Material biológico

Las cepas Pycnoporus sangineus LE90, LE133 y CH116 son cepas nativas del estado de Nuevo León, resguardadas en el Laboratorio de Enzimología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de Nuevo León. Las cepas fueron reactivadas en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA, BD Bioxon, México) por 5 días para la preparación del inóculo.

Actividad lacasa

La actividad lacasa fue determinada midiendo la oxidación de 2,6-dimetoxifenol (DMP) a 468 nm [ε468 = 49,600 M−1 cm−1]. La mezcla de reacción fue preparada en una solución amortiguadora de acetato de sodio (200 mM), ajustado a pH 3.5 con 2 mM de DMP (^{Abadulla et al., 2000}). Las actividades enzimáticas se expresaron en unidades (U) definidas como la cantidad de enzima requerida para producir 1 μmol de producto por minuto. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo por triplicado a 25 °C en un espectrofotómetro UV-Vis 1800 (Shimadzu, Japon).

Carbohidrolasas y azúcares reductores

Las actividades celulasas, xilanasas y amilasas fueron detectadas determinando la cantidad de azúcares reductores liberados en la reacción siguiendo el método establecido por ^{Miller et al. (1959)}. Las mezclas de reacción consistieron en 0.5 mL de la solución amortiguadora citrato de sodio (50 mM), ajustado a pH 5.0, 0.3 mL de sustrato 1 % (w/v) dependiendo de la actividad a determinar (CM-celulosa, número de catálogo C4146; D-xilano, número de catálogo X0502; o almidón, número de catálogo 33615; Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA)) y 0.2 mL de muestra. Las reacciones fueron incubadas por 15 min a 60 ºC. Para la cuantificación azúcares reductores fueron agregados 0.1 mL de la mezcla de reacción a 0.1 mL de ácido dinitrosalicílico (DNS) (^{Miller et al., 1959}), fueron hervidas durante 5 min a 100 ºC y posteriormente sumergidas en un baño con hielo a -4 ºC. Después, para determinar fotométricamente la absorbancia de las muestras se les agregó 1 mL de agua bidestilada y se procedió a leer a una longitud de onda de 540 nm en espectrofotómetro (Shimadzu UV-Vis 1800, Japón). Para la cuantificación de las celulasas y amilasas fue utilizada una curva de glucosa en un rango de 0 a 1 mg, para las xilanasas fue utilizada una curva de xilano en el mismo rango. Una unidad de enzima (U) fue definida como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 μmol de glucosa o xilano por minuto. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo por triplicado a 25 °C.

Cinética de producción de lacasa

La cinética de producción y el efecto de la composición del medio sobre lacasa fueron realizados en medio Kirk modificado (^{Pozdnyakova et al., 2006}). La composición consistió en 5 g l^-1 de peptona (Bacto peptone, BD BIOXON México), 1 g l^-1 de extracto de levadura (BD BIOXON México), 2 g l^-1 de tartrato de amonio, 1 g l^-1 de KH2PO4, 0.5 g l^-1 de MgSO4, 0.5 g l^-1 de KCl, 10 mL l^-1 de la solución de elementos DMS 100x. La solución DMS contenía 5 g l^-1 de EDTA, 2 g l^-1 de FeSO4, 0.1 g l^-1 de ZnSO4, 0.03 g l^-1 de MnCl2, 0.3 g l^-1 de H2BO4, 0.2 g l^-1 de CoCl2, 0.01 g l^-1 de CuSO4 y 0.03 g l^-1 de NaMoO4. A partir de este fueron establecidas tres condiciones de medio de cultivo, donde lo medio Tx1 fue elaborado con All Bran Flakes® (BF) al 2 % como fuente de carbono. El medio Tx2 además del BF al 2 %, fue suplementado con CuSO4 (350 μM) como inductor de lacasa. El medio Tx3 contenía glucosa (10 g l^-1) y xilano (20 g l^-1) como fuentes de carbono y CuSO4 (350 μM). Los ingredientes declarados en el producto comercial a base de salvado de trigo BF son: trigo integral (59 %), salvado de trigo (18 %), harina de trigo integral, azúcar, extracto de malta de cebada, jarabe de glucosa, sal, aroma natural. Todos los medios fueron esterilizados en autoclave a 121 °C, a 15 lb por 15 min. Posteriormente, fueron inoculados con tres cilindros de 0.5 cm de diámetro, tomados de la periferia de cultivos con 5 días de crecimiento. La incubación fue realizada en un agitador orbital con control de temperatura (New Brunswick Scientific Co. G 25 Inc., Edison, NJ, USA) a 28 °C y 150 rpm. Alícuotas de 2 mL fueron tomadas cada tercer día por un periodo de 30 días, las cuales fueron almacenadas a -20 ºC hasta el momento de su análisis.

Potenciales hemicelulolítico y amilolítico

La evaluación de los potenciales hemicelulolítico y amilolítico fue realizada en medio sólido, utilizando los medios descritos por ^{Sin et al. (2002)}. El medio base consistió en 0.1 % de peptona, 0.01 % de extracto de levadura y 1.6 % de agar, suplementado con carboximetilcelulosa (2 %), xilano (2 %) o almidón (2 %) para determinar la actividad de celulasas, xilanasas y amilasas, respectivamente. Los medios fueron esterilizados en una autoclave a 121 °C y 15 lb por 15 min. Una vez vertidos en las placas Petri, fueron inoculados en el centro con un cilindro de 0.5 cm de diámetro tomado de la periferia de cultivos con 5 días de crecimiento. Los medios fueron incubados a 28 °C. El diámetro del crecimiento fue medido diariamente por tres días con un vernier. Para determinar el diámetro de hidrólisis enzimática fue utilizada una solución de yodo-yoduro. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.

El índice de degradación (ID) fue estimado con la siguiente fórmula:

Donde: D es el diámetro de degradación y C es el diámetro de crecimiento.

Obtención de concentrados enzimáticos

Una vez definidas las cinéticas de producción de lacasa y seleccionado el medio de mayor producción, fueron preparados matraces de 2 l, conteniendo 1 l del medio seleccionado, previamente esterilizado e inoculado con seis cilindros de 0.5 cm de diámetro tomado de la periferia de cultivos con 5 días de crecimiento. Los cultivos fueron incubados en un agitador orbital con control de temperatura (New Brunswick Scientific Co. G 25 Inc., Edison, NJ, USA) a 28 °C y 150 rpm. A los 18 días de crecimiento, los sobrenadantes fueron recuperados por filtración y posteriormente concentrados con un cartucho de ultrafiltración con corte molecular de 10kDa en una membrana tipo espiral prep/scale TFF-6 PLCC (Merck Millipore, Germany). Después de ser recuperados los concentrados enzimáticos, fueron determinados los títulos de lacasa, celulasas, xilanasas y amilasas. Finalmente, fueron almacenados en congelación a -20 ºC hasta su uso.

Análisis estadístico

La significancia estadística en la actividad enzimática en medio sólido y líquido fue determinada mediante un análisis de varianza ANOVA y posterior comparación de medias con una prueba Tukey (P< 0.05). El análisis estadístico se llevó a cabo con el programa estadístico computacional InfoStat Versión 2020e.

Cinética de producción de lacasa

La cinética de producción para la cepa LE90 mostró la mayor producción en el medio Tx2, seguido por Tx3 (Figura 1A). En ambos medios se observó un incremento en la producción a partir del día 14, con picos máximos los días 20 (1888.72 U∙l^-1), 26 (2161.62 U∙l^-1) y 30 (2617.78 U∙l^-1) para Tx2 y los días 18 (1367.59 U∙l^-1) y 24 (1876.49 U∙l^-1) para Tx3. El medio Tx1 fue el de menor producción, con títulos menores a 400 U∙l^-1.

Figura 1 Curvas de producción de lacasa por Pycnoporus sangineus. Donde A) corresponde a la cepa LE90, B) LE133 y C) CH116 cultivadas en los tres medios de cultivo.
Figure 1. Laccase production curves by Pycnoporus sangineus. Where A) corresponds to strain LE90, B) LE133 and C) CH116 grew in the three-culture media. 

Las curvas de producción de lacasa para la cepa LE133 (Figura 1B) mostraron la mayor actividad en Tx2, donde la actividad incrementó sus títulos a partir del día 18 manteniendo el incremento a lo largo del tiempo hasta alcanzar 2792.36 U∙l^-1 al día 30. En el medio Tx3, la mayor producción fue observada entre los días 14 y 24, disminuyendo a partir del día 26. En el medio Tx1, LE133 mostró el mismo comportamiento que la cepa LE90, pero con menores títulos de producción.

En la Figura 1C se muestran las curvas de producción de la cepa CH116, que presentó los mayores títulos de producción en el medio Tx2, con un comportamiento ascendente a partir del día 14 y con picos máximos al día 16 (1144.21 U∙l^-1), 26 (2197.64 U∙l^-1) y 30 (2776.97 U∙l^-1). En el medio Tx1 fueron registrados los menores títulos de actividad. A diferencia de las cepas LE90 y LE133, CH116 mostró títulos inferiores a 1000 U∙l^-1 en el medio Tx3.

En general, las tres cepas alcanzaron la mayor producción de lacasa en el medio Tx2. LE90 y CH116 mostraron un incremento exponencial a partir día 12 hasta el día 16. Sin embargo, existieron diferencias estadísticamente significativas entre las cepas (P ≤ 0.05) y los medios utilizados (P ≤ 0.01). En la Tabla 2 son mostrados los resultados de la producción de lacasa en el medio Tx2, donde se comparan los títulos de las tres cepas en los días con mayor actividad, que podría estar asociado a la producción de diferentes isoformas.

Hay que destacar que Pycnoporus sanguineus es un género de basidiomicetos productor de lacasas termoestables (^{Orlikowska et al., 2018}) con alto potencial redox (^{Zimbardi et al., 2016}), considerando que la composición del medio influye en los títulos de producción (^{Zimbardi et al., 2016}). Lo que explica, que las cepas estudiadas en el presente trabajo tuvieron la mayor actividad en el medio de cultivo Tx2. Además, éste podría ser el resultado de la presencia de inductores naturales como los componentes de pared celular del salvado de trigo (^{Riegas-Villalobos et al., 2020}) y al cobre suplementado como inductor inorgánico (^{Zhuo et al., 2017}). Sin embargo, los títulos fueron menores a lo reportado para la cepa P. sanguineus CS43 en condiciones similares de cultivo (^{Ramírez-Cavazos et al., 2014}), pero similares a los observados en la cepa Pycnoporus sanguineus CS2 (^{Gutiérrez-Soto et al., 2015}). Estas diferencias entre cepas pueden ser explicadas por la presencia de glucosa como fuente principal de carbono en combinación con otros inductores.

Por otro lado, la producción tuvo un comportamiento ascendente no lineal, cuyos picos podrían indicar la presencia de isoformas de lacasas, principalmente en los medios suplementados con cobre (^{Pezzella et al., 2012}; ^{Vrsanska et al., 2016}). En este sentido, generalmente las cepas de Pycnoporus sanguineus producen al menos dos isoformas de lacasa (^{Li et al., 2016}; ^{Salazar-López et al., 2017}; González-Bautista, 2019). La diversidad en las isoformas producidas por los hongos de esta especie sugiere una mayor capacidad para acceder a diferentes fuentes de carbono y nitrógeno, lo cual le concede un poder de adaptación en disímiles ambientes de crecimiento (^{Bertrand et al., 2015}). El análisis de las isoformas constitutivas e inducidas de las cepas será abordado en otros estudios.

Potenciales hemicelulolítico y amilolítico

En la Figura 2 se presentan los resultados de los potenciales hemicelulolítico y amilolítico. La producción de amilasas no mostró diferencia estadísticamente significativa entre las cepas (P > 0.05), mientras que las celulasas y xilansas si mostraron diferencias (P ≤ 0.05). Las cepas LE133 y CH116 tuvieron valores del ID de 1.2 para la celulosa. En cambio, CH116 mostró mayor actividad de xilanasas con índices de degradación mayores a 1.0. De forma general, las tres cepas mostraron mayor actividad de celulolítica concordando con lo reportado en aislados nativos de Nuevo León por ^{Medina-González et al. (2016)}. Sin embargo, los ID de las cepas de P. sanguineus fueron menores al rango mencionado por estos mismos autores de 1.032-2.559 y 1.077-1.188 para celulosa y xilano, respectivamente. Este comportamiento puede ser explicado a nivel de secretoma para esta especie que, bajo condiciones de cultivo ricas en lignocelulosa, el 2 % de las enzimas producidas por este hongo corresponden a las de actividad celulolítica y otro 2 % a las hemicelulolíticas, mientras que las enzimas lignolíticas comprenden alrededor del 9 % (^{Gauna et al., 2020}).

Figura 2 Índice de degradación enzimática (ID) de las cepas Pycnoporus sangineus. Las medias con diferentes letras minúsculas dentro de la misma clasificación representan diferencia estadísticamente significativa (Tukey, P < 0.05).
Figure 2. Pycnoporus sangineus strains enzyme degradation index (ID). The means with different lowercase letters within the same classification represent a statistically significant difference (Tukey, P <0.05). 

Independientemente de los bajos niveles de celulasas y xilanasas es necesario un estudio de las condiciones óptimas de producción, ya que otras investigaciones han demostrado que estás actividades responden positivamente a la presencia de sustratos ricos en lignocelulosa (^{Rohr et al., 2013}), sugiriendo bajos costos de producción enzimática.

Con respecto al potencial amilolítico, las cepas presentaron índices de degradación entre 0.57 y 0.69, menores a los reportados para Aspergillus, Penicillium y Trichoderma por ^{Khokhar et al. (2011)}. Sin embargo, cabe mencionar que las enzimas producidas por cepas Pycnoporus sanguineus han mostrado termoestabilidad (^{Gutiérrez-Soto et al., 2015}; ^{Orlikowska et al., 2018}), lo que las hace atractivas para su aplicación a nivel industrial.

Consumo de azúcares reductores

Una vez identificadas las actividades de amilasas, celulasas y xilanasas en medio sólido, se determinó el comportamiento del consumo de azúcares en medio líquido, asociado a la producción de amilasas y hemicelulasas.

En la Tabla 3 es mostrado el análisis de varianza, donde se observa diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05) entre el comportamiento de las cepas y los días de estudios, con interacción entre estos. En la Figura 3 se presenta el consumo de los azúcares de las cepas, donde en los primeros ocho días se observó un alto consumo (aproximadamente el 55 %). Entre los días 10 y 18 la concentración disminuye cerca del 80 %, manteniendo un comportamiento de lento consumo, sugiriendo que los productos del metabolismo secundario aparecerán después del día 14 y que coincide con el incremento de la actividad de lacasa (Figura 1). Además, las fluctuaciones en la concentración de azúcares observadas los días 10 y 20 pueden estar asociadas a la presencia de enzimas que son inducibles (^{Álvarez et al., 2016}). Cabe mencionar que el comportamiento observado entre los días 10 y 18 sugiere el término del metabolismo primario y el comienzo del metabolismo secundario.

Figura 3 Consumo de azúcares por cepas Pycnoporus sangineus.
Figure 3. Reducing sugar consumption by Pycnoporus sangineus strains. 

Por otro lado, cabe mencionar que los basidiomicetos de la pudrición blanca se caracterizan por su potencial lignolítico (^{Riegas-Villalobos et al., 2020}), además de producir amilasas, xilanasas y celulasas como parte de su metabolismo primario en presencia de almidón y componentes de pared celular (^{Kobakhidze et al., 2016}; Naidu et al., 2016). Por lo que, al agotarse los azúcares simples presentes en el medio, serán expresadas las enzimas implicadas en la degradación de estos biopolímeros (^{Valadares et al., 2019}; ^{Okal et al., 2020}). Esto puede observase en la cinética del consumo de azúcares en el medio Tx2 (BF), un medio complejo compuesto por trigo integral, salvado de trigo y harina de trigo, que lo hacen rico en almidón y hemicelulosa (^{Gómez et al., 2020}). Además, el cereal esta adicionado con otros carbohidratos como sacarosa, extracto de malta de cebada y jarabe de glucosa que contribuyen al contenido de carbono.

Obtención de concentrados enzimáticos

En la Tabla 2 son mostrados los títulos de actividad de amilasas, celulasas, xilanasas y lacasa presentes en los concentrados obtenidos de los cultivos al día 18. La principal actividad producida por todas las cepas fue la de lacasa. El cóctel obtenido a partir de la cepa CH116 tuvo los mayores títulos de lacasa (4500 U∙l^-1) y amilasa (485 U∙l^-1), mientras que LE90 mostró la mayor concentración de xilanasas (785 U∙l^-1). El concentrado LE133 fue el de mayor actividad de celulasa.

Por otra parte, los concentrados enzimáticos mostraron un patrón común de producción de enzimas, siendo la lacasa la más abundante, seguida de las xilanasas, amilasas y finalmente las celulasas. Este comportamiento concuerda con lo reportado para este género (^{Gauna et al., 2020}). Por lo que, los bajos niveles observados podrían incrementarse mediante combinaciones de fuentes de carbono y sustratos ricos en lignocelulosa (^{Rohr et al., 2013}; ^{Kumla et al., 2020}). Cabe mencionar que, esta combinación de lacasa-xilanasa estaría relacionada con la estrategia de descomposición de la lignocelulosa de estas cepas en su sustrato natural (^{Veloz Villavicencio et al., 2020}). Esta combinación es de gran interés en el mejoramiento de las propiedades funcionales de las masas y la calidad final de sus productos (^{Niño-Medina et al., 2017}). Con respecto a la combinación de α-amilasa, xilanasa y celulasa se ha demostrado su efecto sinérgico sobre las propiedades reológicas de la masa al reducir la absorción del agua y, por ende, en la extensibilidad, ablandamiento y el índice de tolerancia de mezclado de éstas (^{Liu et al., 2017}). Sin embargo, estas enzimas aplicadas fueron obtenidas de diferentes casas comerciales. Por lo que, la obtención de concentrados enzimáticos a partir de un mismo organismo, creciendo en un medio de producción de bajo costo (como los residuos agroindustriales), de fácil recuperación y con las ventajas de termoestabilidad y rangos amplios de pH, son algunos de los atributos que podrían hacer de estas cepas de Pycnoporus sanguineus excelentes candidatos para su aplicación a nivel industrial (^{Okal et al., 2020}). Los aislados de este género son considerados organismos robustos, capaces de tolerar condiciones extremas de pH y temperatura. La termoestabilidad reportada en los sistemas lignocelulolíticos de cepas P. sanguineus demuestran su potencial aplicación en los procesos biotecnológicos (^{Gutiérrez-Soto et al., 2015}; ^{Orlikowska et al., 2018}; ^{Niderhaus et al., 2018}). Por tal razón, serán requeridos futuros estudios para la optimización de la producción, así como de la caracterización de las propiedades operativas y funcionales de las enzimas producidas por estos aislados.