Material vegetal

Las hojas de las plantas de orégano (Lippia palmeri Watson), se colectaron en la época de floración en el mes de septiembre, en el campo experimental del Departamento de Agricultura y Ganadería de la Universidad de Sonora, localizado en el km. 21 de la carretera Hermosillo a Bahía de Kino, Sonora, México (29.01595217894536, -111.13341050793869).

Extracción del aceite esencial y extracto acuoso

Se establecieron dos tipos de bioensayos, uno para aceite esencial y otro para el extracto acuoso. Para ambos bioensayos se dejaron secando las hojas de cada una de las plantas de orégano colectadas a temperatura ambiente y a la sombra, una vez que el material vegetal fue secado las hojas se almacenaron en bolsas de papel.

Para realizar la extracción del aceite esencial se siguió el método de arrastre al vapor utilizando 100 g de hojas de L. palmeri durante 4 h con ayuda de un equipo Clevenger (Winzer®, USA). El aceite esencial fue separado de la fase acuosa por medio de decantación y posteriormente se le agregó sulfato de sodio anhidro para eliminar la humedad del aceite esencial; ya extraído el aceite esencial se conservó en viales ámbar a - 4 ºC.

Para el extracto acuoso se pesaron 70 g de hoja seca, se colocaron en un vaso de precipitado con agua destilada y se agitó durante 24 h; posteriormente se filtró por gravedad y el filtrado fue liofilizado en un equipo (LABCONCO FreeZone, USA). El extracto acuoso restante no liofilizado fue conservado a - 4 °C.

Análisis de cromatografía de gases/masas del aceite esencial y el extracto acuoso de orégano cultivado ( Lippia palmeri W.)

La identificación y cuantificación de los compuestos que forman el aceite esencial y extracto acuoso se determinaron utilizando un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies 7890, USA) acoplado a un espectrómetro de masas, cuádrupolo simple (Agilent 5975C, USA), con una fuente de ionización de impacto electrónico a 70 eV. Se utilizó una columna capilar HP-5MS UI de 30 m de longitud, 0.25 mm de diámetro interno y 0.25 µm de espesor de película, usando helio como gas portador, con un flujo de 1 mL/min. El modo de inyección fue en modo split en una relación de 100:1; el volumen de inyección fue de 1 µL; el aceite esencial y extracto acuoso liofilizado se diluyeron en una proporción 1:50, con metanol grado HPLC ≥ 99.9 %. Las temperaturas de la interfase y de la fuente fueron 150 °C y 200 °C respectivamente. El programa de temperatura inició a 50 °C por 5 min, seguidos de una rampa de calentamiento a razón de 8 °C/min hasta 300 °C, manteniendo esta temperatura por 5 min; el tiempo total de corrida fue de 41.25 min. La adquisición de los datos se llevó a cabo en modo scan en un rango de masas de 40 - 450 m/z. En el software de análisis de datos MSD ChemStation E.02.02.1431; la identificación de los compuestos se llevó a cabo por su espectro de masas utilizando el programa 5975TAD Data Analysis vinculado a la Librería NIST 2011.

Bioensayo de la actividad de aceites esencial y el extracto acuoso del orégano

Se utilizaron los aislados registrados en el GenBank, FONRB01 con número de acceso MW712740 de Fusarium oxysporum y el aislado GVQO1 con número de acceso MZ683160 de Thanatephorus sp., los cuales fueron aislados e identificados en el Laboratorio de Biología Molecular y el Laboratorio de Fitopatología del Departamento de Agricultura y Ganadería de la Universidad de Sonora.

Siguiendo la metodología utilizada por ^{Barrera-Necha et al. (2008)} los aceites esenciales y sus compuestos fueron disueltos con ayuda de tween 20, se mezclaron por medio de agitación en matraces con 250 mL de medio de cultivo PDA esterilizado; las dosis utilizadas de aceite esencial, previamente solubilizado en DMSO (dimetil-sulfóxido), fueron: 0, 100, 150, 200, 250 y 300 µL/mL, utilizando al compuesto timol en dosis de 100 y 300 µL/mL como control positivo y el propio medio PDA como control negativo. Para el extracto acuoso liofilizado se añadieron los polvos vegetales del orégano al PDA en dosis de 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 y 0.30 g, también para el extracto acuoso se utilizaron el timol y el PDA como controles; las diferentes concentraciones y sus controles se vaciaron en cajas Petri de 90 x 14 mm. Un disco de agar de 7.5 mm del cultivo del patógeno se colocó en el centro de cada caja con los tratamientos; todas las cajas Petri con tratamiento, se pasaron a una incubadora a 27 °C por 7 d para Thanatephorus sp. y 13 d para F. oxysporum. El crecimiento del micelio o diámetro de la colonia fue medido de forma diaria utilizando un vernier. Con los datos de diámetro de crecimiento se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial con respecto al tratamiento testigo (C.M.R.T.) mediante la fórmula (Barrera-Necha, 2009):

Donde: TCT = tasa de crecimiento en el testigo y TCt = tasa de crecimiento del tratamiento.

Análisis estadístico

El diseño fue de bloques completamente al azar. Los resultados del porcentaje de inhibición del crecimiento micelial fueron transformados con la raíz cuadrada de arcoseno y evaluados mediante un análisis de varianza de una vía de clasificación. Posteriormente se realizó una comparación de medias mediante la prueba de Tukey, usando el paquete estadístico JMP versión 5.0.1 (SAS Institute, 2002).

Actividad biológica de los aceites esenciales sobre Fusarium oxysporum y Thanatephorus sp.

Se establecieron las dosis del aceite esencial para inhibir a F. oxysporum y Thanatephorus sp. En los resultados obtenidos para F. oxysporum no se observaron diferencias significativas entre las dosis utilizadas (p ≤ 0.05). Se obtuvieron resultados relevantes en los 5 tratamientos de aceite esencial del orégano al igual que con el carvacrol como control positivo, mostrando una fuerte actividad biológica en contra del hongo, al obtener una inhibición total e impedir el crecimiento micelial en cualquiera de sus dosis aplicadas. Estos resultados coinciden con lo reportado por ^{Wogiatzi et al. (2009)} quienes encontraron que los biotipos de O. vulgare ricos en timol y carvacrol inhibieron satisfactoriamente el crecimiento micelial de F. oxysporum. Los resultados encontrados en nuestra investigación son de gran relevancia, considerando la importancia de encontrar alternativas naturales para erradicar a F. oxysporum, ya que éste se encuentra entre los hongos fitopatógenos más importantes a nivel mundial por los daños causados en cultivos y que además puede afectar la salud humana (^{Dean et al., 2012})

Para Thanatephorus sp. la dosis de 100 µL/mL fue la que tuvo menor efecto de inhibición entre 90 y 93 %, pero a medida que se iba incrementado la dosis de aceite esencial, este tenía un control in vitro hasta llegar a un 99 y 100 % de inhibición en el transcurso de los 7 d (Figura 1), se encontraron diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre los tratamientos de 100 y 150 µL/mL respecto a los demás. Con la tendencia en la baja del crecimiento micelial nos indica que a mayor cantidad de aceite esencial se tiene una mayor sensibilidad por parte de Thanatephorus sp. al tener una inhibición total en el crecimiento del micelio. ^{Siramon et al. (2013)} trabajaron de forma in vitro con el aceite esencial de eucalipto rojo contra Chaetomium globosum, Fusarium oxysporum, Aspergillus niger, Thanatephorus cucumeris y Rhizopus oryzae, este aceite esencial tuvo una inhibición inducida de entre el 84 y 100 % para F. oxysporum y T. cucumeris.

Figura 1 Actividad antifúngica del aceite esencial de L. palmeri en dosis de 100, 150, 200, 250 y 300 µL/mL; como control positivo carvacrol 100 y 300 µL/mL, expresada en porcentaje de inhibición del crecimiento del hongo Thanatephorus sp. prueba de medias entre las diferentes concentraciones (p ≤ 0.05). 

Figure 1: Antifungal activity of the essential oil of L. palmeri at dose of 100, 150, 200, 250 and 300 µL/mL; as a positive control Carvacrol 100 and 300 µL/mL expressed as a percentage of inhibition of the growth of the fungus Thanatephorus sp. test of means between the different concentrations (p ≤ 0.05). 

Actividad biológica de los extractos acuosos sobre Fusarium oxysporum y Thanatephorus sp.

Se observaron diferencias significativas (p ≤ 0.05) en los tratamientos aplicados para la inhibición de F. oxysporum utilizando extracto acuoso del orégano, las dosis con mejor resultado de 0.25 g y 0.30 g con una inhibición entre el 60 % y 90 % las dosis más bajas que fueron de 0.10 a 0.15 g inhibieron entre el 20 % y 60 % el crecimiento micelial (Figura 2); en otros estudios se han experimentado con extractos acuosos evaluando el potencial antifúngico, Jawadayn-Talib et al. (2020) probaron diferentes partes de hojas y raíces de Chenopodium album sobre Alternaria alternata, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Pythium aphanidermatum y Sclerotinia sclerotium, utilizando las concentraciones de 0, 5, 10 y 15 % de extracto de acuoso de hojas y raíces, concluyendo que este tenía una reducción significativa del crecimiento del micelio de hongos teniendo una inhibición entre el 15 y 100 %.

Figura 2 Actividad antifúngica del extracto acuoso liofilizado de L. palmeri en dosis de 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 y 0.30 g en 250 mL de PDA; como control positivo carvacrol 100 y 300 µL/mL expresada en porcentaje de inhibición del crecimiento del hongo F. oxysporum. prueba de medias entre las diferentes concentraciones (p ≤ 0.05). 

Figure 2: Antifungal activity of the lyophilized aqueous extract of L. palmeri at dose of 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 and 0.30 g in 250 mL PDA; as a positive control Carvacrol 100 and 300 µL/mL expressed as a percentage of inhibition of the growth of the fungus F. oxysporum. test of means between the different concentrations (p ≤ 0.05). 

Al igual que con F. oxysporum se utilizó el extracto acuoso de L. palmeri para inhibir a Thanatephorus sp. (Figura 3) se pudo observar que en las primeras 24 h, fue cuando las dosis tuvieron mejor respuesta. La dosis de 0.30 g tuvo una inhibición entre 58 y 100 %, mientras que las dosis más bajas de 0.10 y 0.15 g inhibieron entre 10 y 38 % existiendo diferencias significativas entre los tratamientos, los controles positivos y negativo. Se ha experimentado con extractos metanólicos de L. tridentata y Flourensia cernua sobre R. solani donde se inhibió entre el 100 % y 85 % respectivamente indicando que sí es posible controlar el desarrollo de hongos fitopatógenos con extractos vegetales (López-Benítez, 2005; ^{Rodríguez-Castro et al., 2020}).

Figura 3 Actividad antifúngica del extracto acuoso liofilizado de L. palmeri en dosis de 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 y 0.30 g en 250 mL PDA, expresada en porcentaje de inhibición del crecimiento del hongo Thanatephorus sp. Prueba de medias entre las diferentes concentraciones (p ≤ 0.05). 

Figure 3: Antifungal activity of the lyophilized aqueous extract of L. palmeri at concentrations of 0.10, 0.15, 0.20, .025 and 0.30 g in 250 mL PDA, expressed as a percentage of inhibition of the growth of the fungus Thanatephorus sp. test of means between the different concentrations (p ≤ 0.05). 

En diversas investigaciones se le atribuye el efecto antifúngico al terpeno timol y a su isómero el carvacrol que se encuentran en los aceites esenciales y extractos acuosos en especies como O. vulgare, L. alba, L. berlandieri y L. graveolens. Se ha reportado que estos compuestos pueden afectar al hongo al alterar su estructura morfológica, retrasando y reduciendo el desarrollo al producir lisis entre la membrana y pared celular del hongo (Kordal et al., 2008). Al tener contacto la membrana con el aceite esencial se da una pérdida de la integridad de la membrana y una disminución en la cantidad de ergosterol compuesto principal que forma la membrana de los hongos, así como una respuesta inhibitoria a la formación de la pared (^{Shreaz, 2016}). Por último, igualmente se ha señalado que la expresión de algunos genes pudiera verse afectada de forma negativa, especialmente, aquéllos involucrados en los procesos de la adhesión, desarrollo, dimorfismo y la reproducción de esporas del hongo (^{D’agostino, 2019}).