Materias primas

Los granos de guandul se adquirieron en un mercado de la ciudad de Tapachula, Chiapas, México y la proteína se extrajo mediante la metodología reportada por ^{Robles-Flores et al. (2018)}. La goma de semillas de tamarindo fue obtenida a partir de semilla de Tamarindus indica adquiridas en el mercado local (Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, México), y se obtuvo según la metodología reportada por ^{Robles-Flores et al. (2018)}.

Obtención del extracto acuoso

Las hojas de guanábana fueron colectadas en la ciudad de Tuxtla Gutiérrez, Chiapas. Las hojas fueron secadas a la sombra a 40 °C hasta obtener una humedad de 10 %. Posteriormente, las hojas secas fueron pulverizadas hasta un tamaño de partícula de malla 60 (0.250 mm) y guardadas en bolsas herméticas al vacío hasta su utilización. El extracto acuoso se preparó usando la metodología descrita por ^{Chang et al. (2002)} .

Preparación de las AgNPs

Las AgNPs fueron preparadas siguiendo la metodología descrita por ^{Ruiz-Romero et al. (2018)} . El coloide (sobrenadante) se almacenó a 4 °C en oscuridad, hasta su posterior uso.

Contenido de fenoles totales, flavonoides y actividad antioxidante

Para la cuantificación de fenoles totales y flavonoides, el extracto acuoso se diluyó con agua tridestilada en proporción 1:5 v:v (extracto:agua). Para la determinación de fenoles totales en el extracto acuoso y en las AgNPs, se usó la metodología reportada por ^{Singleton et al. (1999)} . Para la cuantificación de flavonoides en el extracto acuoso y en las AgNPs se usó el método colorimétrico de cloruro de aluminio (^{Chang et al., 2002}). Para la determinación de la capacidad antirradical del extracto acuoso se usó la metodología reportada por ^{Zhao y Shah (2014)} .

Espectrofotometría de luz UV-visible

Las AgNPs fueron analizadas en un espectro (UV- visible) con un barrido de 300 a 700 nm en un espectrofotómetro Beckman coulter modelo DU 730 (Indianapolis, EU), a intervalos de 5 nm y usando AgNO₃ como blanco.

Potencial zeta y dispersión dinámica de la luz (DLS)

La distribución de tamaño de las AgNPs y el potencial zeta se analizaron utilizando un Nanotrac Wave Instrument (Montgomeryville, PA, EU). Las mediciones se realizaron mediante la técnica de dispersión dinámica de la luz en un rango de 0.1 - 1000 mm a 25 ºC, con una longitud de onda del láser de 780 nm y un ángulo de dispersión de 90 °. Los datos de DLS se analizaron mediante el software operativo Microtrac FLEX (Montgomeryville, PA, EU).

Microscopia electrónica de barrido (MEB)

Para el registro de las microfotografías se utilizó un microscopio electrónico de barrido (MEB), modelo JEOL-6010LA (Massachusetts, EU), con un voltaje de 10 kV con una magnificación de 100.00 kx utilizando un detector de electrones secundarios (SEI). Después de tomar las imágenes con el MEB, se procedió a ejecutar un barrido de haz de electrones y se registraron espectrografías y la distribución de los elementos químicos identificados con el detector de energía dispersa (EDS).

Formulación de las películas

Los recubrimientos fueron formulados según la metodología reportada por ^{Robles-Flores et al. (2018)} con modificaciones. Tres formulaciones fueron probadas como se presentan en la Tabla 1.

Caracterización de las películas

Antes de realizar las determinaciones, las películas fueron estabilizadas a 25 °C y una humedad relativa (HR) de 53 % durante 48 h. Esta HR fue proporcionado con una solución saturada de Mg(NO₃)₂.

Permeabilidad al vapor de agua

La permeabilidad al vapor de agua (PVA) de la película se determinó de acuerdo a la metodología descrita por ASTM E96M-16 (2016).

Opacidad

La opacidad se determinó colocando una lámina de la película de 4 x 1 cm2 dentro de una celda espectrofotométrica, asegurando que la lámina cubriera completamente la cara de la celda, y se realizó un barrido a lo largo del rango visible (400 - 800 nm) empleando un espectrofotómetro Beckman coulter modelo DU 730 (California, EU). La opacidad se reportó como el área bajo la curva como unidades de absorbancia en función del espesor de la película (mm^-1).

Color

El color de las películas fue medido utilizando un colorímetro portátil Konica minolta modelo CM-2500d (Tokio, Japón) por triplicado, según la escala CIE- Lab.

Textura

La fuerza de tensión, elongación y módulo de Young de las películas se determinaron empleando un texturómetro Stable Micro Systems modelo TA.XT. plus (Godalming, UK) con una apertura de 30 mm, velocidad de 30 mm/min y deformación del 80 %.

Microscopia electrónica de barrido (MEB) de las películas

Para el registro de las microfotografías de las películas se utilizó un microscopio electrónico de barrido (SEM), modelo JEOL-6010LA (Massachusetts, EU), con un voltaje de 10 kV con una magnificación de 120x y 600x.

Formación de AgNPs

La formación de las AgNPs usando extracto de hoja de guanábana se demostró con un cambió en la coloración de la mezcla de amarillo claro a amarillo obscuro. Este cambio de coloración es indicativo de la reducción de los compuestos fenólicos del extracto y ha sido reportado por otros autores ( ^{Santhosh et al., 2015}; ^{Gavamukulya et al., 2020}). Según ^{John et al. (2017)} el principal mecanismo en la síntesis de las nanopartículas es la óxido-reducción. Ellos muestran un posible mecanismo de acción para la formación de las AgNPs en los cuales los antioxidantes polifenólicos actúan como los agentes reductores en la síntesis verde de las nanopartículas.

El cambio de color del extracto después de la síntesis de las AgNPs es debido al fenómeno de resonancia del plasmón superficial (^{Cardeño y Londoño, 2014}). ^{Martinez et al. (2015)} describen a la resonancia plasmónica como un fenómeno en el que los electrones en la superficie de una nanopartícula metálica oscilan al interactuar con una onda electromagnética, induciendo un momento dipolar sobre la partícula en un intervalo de tiempo determinado. Cuando el componente eléctrico de la onda electromagnética que incide sobre la nanopartícula oscila a la misma frecuencia que los electrones de esta, ocurre el fenómeno de resonancia de plasmón de superficie. Lo anterior fue identificado en las muestras de solución de plata y extracto de guanábana mediante un barrido espectrofotométrico de 300 a 700 nm, en donde fue posible registrar el efecto plasmón de la plata en la región de 470 nm (Figura 1a). En este sentido, el posible mecanismo de reducción del ión Ag+ por los compuestos fenólicos en el extracto acuoso de guanábana, implica la ionización de polifenoles y la transferencia de un electrón al ion Ag+. Entonces, el ión Ag+ podría ser reducido a Ag0 (AgNPs) por acción de los compuestos bioactivos (fenoles y flavonoides). Los polifenoles entonces podrían actuar como antioxidantes, preservando a las nanopartículas (^{Erdogan et al., 2019}). En este sentido, nuestros resultados son consistentes con los reportados por León-Jimenez et al. (2019) quienes encontraron que la formación de nanopartículas podría deberse a grupos carboxilo de aminoácidos, proteínas y compuestos fenólicos que tienen la capacidad de reducir los iones metálicos y actuar como agentes de estabilizantes del complejo que se forma (^{Valdez-Salas et al., 2020}).

Microscopía Electrónica de Barrido de las AgNPs y análisis de EDS

En la Figura 1b, se muestra la microfotografía de las nanopartículas a magnificaciones de 100 kx. En esta Figura se observan nanopartículas irregulares y aglomeradas. Esto podría ser debido a que en la síntesis verde no se puede controlar el tamaño, forma, ni distribución de las nanopartículas como lo reportado por ^{Anandan et al. (2019)} . La espectroscopía de energía dispersa (Figura 1c) proporcionó información en cuanto a la composición elemental de la muestra analizada, con lo cual se determinó una composición media másica de las AgNPs de 9.76 % de carbono, 2.84 % de oxígeno, 46.97 de silicio, 1.68 % de cloro y 38.72 % de plata, confirmando así la síntesis. El pico de señal a 3 keV corresponde a las AgNPs debido a la resonancia de plasmón superficial (^{Tamilarasi y Meena, 2020}). La presencia del Si es probable que provenga de contenido mineral del tejido vegetal de acuerdo a las condiciones de cultivo o crecimiento de la planta. Similares resultados fueron reportados previamente por ^{Femi-Adepoju et al. (2019)} y ^{Valdez-Salas et al. (2020)}, quienes observaron la presencia de Si y otros elementos que sirven como estabilizadores orgánicos de la nanopartículas y su presencia responde de las condiciones de cultivo de las plantas. Los resultados obtenidos mediante la técnica de dispersión dinámica de la luz (DLS) indican que las nanopartículas presentaron una polaridad negativa y presentaron una conductividad promedio de 1332 µS /cm, un tamaño promedio de las nanopartículas de 64.6 nm y un potencial zeta de 29.1 mV. El potencial zeta es un parámetro fundamental que nos indica la interacción de la partículas en suspensión en una solución coloidal, las fuerzas de repulsión entre ellas producen suspensiones estables, mientras que cuando no hay repulsión entre las partículas se produce la aglomeración y por lo tanto la sedimentación de aglomerados. Para que esto no suceda, el potencial zeta debe ser mayor a + 30 mV o menor a - 30 mV para tener estabilidad coloidal según ^{Emil y Gautam (2019)}. Los valores aquí reportados para nuestras AgNPs indican que hay repulsión entre las partículas en suspensión, sin embargo, se observa que empieza a ver aglomeración entre las nanopartículas.

Figura 1 a) Espectro UV - Visible de extracto de guanábana (círculos) y AgNPs (triángulos), b) Microfotografía de AgNPs y c) Análisis químico de la espectroscopia de energía dispersa (EDS) de AgNPs sintetizadas con extracto acuoso de Annona muricata. 

Figure 1. ) UV - Visible spectrum of soursop extract (circles) and AgNPs (triangles), b) AgNPs Microphotograph, and c) Chemical analysis of dispersed energy spectroscopy of AgNPs synthesized with Annona muricata aqueous extract. 

Contenido de fenoles totales, flavonoides y actividad antioxidante del extracto acuoso y nanopartículas

En la Tabla 2 se presenta la caracterización del extracto acuoso y AgNPs. En esta Tabla 2 se puede observar que no hay diferencia estadística significativa en el contenido de fenoles totales y flavonoides. Estos resultados son menores a los reportados por ^{Vergara Sotomayor et al. (2018)} quienes obtuvieron 523.34 µg EAG/mL en fenoles totales y 0.76 µg EQ/mL en flavonoides en extracto acuoso de hojas de guanábana. Pero similar a lo reportado por ^{Poma et al. (2011)} quienes reportaron una concentración de 3.167 µg EQ/mL en hojas de guanábana. En cuanto a la actividad antioxidante del extracto acuoso fue de 69.08 %. La presencia de antioxidantes producidos por las plantas pueden inhibir o retrasar el proceso de oxidación, actuando como captadores de radicales libres en los sitemas biológicos, dado a que se producen de forma natural, el riesgo de efectos secundarios es menor (^{Akhtar et al., 2022}). Es por ello que al tener una mayor actividad antioxidante en el extracto vegetal podría ser mayor la inibición o el retraso en el estrés oxidativo celular.

Permeabilidad al vapor de agua (PVA)

Los resultados mostraron que la PVA no fue afectada estadísticamente (p < 0.05) con la adición del extracto ni con las nanopartículas (Tabla 3). Estos valores de permeabilidad son probablemente debido a la naturaleza hidrofílica de los componentes de las formulaciones como el glicerol debido a sus grupos funcionales (-OH). Estos valores de PVA fueron más elevados con lo reportados por ^{Robles-Flores et al. (2018)} , quienes mostraron valores de 1.98 a 3.76 quienes usaron goma de C. cajan, esta diferencia puede deberse a que la goma usada en este trabajo fue de T. indica, la cual ha sido catalogada como un agente emulsionante aunado con el glicerol, pueden interaccionar con las moléculas de agua e hidratar la película para posteriormente difundir el agua a través de la matriz de la película (^{Yamatoya et al., 2020}; ^{Gahruie et al., 2022}), además, de la existencia de posibles grietas en la estructura de la película.

Apariencia, color y opacidad de las películas

La película TN con AgNPs presentó una coloración marrón oscuro mientras que las películas T y TE presentaron un color café claro. Este cambio de coloración se pudo deber probablemente a la interacción de compuestos fenólicos “libres” (aun en el coloide de las AgNPs) con los componentes de las películas (proteína y goma). En la Tabla 3 se muestran los resultados de la evaluación de color y opacidad de las películas. Los valores de luminosidad variaron de 39.46 a 60.44, mientras que los valores de “a” fueron de - 2.11 a 2.92 y los valores de “b” oscilaron entre los 24.49 a 29.78, para todas las películas. Con respecto a la luminosidad (L) y el parámetro “a” se observó que las películas fueron estadísticamente diferentes. La luminosidad de las películas disminuyó con la adición de extracto de guanábana y de AgNPs, provocando el incremento de la opacidad de las mismas con respecto a las películas sin extracto ni nanopartículas. Con respecto a la opacidad, los valores variaron de 4.15 para las películas sin extracto y sin nanopartículas hasta un valor de 6.54 mm-1 para las películas con nanopartículas. Esto puede deberse a que en la síntesis de las nanopartículas pudieron haber quedado iones Ag+ libres los cuales pudieron haber reducido o reaccionado con los componentes de la proteína, así como de la goma de tamarindo. ^{Ledezma et al. (2014)} mencionaron que los azúcares reductores y fenoles presentes en los extrac-tos pueden actuar como agentes reductores para la síntesis de nanopartículas.

Estructura y propiedades mecánicas

Los resultados de las propiedades mecánicas se pueden apreciar en la Tabla 3. Nuestros valores de fuerza de tensión (entre 1.477 y 2.981 MPa) fueron más bajos que los reportados por ^{Cano et al. (2016)} quienes reportaron valores de entre 18.3 y 30.7 MPa para películas elaboradas con poli-vinil-alcohol, almidón y AgNPs a diferentes concentraciones. Ellos atribuyen esta fuerza de tensión a la absorción de la plata a las cadenas poliméricas mediante interacciones de Van der Waals con los grupos -OH, así como a la carga parcial positiva en la superficie de las AgNPs.

La adición de nanopartículas incrementó la fuerza de tensión de las películas. Sin embargo, este efecto no siempre es el mismo. ^{Bahrami et al. (2019)} mencionaron que la incorporación de nanopartículas metálicas en las películas de bio-polímeros puede disminuir la fuerza de tensión de la película cuando los componentes de la misma no son compatibles. Lo anterior debido a que no se crea una fuerte interacción entre las nanopartículas y la matriz de los polímeros. Por lo tanto, se puede concluir que el aumento a la fuerza de tensión es por la interacción química entre el aislado de proteína y la goma de tamarindo, con el extracto vegetal y las AgNPs junto con el glicerol aumentando la estructura de la red en las películas formuladas. La deformación o elongación es un parámetro que muestra el porcentaje en el que un material se puede alargar, los resultados muestran que no hubo diferencia estadística significativa entre las películas (Tabla 3). Este resultado es interesante debido a que a pesar de que las películas son más resistentes, estas no perdieron elasticidad. Las propiedades mecánicas de las películas elaboradas están estrechamente relacionadas con la distribución y densidad de las interacciones intermoleculares e intramoleculares en las cadenas de polímeros en la matriz de la película (^{Orsuwan et al., 2016}). El módulo de Young (E) según ^{Pérez-González (2014)} lo definen como “el parámetro característico de cada material que indica la relación existente entre los incrementos de tensión aplicados y los incrementos de deformación longitudinal unitaria producidos, indicando la rigidez de un material: cuando más rígido es un material mayor es su módulo de Young”. Por lo tanto, los valores del módulo de Young de las películas TE y TN fueron estadísticamente diferentes con respecto a la película control T, como sucedió con la fuerza de tensión. Esto es probablemente debido a que estas dos películas contienen mayor número de grupos hidroxilos expuestos y disponibles para interactuar con el resto de los componentes de la formulación durante el reordenamiento a lo largo del secado, permitiendo una película más compacta, como lo reportado por ^{Robles-Flores et al. (2018)} . Lo compacto de las películas puede observarse en la Figura 2 donde se aprecian las microfotografías que muestran la estructura individual de las películas a 120x (Figuras 2a, 2c y 2e ) y 600x (Figuras 2 b, 2d y 2f ). En las microfotografías se pueden observar que las películas son lisas, homogéneas y compactas.

Figura 2 Microfotografía de la película T a x120 (a) y x600 (b); Microfotografía de la película TE a x120 (c) y x600 (d); Microfotografía de la película TN a x120 (e) y x600 (f). 

Figure 2. T- film Microphotograph at x120 (a) and x600 (b); TE- film microphotograph at x120 (c) and x600 (d); TN- film microphotograph at x120 (e) and x600 (f).