El estudio se realizó en dos fases:

Fase 1: Abundancia estacional de V. cholerae y V. para-haemolyticus en el ostión cosechado del SLM

Las muestras de ostión (C. virginica) se recolectaron en bancos ostrícolas en producción del Sistema Lagunar Mandinga (SLM) (19º 00-06’ N, 96º 06’ W), localizado a 30 km del Puerto de Veracruz (Figura 1a), en el ciclo anual de enero a diciembre de 2018 durante las cuatro estaciones del año: invierno (enero-marzo), primavera (abril-junio), verano (julio-septiembre) y otoño (octubre-diciembre) debido a la disponibilidad, accesibilidad y preferencias de consumo. Con base al muestreo no probabilístico por cuotas, se recolectaron mensualmente 3 muestras cada una de 40 ostiones de tamaño medio legal (7-8 cm de largo) según lo establecido en la Norma Mexicana NMX-FF-001-SCFI-2011 (^{NMX-FF-001-SCFI, 2011}) y se transportaron inmediatamente en hieleras a 4 ºC al laboratorio de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana de la Secretaría de Salud NOM-242-SSA1-2009 (^{NOM-242-SSA1, 2009}). Los ostiones muertos se descartaron y los restantes se lavaron y enjuagaron con agua corriente fría para eliminar lodos, algas, balanos o cualquier otra incrustación y se analizaron en un lapso de 2 h después de su recolección.

Figura 1 Localización del área de estudio. A. Zona metropolitana Veracruz-Boca del Río, Mandinga y el Sistema Lagunar Mandinga, Veracruz, México. B. Establecimientos minoristas especializados en servir ostiones: restaurantes, coctelerías y puestos ambulantes en los que se consume cocteles de ostión crudo colectado del SLM [Mapa satelital]. (^{INEGI, 2022}). 

Figure 1. Location of the study area. A. Metropolitan area Veracruz-Boca del Río and Mandinga and Mandinga Lagoon System, Veracruz, México. B. Retail establishments specializing in serving oysters: restaurants, oyster bars, and street vendors where raw oyster cocktails collected from the MLS are consumed [Satellite map]. (^{INEGI, 2022}). 

Cuantificación de V. cholerae y V. parahaemolyticus

En las dos fases del estudio, las densidades de V. chole-rae no-O1/no- O139 y de V. parahaemolyticus no patogénicas (ompW y tlh+, respectivamente) y patogénicas (ctxA, chxA y tdh+, trh+, tdh+/trh+, orf8+, respectivamente) se cuantificaron según la metodología NMP-PCR reportada previamente (^{López-Hernández et al., 2015a},^b). El conteo del número de colonias se realizó a través del método de NMP con la serie de pruebas de tres tubos (95 % de límites de confianza). Los resultados se expresaron como NMP/g (^{USDA, 2008}).

Estimación del riesgo

Para la ERM se determinaron inicialmente las preferencias del consumo de ostión en comensales de restaurantes, coctelerías y puestos ambulantes del área metropolitana Veracruz-Boca del Río y Mandinga, Veracruz mediante un muestreo aleatorio simple. El tamaño de la muestra se calculó mediante el método de la FAO a nivel de confiabilidad de 95 %, una prevalencia estimada de la zoonosis en la zona del 50 % y m= margen de error de 5 % (^{FAO, 1990}). La ERM promedio por consumo de ostión crudo contaminado con V. parahaemolyticus y aplicable a V. cholerae se estimó con el modelo de la FDA v.2005 (^{FDA, 2005}) que expresa el riesgo cuantitativo como número de casos esperados/100,000 porciones (cocteles), considerando el consumo de 12 ostiones por persona como tamaño de porción. La predicción del riesgo promedio por porción (IC95 %) se calculó en base a la densidad media normalizada (log₁₀ NMP/g) de V. cholerae ompW+ y V. parahaemolyticus tlh+, la temperatura media del aire o de refrigeración y el tiempo sin refrigeración del ostión (10 y 24 h), así como el porcentaje patogénico de V. cholerae chxA+ y V. parahaemolyticus tdh+, trh+, tdh+/trh+ y orf8+. Para la estimación del riesgo se contempló el consumo de 12 ostiones por persona como tamaño de porción y el riesgo cuantitativo se expresó como el número de casos esperados/100,000 porciones o cocteles (^{FDA, 2005}). Los resultados del riesgo cuantitativo se clasificaron mediante un sistema de puntuación logarítmica semicuantitativa (^{FAO/WHO, 2009}); de acuerdo con este sistema establecido para la clasificación de la probabilidad, un riesgo alto (puntuación = 2) corresponde a la probabilidad de 10^-1 a 10^-2, el riesgo medio (puntuación = 3) de 10^-2 a 10^-3, un riesgo bajo (puntuación= 4) de 10^-3 a 10^-4, y cuando es riesgo imposible (puntuación= NA) es considerado como 0.

De acuerdo con las prácticas locales de los ostricultores, al término de la extracción los ostiones son clasificados en las instalaciones de las cooperativas y almacenados a temperatura ambiente en costales para su posterior distribución desde las cooperativas hacia los diferentes sitios de venta como centrales de abasto, mercados, restaurantes y coctelerías. Los puestos ambulantes adquieren directamente el producto en las cooperativas, en centrales de abasto o en los mercados de pescadería en el área. Por ello, se estimó un tiempo de 10 h sin refrigeración para la cadena de distribución desde la cosecha y transportación hasta los restaurantes y coctelerías y de 24 h para puestos ambulantes, considerando la distancia desde el SLM hacia los puntos de venta seleccionados. Se consideró una temperatura de refrigeración de 7 °C para el ostión en restaurantes y coctelerías, señalada en la Norma Oficial Mexicana NOM-242-SSA1-2009 (^{NOM-242-SSA1, 2009}) y una temperatura ambiente promedio de 25.3 °C para los consumidos en puestos ambulantes durante el período de estudio, mientras que para estimar el riesgo por consumir ostiones crudos cosechados del SLM durante el invierno, primavera, verano y otoño, se consideraron las temperaturas ambientales medias de 21.03, 25.56, 25.50 y 21.73 ºC, respectivamente (^{CONAGUA, 2019}).

Análisis estadístico

Las diferencias significativas entre las densidades medias patogénicas y no patogénicas normalizadas a log₁₀ NMP/g de V. cholerae y V. parahaemolyticus en ostión fresco de la laguna y los cocteles de ostión colectados de los sitios de venta se evaluaron mediante análisis de varianza de una vía (p < 0.05), utilizando el programa estadístico Minitab v.19 (Minitab, Inc., State College PA). Las densidades de V. cholerae y V. parahaemolyticus < 0.30 NMP/g (no detectable) fueron consideradas como 0.15 NMP/g para fines estadísticos. La frecuencia (%) de las respuestas de la encuesta aplicada se calculó con intervalo de confianza del 95 % con el programa en línea VassarStats.

Densidades de V. cholerae y V. parahaemolyticus en ostión del SLM y en cocteles de ostión de venta al público

Los ostiones colectados de los bancos del SLM presentaron densidades medias de V. cholerae no-O1/no- O139 no patogénicas (ompW+) y patogénicas (chxA+) altas (p > 0.5) durante el verano y el otoño, mientras que las densidades elevadas (p > 0.5) de V. parahaemolyticus no patogénicas (tlh+) y patogénicas (tdh+, trh+, tdh+/trh+) ocurrieron en primavera, verano y otoño y las de orf8+ en invierno. En la venta al público, las densidades medias no patogénicas (ompw+) y patogénicas (chxA+) de V. cholerae no-O1/no-O139 en los cocteles de ostión crudo fueron más altas (p > 0.5) en los puestos ambulantes (0.69 NMP/g) y en los restaurantes (0.60 NMP/g), mientras que las de V. parahaemolyticus tlh+ fueron altas (22.10 NMP/g) (p > 0.5) en restaurantes y las de V. pa-rahaemolyticus tdh+ fueron significativamente (p < 0.5) más altas (0.74 NMP/g) en coctelerías (Tabla 1).

Las densidades observadas en el ostión fresco procedente del SLM fueron más bajas que las encontradas en nuestros estudios anteriores en ostión recién cosechado del mismo sistema lagunar, con densidades de V. cholerae ompW+ 1.45 log₁₀ NMP/g y de V. cholerae no-O1/no-O139 chxA+ 1.18 log₁₀ NMP/g durante el verano y otoño, respectivamente, el cual representó el primer reporte en ostión del Golfo de México (^{López-Hernández et al., 2015a}), lo que indica que ya son reemergentes de la zona. Similarmente, las densidades de V. parahaemolyticus tlh+y tdh+ del presente estudio también fueron inferiores a las observadas en primavera (3.04 y 2.20 log₁₀ NMP/g, respectivamente) en el ostión fresco cosechado del SLM (^{López-Hernández et al., 2015b}). En diversas regiones costeras del mundo se ha reportado la influencia de la variación estacional en la densidad total y patogénica de Vibrio cholerae y V. parahaemolyticus relacionada con factores ambientales (temperatura, salinidad, clorofila a) (^{Martinez-Urtaza, 2016}; ^{Jutla et al., 2011}), lo cual podría explicar la estacionalidad de las infecciones, siendo más abundantes en los meses más cálidos.

En el presente estudio se observó que V. cholerae no -O1/no-O139 ompW+ registró altas densidades (p > 0.05) en verano y otoño y V. parahaemolyticus tlh+ en primavera y verano. La NOM-242-SSA1-2009 señala que V. cholerae O1 y no-O1 deben estar ausentes en 50 g de parte comestible de moluscos bivalvos, pero permite 104 NMP/g de V. parahaemolyticus sin especificar toxinas. Cabe destacar que la presencia de cepas patogénicas detectadas en los ostiones en el presente estudio representa un riesgo a la salud para las personas sanas, pero principalmente para las inmunocomprometidas o con padecimientos crónico-degenerativos (diabetes, cirrosis, hipertensión) por el riesgo a contraer gastroenteritis grave o desarrollar septicemia. La edad, los problemas hepáticos y la inmunocompetencia, son los tres principales factores de riesgo de V. parahaemolyticus (^{Jiang et al., 2018}; ^{Suresh et al., 2019}). La toxina termoestable directa (TDH), codificada por el gen tdh de V. parahaemolyticus es considerada, con la hemolisina TDH-relacionada (TRH), los factores de virulencia más importantes de este patógeno que presentan varias actividades biológicas, como hemolítica, enterotoxicidad, citotoxicidad y cardiotoxicidad (^{Jiang et al., 2018}). La abundancia del gen chxA encontrado en este estudio (100 % en invierno) es significativo, ya que codifica a la toxina Cholix A (ChxA), un factor de virulencia identificado principalmente en cepas no pandémicas, necesario para la virulencia del patógeno en la colonización, señalización bacteria-animal y supervivencia en el medio acuático (^{Jørgense et al., 2008}). Esta potente citotoxina con actividad específica ADP-ribosiltransferasa produce muerte celular y apoptosis en las células HeLa. Se ha reportado que V. cholerae no-O1/no-O139 chxA+ desarrolló septicemia, coagulación intravascular y fallo orgánico múltiple en un paciente infectado (^{Awasthi et al., 2013}).

En este contexto, es importante señalar que la va-riación en el número de cepas patogénicas de V. cholerae no-O1/no-O139 y V. parahaemolyticus en el ostión debería determinarse antes de la cosecha debido a que representan un riesgo para la salud humana, especialmente porque no están contempladas en la regulación actual, por lo que la significancia epidemiológica de estos patógenos pudiera estar subestimada. De ahí la importancia de evaluar la relación Vibrio spp. -ambiente-ostión-salud para asegurar la inocuidad del alimento y reducir el riesgo a la salud por consumo del ostión.

Estimación del riesgo

Estimación del riesgo por consumo de ostión crudo del SLM

El riesgo promedio por consumir ostión crudo del SLM sin refrigerar 10 h y contaminado con V. cholerae no-O1/ no -O139 chxA+ se estimó de 99 casos/100,000 porciones en verano, 1.5-6.6 veces mayor al calculado para las otras estaciones. Sin embargo, el riesgo promedio es clasificado como bajo. En contraste, el riesgo en ostiones con 24 h sin refrigeración durante el verano fue 42.4 veces mayor al calculado con 10 h sin refrigeración. No obstante, el riesgo por consumir ostiones con 24 h sin refrigeración en las estaciones de invierno, primavera y otoño se consideraría medio, mientras que en verano sería alto, ya que se esperarían 4.2 casos/100 porciones o cocteles de ostión consumidos. Respecto a V. parahaemolyticus (Tabla 3), el riesgo de enfermar por el consumo de ostión crudo sin refrigerar 10 h, fue alto en primavera para tdh+ y para tdh+/trh+ (4 casos/100 porciones), comparados al riesgo medio para orf8+ (1.1 × 10^-3 casos) en invierno. Similarmente, el riesgo promedio por consumir ostiones contaminados con V. parahaemolyticus tdh+, trh+ y tdh+/trh+ con 24 h sin refrigeración fue mayor en primavera, representando un riesgo alto con un estimado de 4 a 9 casos/100 porciones y para la cepa pandémica (orf8+) en invierno con 1 caso/100 porciones, riesgo 10 veces mayor al calculado con 10 h sin refrigeración en ambos casos (Tabla 2).

El riesgo promedio estimado por porción de 12 ostiones asociado con el consumo de ostión fresco del SLM con 10 horas sin refrigeración y contaminado con V. parahaemolyticus tdh+ (2.20 × 10^-2 casos) fue mayor al reportado en ostiones recién cosechados procedentes de la Costa del Golfo (Louisiana) (2.10 x 10^-6) en invierno por la ^{FDA (2005)}, al de Brasil (3.6 × 10^-3) (^{Costa et al., 2014}) y del Golfo de México en primavera (1.45 × 10^-4) (^{WHO/FAO, 2011}). Asimismo, fue mayor al reciente estudio de ^{Cooksey (2021)} que estimó el riesgo a enfermar por V. parahaemolyticus por el consumo de ostiones colectados por recreación en California, E.U.A. mediante un modelo de estimación del riesgo cuantitativo por la vía pre- y post- “del mar a la mesa”, obteniendo un riesgo medio a enfermar por ración de ostiones recién cosechados contaminados con V. parahaemolyticus de 5.61 x 10^-5. El análisis resaltó el impacto en el riesgo de la concentración inicial de V. parahaemolyticus en los ostiones, el número de ostiones consumidos y la concentración de V. parahaemolyticus patogénicos, comparable a lo encontrado en el presente estudio. El modelo de la FDA establece como riesgo aceptable estándar un caso/100,000 porciones (1 × 10^-5). Se observa en el Golfo de México un riesgo promedio bajo, pero alto para las costas de Veracruz, México, probablemente debido a la diferencia del porcentaje patogénico y las condiciones ambientales locales.

^{Ndraha y Hsiao (2019)} estimaron el riesgo por V. parahaemolyticus asociado con el consumo de ostión crudo en Taiwán y encontraron que el riesgo en verano era 0.5, 1.0 y 3.1 veces mayor que en otoño, primavera e invierno, respectivamente. Lo anterior difiere a lo observado en el presente estudio, ya que el riesgo por consumo de ostión fresco de la laguna durante la primavera fue 278.48 veces mayor que en verano (Tabla 3). Estos resultados son comparables a los encontrados por ^{Jong-Kyung et al. (2018)} quienes estimaron un riesgo promedio de enfermar por consumo de una ración de ostión crudo recién extraído y contaminado con V. parahaemolyticus de 5.71 × 10^-5 durante los meses de primavera. Los principales factores que influyeron en el riesgo estimado fueron la concentración inicial de V. parahaemolyticus (log NPM/g), la cantidad de ostiones consumidos, prevalencia de las cepas patogénicas, la temperatura y el tiempo de exposición.

Estimación del riesgo por consumo de cocteles de ostión crudo de venta al público

El riesgo promedio asociado con el consumo de cocteles de ostión crudo con 10 h sin refrigeración de venta en restaurantes y coctelerías contaminado con V. cholerae no-O1/no-O139 chxA+ fue menor a 1 caso/100,000 porciones; sin embargo, el riesgo por consumir cocteles en puestos ambulantes sería alto (2.5 casos/100 cocteles). De igual forma, el consumo de 24 ostiones por porción representaría un riesgo alto (8.20 × 10^-2). Cabe mencionar que si bien el 100 % de las muestras presentó V. cholerae no-O1/no -O139 chxA+ en los tres sitios de venta (100 % de porcentaje patogénico), el riesgo promedio sería mayor para las personas que consumen en puestos ambulantes debido a la temperatura ambiente promedio considerada en el modelo. V. parahaemolyticus tdh+ se detectó en los cocteles de venta en restaurantes y coctelerías con un porcentaje patogénico de 0.68 y 100 %, respectivamente, estimándose un riesgo promedio de 0.21 y 1.10 × 10^-5 casos con 12 ostiones por porción, respectivamente y de 0.43 y 2.10 × 10^-5, respectivamente, con una porción de 24 ostiones, representando ambos un riesgo bajo. V. parahaemolyticus no se detectó en ostiones de puestos ambulantes, considerado como riesgo imposible (Tabla 4).

El riesgo estimado en el presente estudio fue mayor al reportado por ^{Ding et al. (2022)}, cuyos resultados mostraron que el riesgo a enfermar por persona por año causado por V. parahaemolyticus debido al consumo de mariscos crudos comprados y cocidos en casa en una ciudad costera del este de China era de 3.49 × 10^-5. Cabe señalar que observaron diferencias estacionales ya que el máximo riesgo ocurrió en verano (4.81 × 10^-6) y el mínimo en invierno (2.27 × 10^-7), mientras que en el presente estudio el máximo riesgo se presentó en primavera (2.20 × 10-²) y en invierno (2.80 × 10^-3). ^{Costa et al. (2014)} , reportaron que la densidad de V. parahaemolyticus en ostiones crudos es mayor en el punto de consumo que en el de cosecha, lo cual difiere de lo reportado en el presente estudio, ya que las densidades de V. cholerae y V. parahaemolyticus en los ostiones de venta al público fueron menores a las observadas en los ostiones frescos de la laguna, excepto para V. parahaemolyticus tlh+ (22.10 NMP/g), estos valores pudieran deberse al efecto de la temperatura de refrigeración en los restaurantes y coctelerías como reporta ^{Gooch et al. (2002)} . Sin embargo, en verano, el riesgo promedio por porción por consumir ostión fresco del SLM contaminado con V. cholerae no-O1/no-O139 chxA+ (10 h sin refrigeración) sería bajo (9.9 × 10^-4), pero alto en puestos ambulantes (2.5 x 10^-2), posiblemente debido al porcentaje patogénico (5.28 y 100 %, respectivamente) y a la temperatura ambiente promedio de distribución y conservación del ostión durante el estudio. En contraste, en el caso de V. parahaemolyticus tdh+, se presentaría un riesgo alto en primavera (2.2 × 10^-2) por consumir ostiones crudos frescos del SLM, mientras que el riesgo sería bajo por consumir ostiones crudos en las coctelerías (1.1×10^-5) a pesar de los porcentajes patogénicos de 14.74 y 100 %, respectivamente. No se encontró en la literatura consultada evaluaciones de riesgo del consumo de cocteles de ostión en sitios de venta para V. cholerae no-O1/no-O139 chxA+ y V. parahaemolyticus tdh+.

Desde el punto de vista de la inocuidad alimentaria, la presencia de cepas de V. cholerae no-O1/no-O139 y V. pa-rahaemolyticus con genes patogénicos plantea importantes problemas de salud. Nuestros resultados son preocupantes debido a que el porcentaje patogénico en otras áreas ambientales raramente excede el 3 % (^{Rehnstam-Holm et al., 2014}). Es importante señalar que la predicción del riesgo a la salud asociado al consumo de ostión crudo contaminado con cepas patogénicas es de naturaleza dinámica por estar influenciado por diversas variables, entre ellas el origen de la muestra, las densidades, el porcentaje de cepas patogénicas, el consumo y el consumidor (^{Dickinson et al., 2013}; ^{Love et al., 2020}). Asimismo, puede diferir con el método de producción y las prácticas de manejo de los productores. De ahí la importancia de estimar el riesgo a la salud para identificar las posibles intervenciones y reducir o eliminar el riesgo (^{Pardío et al., 2016}). En este sentido, anualmente se consumen aproximadamente 22,162 t de ostión crudo en el estado de Veracruz, con un consumo per cápita de 0.43 kg (^{CONAPESCA, 2018}). El SLM es una de las lagunas estuarinas costeras económicamente importante por la mayor producción de ostión, consumo y recreación. El problema más grave que presenta es la cantidad de descargas de drenaje provenientes de los asentamientos humanos a su alrededor, el incremento en la densidad de la población y la creciente actividad turística (^{Lara-Dominguez et al., 2009}). Los ostiones del SLM se distribuyen a hoteles, restaurantes, coctelerías y mercados en la zona Metropolitana Veracruz - Boca del Río y enviados a Cancún, Monterrey y la Ciudad de México al Mercado de la Viga. De acuerdo a la encuesta, el 95.37 % de los consumidores acostumbran a consumir un coctel de ostiones 1 a 2 veces al mes (88.78 %), principalmente en primavera y verano, que correspondieron a los meses donde se estimó un mayor riesgo. Si el consumir ≥ 2 cocteles al mes es considerado un riesgo (^{Jutla et al., 2011}), el riesgo a enfermar de la población es alto.

Cabe mencionar que la mayor frecuencia de consumo se encontró en hombres (65.1 %), cercano al 73.6 % encontrado en Trinidad y Tobago (^{Laloo et al., 2000}). Desde la perspectiva de salud pública, el consumo de estos ostiones debería ser considerado como un peligro potencial a la salud. En México y varios países de Latinoamérica, la diarrea aguda de etiología infecciosa, fundamentalmente de origen por exposición a alimentos y agua contaminados, es un problema de salud pública debido a las altas tasas reportadas anualmente de morbilidad y mortalidad. En México, Vibrio spp. (1 %) se ha aislado en materia fecal de pacientes ambulatorios (614 muestras), niños, adolescentes y adultos, con diarrea aguda en Veracruz, Villahermosa, Mérida y Tuxtla Gutiérrez. Se ha asociado con factores como condiciones climáticas y socioeconómicas, así como el entorno sanitario, especialmente para la población vulnerable (^{Novoa-Farias et al., 2017}).

No se encontraron reportes de evaluaciones del riesgo en sitios de venta ya que la mayoría de las investigaciones reportadas tienen un enfoque sanitario y epidemiológico, lo que destaca la importancia y aporte del presente estudio que sería el primer reporte en México. Los hallazgos de esta investigación representan un punto de referencia para aplicar las medidas de control apropiadas y/o reglamentarias tales como la vigilancia de la cadena fría y la normalización de los procesos de desinfección avanzada del ostión después de su extracción. Si las medidas para mitigar estos patógenos no conducen a la reducción del riesgo y el escenario del cambio climático empeora, las predicciones del riesgo a enfermar podrían incrementarse. En consecuencia, es necesario que el consumidor sea concientizado de que una enfermedad de origen alimentario no debe ser considerada como una enfermedad menor debido a la presencia de patógenos en el alimento.