Animales y dietas

El trabajo experimental se realizó en la unidad de producción porcina del Departamento de Agricultura y Ganadería de la Universidad de Sonora, sede Hermosillo (D.A.G UNISON) en los meses de mayo y junio del 2022. Las muestras recolectadas se analizaron en el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C. (CIAD). Se utilizaron un total de 20 cerdos macho Landrace x Yorkshire finalizadores, alojados individualmente en corrales provistos de bebedero y comedero. La fase de suplementación se realizó durante los 31 días previos al sacrificio. Diez corrales fueron asignados aleatoriamente a uno de los siguientes tratamientos: Grupo Testigo (animales que reciben dieta basal, DB sin OU) y grupo OU (animales recibiendo DB + 25 g OU/kg de alimento). La dieta basal fue adquirida de la empresa Kowi® que corresponde a dieta para cerdos finalizadores Fase 7 y cumple con las recomendaciones de la ^{NRC (2012)}; la composición del alimento se describe en la Tabla 1. El OU de variedad Tempranillo, 48 h después del prensado fue suministrado por una empresa productora de vino industrial en Ensenada, Baja California, se secó en un horno de convección ENVIRO-PAK, modelo Micro-Pak, serie MP500 ( Clackamas, OR, USA) a 60°C durante 6 h y se obtuvo un producto con una humedad menor de 10%. El OU seco se molió a un tamaño de partícula de 1 mm en un equipo Pulvex 200 (Cd. México, Mex) para obtener la harina de OU y se empacó, bolsas de plástico selladas al vacío, se protegió de la luz y se mantuvo a 4 °C hasta su uso. Se adicionó en forma harina (^{Kumanda et al., 2019}). El alimento y el agua se proporcionaron ad libitum.

La determinación de la composición proximal de la harina de OU se realizó en un laboratorio de CIAD, A.C., por los métodos oficiales de la ^{AOAC (2005)}, en cuanto a la fibra total, fibra detergente neutra (FDN) y fibra detergente ácida (FDA), fueron determinadas por un laboratorio externo AGROLAB MEXICO (Durango, Dgo, México), mientras que para la extracción de sus compuestos fenólicos se empleó la metodología descrita por ^{Casagrande et al., (2019)}. Para la determinación de fenoles totales y flavonoides se llevaron a cabo los métodos de Folin-Ciocalteu (^{Singleton y Rossi, 1965}) y ^{Park et al., (1998)} respectivamente. La capacidad antioxidante total de OU se midió usando la metodología descrita por ^{Echegaray et al., (2021)} para las técnicas de 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH), potencial reductor férrico (FRAP) y el TEAC equivalente en trolox por la técnica de ácido 2, 2’ Azinobis-3-etil- benzotiazolin-6 sulfónico (ABTS).

Recolección de muestra de heces

Se recolectaron muestras de heces previa a la suplementación y a los 31 días posteriores a la suplementación, para evaluar el comportamiento de la microbiota. Se recolectaron muestras de cuatro animales por tratamiento en cada tiempo mencionado. Para su colecta, se realizó un estímulo del esfínter anal a los animales y las heces se colocaron directamente en un frasco estéril para muestras clínicas. Las muestras fueron etiquetadas y colocadas en una hielera para su transporte a los laboratorios de CIAD. Fueron almacenadas a 4 °C y procesadas dentro de las primeras 24 h.

Análisis de Microbiota

Las extracciones de ADN se llevaron a cabo utilizando el QIAmp Fast DNA Stool Minikit de QIAGEN, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se identificaron las bacterias de interés en este estudio, empleando secuencias de iniciadores publicadas (Tabla 2). Para la detección de los géneros Lactobacillus, Faecalibacterium, Campylobacter, E. coli y procariota se utilizó HotStart-IT® SYBR® Green qPCR Master Mix Kit (Affymetrix; Lot. 4274886; Santa Clara, CA). La amplificación se realizó en el termociclador StepOne TM (Applied BioSystems).

Para la cuantificación de los géneros bacterianos seleccionados, se determinó la abundancia relativa en función de la amplificación relativa. Para el análisis se utilizó la relación entre niveles de expresión del gen de interés con respecto al de un gen de referencia, para obtener los valores de ΔCt (Ct gen interés - Ct gen de referencia). En donde Ct es el ciclo en el que se detecta la fluorescencia acumulada por encima del nivel umbral, lo que es inversamente proporcional a la cantidad de templado (ADN) inicial en la muestra.

Se emplearon los valores de Ct de la detección del gen 16S de procariotas como gen de referencia y el valor de Ct del género específico evaluado para obtener el valor de la amplificación relativa (^{Livak y Schmittgen, 2001}). Los valores de abundancia relativa se obtuvieron con la siguiente ecuación:

Comportamiento productivo

Todos los animales se pesaron individualmente al inicio y al final del experimento, utilizando una balanza electrónica DIABATEC Modelo Lumina (Guadalajara, Mex.). La ganancia diaria promedio (GDP) se estimó por la diferencia entre el peso inicial y final dividido entre los 31 d del período de alimentación. El consumo de alimento se evaluó diariamente a partir de la diferencia de peso entre el alimento ofrecido y el alimento rechazado, se utilizó una báscula DIABATEC modelo Básica (Guadalajara, Mex.). La tasa de conversión alimenticia (CA) por corral/tratamiento se basó en el consumo promedio de alimento y GDP. Los animales también se observaron diariamente durante todo el estudio y no se observaron efectos adversos a la suplementación del OU.

Diseño experimental y análisis estadístico

Se verificó normalidad de los datos por la prueba de Kolmogorov y homogeneidad de varianzas por la prueba de Levene. Para los resultados de capacidad antioxidante y composición proximal del OU, se realizó estadística descriptiva. Todos los datos se analizaron bajo un diseño completamente al azar. Para las variables de desempeño productivo, el análisis de varianza incluyó los tratamientos como efecto fijo y el peso inicial individual del animal como covariable. Se consideró a cada animal como la unidad experimental. Los datos de abundancia de la MI se analizaron mediante un análisis de varianza de una vía, ajustando como factor principal a los tratamientos y como covariable a los valores iniciales de la MI. Los valores de abundancia relativa de la MI al final de la suplementación, fueron transformados a Log10 para ajustarlos a la normalidad. La significación se estimó a un nivel de probabilidad de 0.05 en el tipo de error I. Todos los datos se procesaron mediante el paquete estadístico NCSS (^{Hintze, 2007}).

Comportamiento productivo

Los valores medios de cada tratamiento referentes al peso inicial, peso final, ganancia de peso diaria, ganancia de peso, consumo de alimento diario y conversión alimenticia durante el periodo experimental de los 31 días se presentan en la Tabla 4. Se observó que no hubo diferencias significativas (p > 0.05) en el peso inicial (d-0) entre el grupo testigo (80.08 ± 2.70 kg) y el grupo OU (80.04 ± 2.70 kg). Pasados los 31 días se presentó un peso final mayor (p < 0.05) en los animales suplementados con el OU, reportándose un peso medio de 119.55 ± 2.4 kg, con relación al grupo testigo, donde se presentó un peso de 115.37 ± 2.60 kg. La suplementación con OU mostró un efecto positivo en la GPD 1.27 ± 0.03 y en la ganancia total de 39.50 ± 1.13 kg, ambas significativamente mayores (p < 0.05) en comparación al grupo testigo1.15± 0.03 y 35.93 ± 1.93, respectivamente. Por otro lado, el consumo de alimento diario también fue mayor (p < 0.05) en los animales suplementados con OU, con un consumo medio de 3.41 ± 0.07 kg con respecto testigo el cual mostró un consumo de 3.10 ± 0.07 kg. Sin embargo, la suplementación no tuvo un efecto significativo (p > 0.05) sobre la conversión alimenticia, aunque benefició la ganancia de peso, también incrementó el consumo de alimento. Este aumento en el consumo de alimento indica el potencial que tiene el OU para mejorar la palatabilidad del alimento, tal como ha sido documentado en otras especies por investigaciones previas (^{Tayengwa et al., 2020}; ^{Tayengwa et al., 2021}). Al evaluar las diferencias en términos de costos de producción, se observa que, a pesar del aumento en el consumo de alimento, éste no tuvo un gran impacto, ya que el incremento en la ganancia de peso fue del 10% en comparación con el grupo de control. Esto podría reducir los tiempos de producción en la granja, ya que, por ejemplo, para alcanzar un peso final de 115 kg para el sacrificio, se requieren 27 d con el grupo con OU y 30 d con el grupo de testigo. Esto se calcula considerando la diferencia entre el peso objetivo y el peso inicial dividido por la ganancia de peso diaria, lo que resulta en una diferencia de tres días menos para el grupo OU.

Si bien, son escasos los estudios que evalúan el efecto del OU en el comportamiento productivo de cerdos en la etapa de finalización, existen estudios donde reportan su efecto en etapas de producción más tempranas, sin embargo, resultan contrastantes entre ellos y con nuestros resultados. Estudios como el de ^{Chedea et al. (2018)}, en donde suplementaron con 5 % de OU a lechones recién destetados durante 36 d, reportan un incremento en el consumo de alimento diario promedio, pero no un efecto en la ganancia de peso. Mientras que estudios como el de ^{Kafantaris et al. (2018)}, en donde evaluaron la suplementación de un ensilaje con 9 % de OU durante 30 días, como aditivo alimentario en la dieta de lechones destetados con 20 días de edad, sí observaron un incremento del 23.65 % en la GDP a lo largo de todo el periodo experimental con relación al testigo. Dicho porcentaje, representó una diferencia de 0.044 kg/d, ya que se observó una GDP de 0.186 ± 0.01 kg/d en el control y 0.230 ± 0.01 kg/d en el grupo suplementado con OU. Además de observar que, con la suplementación el consumo de alimento promedio fue significativamente mayor de los 35 a 50 d de edad, mientras que la conversión alimenticia fue significativamente más baja de los 20 a 35 d de edad. En cerdos lechones el OU presentó una GDP mayor, 0.044 kg/d más con relación al control; mientras que, en el presente trabajo en cerdos finalizadores, dicha diferencia fue de 0.27 kg/d.

Por otro lado, los estudios de ^{Hao et al. (2015)} y ^{Wang et al. (2020)}, en donde suplementaron con procianidinas de semilla de uva (en concentraciones de 50, 100, 150 mg/kg) y con 5 % de OU, respectivamente, durante 4 semanas a cerdos destetados, no reportaron un efecto en el comportamiento productivo. Así también, en el estudio de ^{Sehm et al. (2011)}, en donde suplementaron durante 19 días a 36 lechones de 31 d de edad con 3.5 % de OU, no se reportaron cambios significativos en el consumo de alimento y la GDP con relación al testigo.

Si bien, en el presente estudio, la inclusión de 25 g de OU/kg no presentó un aumento significativo en la conversión alimenticia de cerdos finalizadores respecto al control, si mostró un efecto en el consumo de alimento y en la ganancia de peso. Se considera que la alimentación puede representar hasta el 70% de los costos totales de producción (^{Pomar y Remus, 2019}), la utilización de OU puede mitigar dichos costos al acortar los tiempos de producción, permitiendo que el animal alcance el peso de mercado antes de tiempo y reduciendo así también los costos de su mantenimiento.

Microbiota Intestinal

El comportamiento que mostró la abundancia relativa de los géneros de interés al transcurrir el periodo experimental independientemente del tratamiento se observa en la Figura 1. Al concluir la suplementación, la abundancia relativa de Lactobacillus y E. coli no mostró un cambio (p > 0.05) en comparación con su abundancia previa a la suplementación, en ambos tratamientos (testigo y OU). En cuanto a Faecalibacterium, disminuyó (p < 0.05) en ambos tratamientos al transcurrir el periodo experimental. Mientras que Campylobacter disminuyó (p<0.05) en el grupo testigo y se mantuvo sin diferencias (p > 0.05) en el grupo suplementado con OU. ^{Luo et al. (2022)}, reportaron que los géneros Lactobacillus y Faecalibacterium son de los más abundantes durante el crecimiento del cerdo. Sin embargo, Lactobacillus es de los más abundantes y mayormente asociado a la etapa de lactancia, mientras que Faecalibacterium es de las predominantes en la etapa de crecimiento, pero no en la de finalización, lo que sugiere que estos dos géneros disminuyen conforme el animal se acerca a la finalización. Mientras que el género Escherichia, se reporta presente en todas las etapas de vida, principalmente en la lactancia. Lo anterior, podría explicar el comportamiento de estos géneros a través del tiempo independientemente de la suplementación con OU en el presente trabajo. En cuanto a Campylobacter y E. coli, se han observado en diversas etapas de vida del cerdo, principalmente en la lactancia, durante la transición hacia un alimento sólido y durante el crecimiento, siendo Campylobacter coli y Campylobacter jejuni las de mayor prevalencia (^{Young et al., 2000}; ^{Alter et al., 2005}; ^{De Rodas et al., 2018}). Aunque, este género puede estar presente en diferentes etapas de vida, se ha observado que su abundancia relativa incrementa en cerdos desafiados por E. coli (^{Kaevska et al., 2016}).

Figura 1 Comportamiento de la abundancia relativa de los géneros bacterianos de interés del día 0 al día 31. *Se comparó estadísticamente la abundancia relativa del día 0 con la del día 31, para cada género de interés en ambos tratamientos, considerando una p < 0.05 como significativa.  

Figure 1 Abundant relative of the bacterial genera at day 0 and 31. *The relative abundance at day 0 was statistically different compared with that of day 31 for each genus of interest in both treatments, considering p < 0.05 as significant. 

En cuanto al efecto de la suplementación de OU en los géneros estudiados, no se observó diferencias (p > 0.05) en la abundancia relativa de Lactobacillus, Faecalibacterium y E. coli, con relación al tratamiento testigo; mientras la de Campylobacter fue mayor en los animales suplementados con OU (p < 0.05) (Figura 1; Figura 2).

Figura 2 Abundancia relativa de los géneros bacterianos al final de la suplementación. La abundancia relativa se obtuvo de cuatro animales por tratamiento seleccionados aleatoriamente y se representaron en Log₁₀. *La diferencia entre tratamientos fue evaluada por ANOVA, considerando las abundancias relativas previas a la suplementación como covariable.  

Figure 2 Relative abundance of bacterial genera at the end of supplementation. The relative abundance was obtained from four randomly selected animals per treatment and represented in Log10. *Difference between treatments was evaluated by ANOVA, considering the relative abundances prior to supplementation as a covariate. 

^{Million et al. (2012)}, reportaron que varias de las especies pertenecientes al género Lactobacillus están asociadas a la ganancia de peso tanto en humanos como en animales, además, poseen un efecto probiótico por lo que son consideradas parte de la MI benéfica. En cerdos sanos, se ha observado que Lactobacillus es uno de los principales géneros, además se ve incrementado en el ciego y heces de cerdos que presentan una mayor eficiencia alimenticia (^{Yang et al., 2017}; ^{Bergamaschi et al., 2020}). En el presente trabajo, la adición de OU no tuvo un efecto en la abundancia relativa de Lactobacillus (p > 0.05), esto con relación al testigo. Si bien, la abundancia de este género usualmente disminuye posterior al destete conforme el animal crece, se han reportado en estudios como el de ^{Wang et al., (2020)} y ^{Choy et al., (2014)} un incremento significativo de este género al adicionar orujo o extracto de uva en dietas para lechones, por lo que se esperaba un resultado similar. Lo anterior, resulta contrastante con el estudio de ^{Grosu et al., (2020)} en donde suplementaron a cerdos destetados con peso medio de 9.13 kg con harina de semilla de uva, la cual, se asoció con la disminución de Lactobacillus, atribuido por los autores al tipo de compuestos fenólicos en la harina y su concentración. De igual forma, la harina de semilla de uva disminuyó la proliferación de Faecalibacterium, sin embargo, este género se asoció a niveles significativamente altos de butirato.

Por otro lado, ^{Quan et al., (2020)} encontraron una asociación del género Faecalibacterium, con la eficiencia alimenticia. A pesar de que, otros estudios como el de ^{McCormack et al. (2019)} y Niu et al., (2019) reportaron una menor abundancia de Faecalibacterium en heces de cerdos con mayor eficiencia alimenticia, no se puede asociar directamente este género con una eficiencia alimenticia deficiente debido a su capacidad de producir butirato, el cual posee actividad antiinflamatoria y se relaciona benéficamente con el aprovechamiento del alimento. ^{Grosu et al. (2020)}. Además, Faecalibacterium prausnitzii es considerado como un probiótico de nueva generación (^{Almeida et al., 2020}). Este género, es también asociado al consumo de antibióticos promotores de crecimiento y al consumo de fibra lo cual puede influir en su abundancia en el intestino (^{Koh et al., 2016}; ^{Broom, 2018}; ^{Pluske y Zentek, 2019b}). Estudios como el de ^{Massacci et al. (2020)}, reportaron que el destete tardío puede también promover la proliferación de Faecalibacterium, permitiéndole al animal acumular una mayor abundancia de microrganismos benéficos antes del destete, y así, disminuir la disbiosis intestinal posterior a esta etapa de gran estrés y riesgo para el animal. Lo cual, hace a este género bacteriano importante de evaluar en la etapa de finalización, esperando un efecto positivo de la suplementación del OU sobre la proliferación de este género, con el objetivo de reducir problemas infecciosos en los animales y mantener una mejor salud intestinal. Sin embargo, no se observó en el presente estudio, un incremento significativo (p > 0.05) en la abundancia de Faecalibacterium con la suplementación. Esto, se puede atribuir a la alta abundancia relativa de E. coli, en relación con los demás géneros de interés, ya que se ha observado en lechones destetados desafiados con E. coli, que la abundancia de Faecalibacterium y Lactobacillus se ve disminuida, mientras que Campylobacter incrementa (^{Kaevska et al., 2016}), un comportamiento similar a lo observado en el presente trabajo en cerdos finalizadores.

En cuanto a Campylobacter, su abundancia relativa incrementó (p < 0.05) con la suplementación de OU. En parte, similar a lo encontrado en este trabajo, ^{Williams et al., (2017)} reportaron que la adición en un 5 % de OU rico en polifenoles a una dieta basal para cerdos machos y hembras de 7 - 8 semanas de edad, además de disminuir la abundancia relativa del género Lactobacillus, incrementó la de Campylobacter. Mientras que ^{Kafantaris et al. (2018)}, evaluaron la suplementación de un ensilaje con 9 % de OU durante 30 d como aditivo alimentario en la dieta de 24 lechones destetados con 20 d de edad, y observaron que Campylobacter sí se vio disminuida. Además, mejoró el crecimiento de bacterias probióticas facultativas (hasta en 1.2 log UFC/g) y bacterias ácido-lácticas (hasta 2.0 log UFC/g) significativamente. Sin embargo, en este estudio, para la evaluación del crecimiento bacteriano se incubaron previamente en medios de cultivo en incubadoras termoestables y su crecimiento se expresó en log UFC/g, lo cual podría tener menos exactitud que la determinación por alguna técnica molecular.

Bacterias patógenas, como las pertenecientes al género Escherichia, se han correlacionado negativamente con la ganancia de peso diaria y el peso de la canal de cerdos de engorde, mientras que cerdos más magros se reporta una menor abundancia de estas bacterias en el íleon y ciego. De igual forma, la reducción en la abundancia de bacterias patógenas se relaciona con la reducción de la inflamación intestinal (^{Yang et al., 2016}; ^{Torres-Pitarch et al., 2020}; ^{Gardiner et al., 2020}). De hecho, Escherichia coli enterotoxígena (ETEC) es el patógeno epidémico transmitido por alimentos más común que causa diarrea. La cual, es desencadenada por las adhesinas fimbriales y la enterotoxina, que promueven que las bacterias patógenas se adhieran a las células epiteliales intestinales y provoquen alteración de los electrolitos y un desequilibrio ácido-base (^{Fleckenstein et al., 2010}; ^{Liu et al., 2017}; ^{Bin et al., 2018}). Por lo anterior, es de gran importancia encontrar alternativas alimentarias que contribuyan a mitigar la proliferación de estos patógenos y su efecto en el comportamiento productivo animal.

Se ha observado, que suplementos ricos en compuestos fenólicos, principalmente en proantocianidinas pueden actuar controlando bacterias patógenas como E. coli, evitando futuros problemas infecciosos en los cerdos (^{Verhelst et al., 2014}). Sin embargo, en el presente trabajo no se presentaron cambios en la abundancia relativa (p > 0.05) de E. coli con la suplementación, coincidiendo con lo reportado por ^{Wang et al. (2020)}, donde reportan que si bien, E. coli incrementó un poco con la suplementación de OU, este incremento no fue significativo.

El efecto moderado de la suplementación de OU en la MI es principalmente atribuido al contenido y tipo de compuestos fenólicos en el orujo y su nivel de inclusión en la dieta, así como también pudo influir la variedad de uva, el hecho de que se suplementó como una harina y la composición de ésta.