatación de las plantas en condiciones in vitro. Estos resultados contribuyen a la creación de una nueva metodología de micropropagación in vitro para la vainilla, la cual contribuirá a reducir la presión de la sobreexplotación de V. planifolia, y permitirán su conservación en la Huasteca Potosina. Además, en un futuro esta herramienta biotecnológica podrá explotarse a nivel comercial para la propagación masiva de vainilla.
