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Introducción
En el mundo las infecciones sanguíneas asociadas a los cuidados de la salud constituyen una causa importante de morbilidad y mortalidad. Las más frecuentes son primarias y están relacionadas con los catéteres vasculares. Las bacterias Gram positivas, especialmente Staphylococcus spp., son los agentes más frecuentes (74 - 92 % del total). Las bacterias se adhieren a las superficies abióticas formando biopelículas (biofilms) que los preservan de la eliminación mecánica, de los antimicrobianos sistémicos y del sistema inmune del huésped.
Las biopelículas están conformadas por comunidades complejas de microorganismos que están adheridos generalmente a superficies sólidas o líquidas y embebidos en una matriz exopolisacárida y, surgen como una estrategia de supervivencia en ambientes hostiles. Las infecciones relacionadas con biopelículas tienen un significativo impacto clínico (65 - 80 % del total). Las biopelículas están implicadas en las infecciones relacionadas con el uso de dispositivos biomédicos. La inhibición de formación de biopelículas constituye la principal estrategia de prevención de bacteriemias relacionadas con catéteres intravasculares (Gahlot et al, 2014; Wallace et al., 2017).
Actualmente los catéteres intravasculares pueden impregnarse con antibióticos para disminuir la incidencia de infecciones en pacientes críticos (Donelli y Francolini, 2001). Este uso conlleva el riesgo de inducir la emergencia de cepas multirresistentes o la infección en el paciente por bacterias resistentes al antibiótico impregnado en el catéter.
De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud la mayoría de las drogas en desarrollo son modificaciones de antibióticos existentes, ofreciendo beneficios a corto plazo en el tratamiento de las enfermedades infecciosas producidas por bacterias con multirresistencia a los antimicrobianos (Inoue y Minghui, 2017). Por lo tanto, se ha prestado especial atención a la evaluación de la aplicación de péptidos antimicrobianos de origen bacteriano para la atención de pacientes, por su eficacia y velocidad bactericida in vitro (Cavera et al., 2015; Delpech et al., 2017).
Enterococcus faecalis CECT7121 (depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo, CECT, Burjasot, Valencia, España) es una cepa probiótica productora de un péptido antimicrobiano de 4726 Da con actividad bactericida sobre bacterias Gram positivas denominado AP7121 (Sparo et al., 2006; 2009; Delpech et al., 2017; Delpech et al., 2019).
Previamente, se ha demostrado la actividad anti-biopelícula in vitro de AP7121 sobre múltiples aislamientos de origen clínico de Staphylococcus aureus y S. epidermidis multirresistentes y la prevención de formación de biopelículas por estas bacterias en una superficie abiótica (Delpech et al., 2020).
El objetivo de este trabajo fue determinar la actividad inhibitoria de adhesión bacteriana sobre catéteres intravasculares utilizados en Medicina Humana mediante experimentos de tratamiento con AP7121 previo, simultáneo o posterior al desafío con una cepa de colección internacional productora de biopelícula.
Materiales y métodos
Producción del péptido AP7121
Se aisló AP7121, siguiendo la metodología descripta previamente (Sparo et al., 2009). En resumen, se incubó la cepa probiótica E. faecalis CECT7121 a 35 ± 2 °C, durante 18 h, en caldo infusión cerebro-corazón (BHI, Laboratorio Britania, Buenos Aires, Argentina). Se inoculó el cultivo en 4 L de caldo BHI e incubó a 35 ± 2 °C, durante 9 h. Luego, se centrifugó a 15.000 g, a 4 ºC, durante 20 min. El sobrenadante se ajustó a pH: 7,0 y se precipitó de acuerdo a Dawson et al. (1969). Se centrifugó a 20.000 g, a 4 ºC, durante 20 min. El precipitado se re-suspendió en 40 mL de buffer fosfato salino (PBS), 5 mM, pH: 7,0. El péptido AP se aisló mediante una extracción físico-química, empleando cartuchos Sep-Pak™ C18 (Waters, Milford, EE.UU.). El extracto de E. faecalis (5 mL) se cargó en un cartucho, lavado previamente con acetonitrilo en ácido trifluoro acético (TFA, 0,1 %) y se eluyó con acetonitrilo (60 %)-TFA (0,1 %). El eluato se evaporó a sequedad utilizando una centrífuga de vacío (ThermoSavant Instuments, Hollbrook, EE.UU.). Se re-suspendió el precipitado en PBS (250 μL). Se inyectaron alícuotas de la suspensión (20 μL) en un sistema HPLC de fase reversa (Shimadzu, Kyoto, Japón) y se separaron en una columna Nucleosil C18 (5 μm, Pharmacia, Uppsala, Suecia). Fase móvil: buffer A (TFA 0,1 %) y buffer B (acetonitrilo 95 % en TFA 0,1 %). AP se eluyó en un gradiente lineal (95 % A/5 % B a 15 % A/85 % B), con una tasa de flujo de 0,2 mL/min, controlando la elución con un detector UV. Se recolectaron las fracciones en períodos regulares. Se evaporó la fracción activa hasta sequedad y se re-suspendió en buffer fosfato (50 mM, pH: 7,0). Se determinó la actividad inhibitoria sobre S. aureus ATCC 35556 por el método de difusión en pocillos previamente descrito (Sparo et al., 2009). Se detectó actividad biológica de AP7121 luego de 30 min de la inyección de la muestra, con aproximadamente 40 % de buffer B. Se determinó la concentración de AP7121 (Kit de ensayo de proteínas Pierce™ Coomassie, Thermo Scientific™). Finalmente se liofilizó hasta su posterior análisis.
Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIMAP7121)
Se utilizó para el ensayo la cepa formadora de biopelícula S. aureus ATCC 35556, SA (Seidi et al., 2008).
Se determinó la CIMAP7121 de SA mediante el micro-método de dilución en caldo. Brevemente, una colonia de SA (desarrollo de 18 h en agar BHI) se inoculó en caldo BHI y se incubó durante 18 h a 35 ± 2 ºC. Posteriormente cada aislamiento se inoculó en un caldo BHI fresco y se incubó hasta una absorbancia de 0,05 a 595 nm de longitud de onda. Alícuotas (20 µL) de diluciones seriadas de AP7121, en un rango de 0,25 mg/L a 64 mg/L, se agregaron a cada pocillo de las placas estériles (96 pocillos) que contenía 80 µL del cultivo de cada aislamiento. Se incubó a 35 ± 2 ºC durante 24 h con agitación continua y se leyó la absorbancia a 595 nm. Se definió la CIM como la menor concentración de AP7121 que inhibió completamente el desarrollo bacteriano. Se efectuaron tres experimentos por duplicado.
Determinación del tiempo de contacto
Se utilizaron segmentos (20 mm) de catéteres intravasculares (CV) de poliuretano (BILUM S, KFF S.A.; Argentina). Cada una de las secciones del CV se colocó en una solución de AP7121 durante 4, 2, 1 h, 30 min. Todas las muestras fueron procesadas por duplicado. Cada sección del catéter se introdujo en la solución de AP7121 de forma que todas las muestras completaran su contacto requerido al mismo tiempo. Luego los segmentos se transfirieron a tubos conteniendo 104 UFC∙mL-1 de la cepa S. aureus ATCC 35556, siguiendo el procedimiento descrito en el Protocolo B. Se realizaron tres experimentos por duplicado.
Estudios de adhesión en catéter
Para los estudios de adhesión en CV se ensayaron tres protocolos (A, B y C).
Protocolo A = Se sumergieron 3 segmentos (20 mm) de CV en una solución de AP7121 de concentración final CIMx1 y aproximadamente 104 UFCmL-1 de la cepa.
Protocolo B = tres segmentos de CV se pre-incubaron durante el tiempo óptimo de contacto, establecido previamente, con una solución de AP7121 CIMx1 de concentración final y luego los segmentos se transfieren a tubos conteniendo 104 UFC∙mL-1 de la cepa.
Protocolo C = tres segmentos de CV fueron pre-incubados con la cepa (104 UFCmL-1) durante 3 h, y se agregó el AP7121 a concentraciones final de CIMx1.
Como controles en cada protocolo se agregó un grupo con CV no tratados con AP7121.
Las muestras de los protocolos A, B y C se incubaron durante 18 h a 37 ºC. Posteriormente los segmentos de CV fueron lavados dos veces en BF y las bacterias fueron eliminadas mediante sonicación durante 5 min (Sonic Fisher Scientific, 500). Se determinó el número de células viables mediante recuento bacteriano en agar y se relacionó con el área de superficie del catéter. Los experimentos fueron realizados tres veces por duplicado.
Análisis estadístico
Los resultados se presentaron como media ± DE (desviación estándar). Los resultados se sometieron a análisis de varianza y, cuando era apropiado, a la prueba de Kruskal-Wallis para examinar la existencia de diferencias. Los valores se consideraron significativamente diferentes entre sí cuando p < 0,05.
Resultados y discusión
En la cepa S. aureus ATCC 35556 se obtuvo una CIMAP7121= 0,48 mg/L. El tiempo mínimo óptimo de contacto del péptido con el CV fue de 2 h ya que se observó un descenso significativo de las células viables (Tabla 1).
Tabla 1 Determinación del tiempo de pre-incubación de CV con AP7121.Tale 1. Determination of CV pre-incubation time with AP7121.
Table 1: Color of squash fruit peel (Cucurbita pepo L.) var. ‘Grey Zucchini’s.
| Protocolo Pre-incubación (horas) | S. aureus Control (Log10 UFC/mm-2) | S. aureus + AP7121 (Log10 UFC/mm-2) | Valor de pa |
| 4 h | 6.42 ± 0.08 | 4.31 ± 0.09 | p < 0.001 |
| 2 h | 6.35 ± 0.10 | 4.28 ± 0.08 | p < 0.001 |
| 1 h | 6.27 ± 0.12 | 5.79 ± 0.11 | p > 0.05 |
| 30 min | 6.36 ± 0.13 | 6.29 ± 0.10 | p > 0.05 |
Los resultados se presentan como media ± desviación estándar. a ANOVA y Kruskal-wallis test.
En relación a los estudios de adhesión al catéter, como se muestra en la Tabla 2 y en la Figura 1, se observó un descenso significativo de bacterias viables (p < 0,001) de S. aureus en 2 log10 (99,0 % de la población) cuando se agregó el péptido con la bacteria (A) y antes (2 h) de la adhesión bacteriana (B). En el protocolo C el descenso de viables también fue significativo (p < 0,01) ya que el descenso de viables fue de 1 log10 (90 % de la población).
Los grupos en riesgo por cateterización venosa de larga duración son los pacientes con quimioterapia, prematuros, trasplantados de precursores de células hematopoyéticas, con alimentación parenteral, dializados (Pitiriga et al., 2020). En este contexto, se planteó como objetivos generales: Investigar la potencial aplicación del péptido antimicrobiano AP7121 en Medicina Humana, focalizando los estudios en la actividad inhibitoria de AP7121 sobre la adhesión de bacterias a dispositivos médicos como son los catéteres vasculares.
Hasta el momento, la investigación para el desarrollo de péptidos antimicrobianos con fines terapéuticos se ha enfocado en bacteriocinas como nisina, lacticina y lisostafina (Hassan et al., 2012). La bacteriocina más estudiada, nisina, se ha propuesto como barrera antimicrobiana porque pueden adsorberse en las superficies y prevenir la adhesión bacteriana (Bower et al., 2001). De hecho, la adhesión de tres bacterias médicamente relevantes (S. aureus, S. epidermidis y E. faecalis) se inhibió significativamente tubos de succión tratados con nisina (Bower et al., 1998). Godoy-Santos et al. (2018) demostraron que la nisina producía permeabilización de la membrana de bacterias sésiles y mostró concordancia entre la pérdida de viabilidad y la pérdida de integridad de la membrana.
Table 2: Effect of AP7121 on S. aureus ATCC 35556 adhesion to CV.
| Protocolo | S. aureus Control (Log10 UFC/mm-2) | S. aureus + AP7121 (Log10 UFC/mm-2) | Valor de pa |
| A | 6.18 ± 0.06 | 4.11 ± 0.05 | p < 0.001 |
| B | 6.12 ± 0.12 | 4.01 ± 0.08 | p < 0.001 |
| C | 6.31 ± 0.11 | 5.27 ± 0.13 | p < 0.01 |
Los resultados se presentan como media ± desviación estándar. a ANOVA y Kruskal-wallis test.
En ensayos in vitro realizados con las bacteriocinas Pep5 y epidermina se observó una disminución significativa en el número de células viables de S. epidermidis adheridas a catéteres intravasculares de silicona (Fontana et al., 2005).
S. aureus puede formar biopelículas sobre diversos biomateriales y son responsables de infecciones recurrentes en pacientes hospitalizados por tiempo prolongado (Nan et al., 2015). Las biopelículas maduras son de difícil erradicación, complicando el tratamiento del agente patógeno (Dosler y Mataraci, 2013). AP7121 impide la colonización de S. aureus sobre CV y por lo tanto también constituye una potencial herramienta para la prevención de infecciones por formación de biopelículas.
Este estudio mostró que AP7121 previene la colonización de S. aureus productor de biopelícula en una superficie inerte como son los CV. El análisis del recuento de células viables mostró diferencias significativas entre el segmento no tratado (control) y el tratado (experimental) con AP7121.
La formación de biopelículas conduce a una pobre penetración de los antimicrobianos e incrementa la farmacorresistencia, ratificando la necesidad de explorar nuevos compuestos alternativos. En este estudio se demostró que AP7121 fue eficaz en inhibición de la formación de biopelículas estafilocócicas y tuvo efectos inhibitorios y bactericidas sobre células de biopelículas ya establecidas, lo que demuestra que también fue capaz de atravesar biopelículas existentes. La actividad de AP7121 sobre las bacterias sésiles se facilita por su carácter hidrofóbico, y la producción de muerte por lisis bacteriana formando poros en la membrana (Sparo et al., 2006; 2009; Delpech et al., 2020).
Es importante destacar que en AP se ha demostrado la ausencia de efectos citotóxicos (Sparo, 2006).
Conclusiones
El péptido AP7121 podría constituir una potencial herramienta para la inhibición de formación de biopelículas en CV. Los resultados preliminares obtenidos in vitro indican una acción rápida del péptido AP7121, sugiriendo que podría aplicarse previamente o en el momento de la colocación de catéteres vasculares y con posibilidad de aplicación sucesiva durante el uso del dispositivo médico. Sin embargo, son necesarios futuros estudios in vivo para validar su eficacia.
