Trabajo científico

 

Actividad antioxidante y antimicrobiana del extracto hexánico y compuestos puros del rizoma de Aristolochia taliscana

 

Antioxidant and antimicrobial activities of hexane extracts and pure compounds from Aristolochia taliscana rhizome

 

María Adelina Jiménez Arellanes,¹ Nallely Rosalba Román Cortés,¹ Ignacio García²

 

¹ Unidad de Investigación Médica en Farmacología de Productos Naturales, UMAE Hospital de Pediatría, Edificio CORSE, CMN Siglo XXI, IMSS.

² Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec, TESE.

 

Correspondencia

Dra. María Adelina Jiménez Arellanes
U.I.M. Farmacología Productos Naturales,
Hospital de Pediatría, Ed. CORSE
2° piso, Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS.
Av. Cuauhtémoc 330 Col. Doctores 06720,
Delg. Cuauhtémoc, México, D.F.
e-mail: adelinajim08@prodigy.net.mx

 

Fecha de recepción: 23 de marzo de 2011.
Fecha de recepción de modificaciones: 13 de junio de 2011.
Fecha de aceptación: 8 de agosto de 2011.

 

Resumen

Aristolochia taliscana es una especie medicinal conocida como guaco. Por fraccionamiento químico del extracto hexánico se aisló (±)-licarina A y B, eupomatenoide 1 y 7, los cuales fueron identificados por comparación de sus datos espectroscópicos y espectrométricos. La actividad antioxidante y el contenido de polifenoles se determinó por el método ABTS y con reactivo de Folin-Ciocalteau, respectivamente. La actividad antibacteriana se realizó por el método de dilución contra Escherichia coli, Pseudomona fluorescens y Listeria monocytogenes. La (±)-licarina A, el eupomatenoide 7 y el extracto hexánico presentaron significativa actividad antioxidante; la (±)-licarina A y el eupomatenoide 7 resultaron positivos en la prueba de polifenoles. El extracto hexánico y el eupomatenoide inhibieron el crecimiento de las bacterias, con CMI=0.5 mg/mL y 0.7 mg/mL, respectivamente.

Palabras clave: Aristolochia taliscana, (±)-licarina A y B, eupomatenoide 1 y 7, antioxidante, antimicrobiano.

 

Abstract

Aristolochia taliscana is a medicinal species known as guaco. By chemical fractionation from the hexanic extract, (±)-licarin A and B, and eupomatenoid 1 and 7 were isolated. These compounds were identified by comparing spectroscopic and spectrometric data with those described in the literature. Antioxidant activity and polyphenols were determined by ABTS method and Folin-Ciocalteu reactive, respectively. Antibacterial activity was performed by broth dilution against Escherichia coli, Pseudomona fluorescens, and Lysteria monocytogenes. (±)-Licarin A, eupomatenoid 7, and the hexanic extract exhibited significant antioxidant activity; (±)-licarin A and eupomatenoid 7 were positive in polyphenols test. The hexanic extract and eupomatenoid 7 inhibited the growth of all bacteria strains, showing an MIC = 0.5 L and 0.7 mg/mL, respectively.

Keywords: Aristolochia taliscana, (±)-licarin A and B, eupomatenoid 1 and 7, antioxidant, antimicrobial.

 

Introducción

Aristolochia taliscana es conocida comúnmente en México como guaco o raíz de guaco, pertenece a la familia Aristolochiaceae y es una hierba de naturaleza trepadora.¹ En la medicina tradicional, la infusión del rizoma es empleada para tratar mordeduras de serpiente, afecciones dermatológicas, diarrea y tos.² Estudios químicos previos describen que esta planta biosintetiza neolignanos como (±)-licarina A y B y eupomatenoide 1 y 7, austrobailignano 7, fragransina A₁ entre otros.^2,3 Tres de estos compuestos inhibieron el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis H37Rv; la (±)-licarina A y el eupomatenoide 7 presentaron una Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) =25 μg/mL y la (±)-licarina B mostró una CMI =50 μg/mL. Además, la (±)-li-carina A resultó muy activo contra 4 cepas monoresistentes de M. tuberculosis H37Rv, contra 12 aislados clínicos multifarmacoresistentes (MDR) de M. tuberculosis y 5 cepas de mycobacterias no tuberculosas con un rango de CMI =3.12 - 12.5 μg/mL; la (±)-licarina B y eupomatenoide 7 resultaron menos activas contra las mismas cepas de micobacterias.^4,5 Asimismo, reportaron que la dosis letal media (LD₅₀) del extracto y de la (±)-licarina A es mayor a 1706 mg/kg, efecto determinado en ratones Balb/c clínicamente sanos, administrando el compuesto por vía intragástrica.⁵ Continuando con el estudio químico-biológico de la especie, en este trabajo se describe la actividad antibacteriana y antioxidante del extracto hexánico, así como el aislamiento de un compuesto adicional y la actividad antibacteriana y antioxidante de los compuestos puros y del extracto.

Debido al elevado costo de los fármacos aunado al poco acceso a los sistemas de salud, al problema de la farmacoresistencia y los severos efectos secundarios que ocasionan los medicamentos, gran parte de la población hace uso de plantas medicinales para aliviar diversos padecimientos entre ellos los infecciosos; de aquí la importancia de explorar esta fuente para encontrar nuevas sustancias con actividad biológica.^6,7 Por otro lado, el empleo de plantas medicinales ha revivido como resultado de los problemas actuales asociados con el uso y abuso de antibióticos, por lo que considerarlo una fuente potencial de compuestos antimicrobianos es válido dada la capacidad que tienen para sintetizar diversos metabolitos secundarios (como flavonoides, taninos terpenos, cumarinas lignanos, etc).⁸

La presencia de enfermedades crónicas y neurodegenerativas como la arteriosclerosis, diabetes, cáncer, Alzheimer, envejecimiento prematuro, problemas cardiovasculares y el mal de Parkinson entre otros; van en aumento y su presencia está asociada con la presencia y/o producción de radicales libres (RL)^9,10. Para contrarrestar el efecto nocivo de los RL, actualmente se emplean sustancias antioxidantes (AO) de origen natural o sintético; sin embargo, el uso de estas últimas ha sido restringido por su potencial carcinogénico.¹¹ Una gran variedad de sustancias AO se encuentran en frutos, verduras comestibles y/o en plantas medicinales, los cuales son metabolitos secundarios como los polifenoles que poseen propiedades antimicrobianas y/o AO.^12,13 Dado el interés actual por consumir y buscar fuentes naturales de compuestos AO, en la actualidad se ha reportado este efecto en algunas especies medicinales como Rosmarinus oficinales, Thymus vulgaris, Juglans regia, Peper cubeba, Salvia officinalis L. Zingiber officinali, Myristica fragans, etc.^14-16 y solo de algunas de ellas se han descrito el o los compuestos responsables de esta actividad.^14,15 Por último, cabe señalar que la ingesta frecuente de AO reduce la incidencia de ciertas enfermedades como cáncer, problemas cardiovasculares y diabetes,^17-20 por lo que se puede prevenir y/o reducir la presencia de diversas enfermedades, lo cual es bien justificado. Dado el creciente interés por el consumo de AO es necesario identificar y cuantificar este tipo de compuestos en especies medicinales, ya que su presencia puede contribuir en el uso medicinal.

 

Material y método

Procedimiento general: los espectros de RMN-¹H y de RMN-¹³C de los compuestos aislados se obtuvieron en un equipo Bruker-Avance F, 300 MHz y Variant Unity, 75.4 MHz, respectivamente, utilizando tetrametilsilano como referencia interna en CDCI₃. Los espectros de masas por impacto electrónico se obtuvieron en un equipo Jeol AX-505 HA a 70 eV. Los puntos de fusión (p.f.) fueron determinados en un aparato Fisher-Johns y se reportan sin corregir. El fraccionamiento químico se hizo por cromatografía en columna abierta de fase normal (CC-FN) utilizando como fase estacionaria silica gel 60 (70-230 mesh, Merck) y la cromatografía en capa fina (ccf) se realizó en placas de aluminio recubiertas con silica gel 60 UV₂₅₄ (0.2 mm, Merck). Los disolventes empleados [n-Hexano (n-Hex), cloroformo (CHCI₃), y metanol (MeOH)] fueron grado RA (Mallinckrodt o J.T. Baker). Las placas de ccf fueron reveladas con H₂SO₄ al 10% y calentamiento al 100°C. La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) se desarrolló en un cromatógrafo Waters 600 conectado a un detector de arreglo de diodos 996. El control y manejo del equipo y la adquisición de datos se realizó mediante el programa Millennium 32 (Waters). Se empleó una columna analítica fase reversa Spherisorb^® 10 μm ODS2 RP (4.6 x 250 mm, Waters). Como fase móvil se empleó un sistema isocrático con MeOH (grado CLAR, J.T. Baker) para el eupomatenoide 7, licarina A y B, y para el eupomatenoide 1 se utilizó acetonitrilo:ácido fórmico 98:2. El flujo fue de 0.3 mL/min, el tiempo de corrida fue de 26 min. Las muestras fueron solubilizadas en MeOH (1 mg/mL) y el volumen de inyección fue de 50 μL.

Especie vegetal: el rizoma de A. taliscana fue adquirido en el Mercado de Sonora, México en Noviembre del 2008; un ejemplar se conserva en el herbario del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSSM) con la clave 1106.

Preparación del extracto y obtención de compuestos: el extracto se preparó vía maceración con n-Hexano RA a partir 2.068 kg de rizoma seco y molido, a temperatura ambiente. Mediante este proceso se obtuvieron 24.55 g de extracto crudo, el cual fue sometido a fraccionamiento químico por CC-FN siguiendo la metodología descrita por León y León-Díaz.^4,5

Determinación de la Actividad Antioxidante (AAO): a) preparación de muestras: 250 mg de muestra (extracto y/o compuesto puro) se disolvieron en 10 mL de acido acético en acetonitrilo al 4%, se colocó en Baño María a 30°C con agitación durante 1 h.; al finalizar este periodo las muestras fueron aforadas a 25 mL con la misma solución, esta mezcla se filtró con un Acrodisc^® (0.2 μm). Cada muestra se preparó al momento de emplearse.

b) Determinación de polifenoles totales (PT): este ensayo se llevó a cabo siguiendo la metodología descrita por Madhujith y Shahidi²¹ con algunas modificaciones. Se tomaron 500 μL de muestra previamente preparadas (inciso a), se le adicionaron 500 μL del reactivo de Folin-Ciocalteau y 4 mL de carbonato de sodio (Na₂CO₃, 0.7 M), esta mezcla se agitó vigorosamente e incubo durante 2 h. a temperatura ambiente y en oscuridad. Transcurrido el tiempo, las muestras fueron analizadas en un es-pectrofotómetro (Varian Cary 50 Conc) a 765 nm. El blanco fue 500 μL de agua destilada, 500 μL de reactivo Folin-Ciocalteau y 4 mL de Na₂CO₃. Como controles positivos se empleó ácido ascórbico (Sigma), ácido gálico (Sigma) a la concentración de 0-500 mg/L y catecol (0-100 mg/L, Sigma). Los resultados son el promedio de tres determinaciones y se expresan como mg de referencia/g de muestra (extracto o compuesto puro); calculados mediante la siguiente fórmula:

A = absorbancia después de agregar la muestra o referencia

m = pendiente de la curva patrón de la referencia*

b = ordenada al origen de la curva patrón de la referencia*

C = concentración de la muestra problema (g/L)

* Acido ascórbico, ácido gálico y catecol

c) Determinación de la actividad antioxidante (AAO) por el método ABTS: en este caso se empleó la técnica descrita por Re y col²², en la cual se genera el radical catión ABTS^•+ que se obtiene tras la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato de potasio (2.45 mM, concentración final), esta mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 16 h. antes de emplearse y es estable por 48 h. aproximadamente. El radical es diluido con etanol hasta obtener una absorbancia de 0.7 ± 0.1 a 734 nm a 30°C. Posteriormente, se toma 1 mL del radical ABTS^•+ y se le adiciona 10 μL de las muestras preparadas en el inciso a. La mezcla se agitó e incubó a 30°C, finalmente la absorbancia se determinó al minuto uno y al minuto 7 de reacción. El blanco empleado fue etanol y las referencias fueron: ácido gálico (0-0.5 mM), acido ascórbico (0-2.5 mM), y quercetina (0-1.3 mM). Los resultados son el promedio de tres determinaciones y se reportan como AAO equivalente a cada referencia y fueron calculados con la siguiente fórmula:

A = absorbancia después de agregar la muestra o referencia

m = pendiente de la curva patrón de la referencia

b = ordenada al origen de la curva patrón de la referencia

PM = peso molecular de la referencia (g/mol)

C = concentración de la muestra problema (g/L)

Evaluación de la actividad antimicrobiana: las bacterias empleadas fueron Escherichia coli (ATCC O157:H7), Pseudomona fluorescens (ATCC CD BB B-96) y Listeria monocytogenes (ATCC Scott A), las cuales se hicieron crecer y mantuvieron en caldo de soya y tripticaseína (TSB) a 38°C durante 48 h., cada cultivo se ajustó con medio al 0.5 del estándar de McFarland que corresponde a 10⁶ Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/mL. El ensayo se realizó empleando la técnica descrita por Mann y Markhman²³, con algunas modificaciones. Las muestras fueron pesadas y disueltas en dimetilsulfóxido (DMSO, al 5% del volumen final) y aforadas con el medio de cultivo previamente esterilizado, 5 mL de esta solución fue colocada en tubos con rosca a los cuales se les adicionó 5 mL más de TSB estéril. Los extractos y compuestos puros fueron evaluados en el rango de 0.5 a 1.0 mg/mL. Posteriormente, 1 mL de la suspensión de bacterias fue adicionada a las muestras problemas, las cuales fueron incubadas 24 h a 38°C. Finalmente, se tomaron las lecturas de absorbancia de cada muestra a 420 nm. Los controles positivos fueron estreptomicina y gentamicina (5 mg/mL). El blanco fue el medio con la muestra a evaluar sin bacterias. Los resultados se reportan como CMI, a la cual la muestra inhibe totalmente el crecimiento de microorganismos y las determinaciones se realizaron por triplicado.

 

Resultados y discusión

Obtención e identificación de los compuestos: se obtuvieron 24.55 g de extracto hexánico crudo (rendimiento del 1.2%). Por fraccionamiento químico primario se obtuvieron 8.6 mg de (±)-licarina A (p.f. 107-110°C), 771.6 mg de (±)-licarina B (p.f. 82-86°C) y 1030 mg de eupomatenoide 7 (p.f. 100-104°C). Los datos de los espectros de RMN-¹H y RMN-¹³C de cada compuesto están en concordancia con los descritos previamente.^3,5 De manera adicional se obtuvieron 1003 mg de eupomatenoide 1, este compuesto, no se había aislado en el trabajo previo realizado por León-Díaz⁵, pero se había reportado en la especie vegetal.^2,3 En la Figura 1 se muestra el perfil en CLAR de la mezcla de (±)-licarina A, B y del eupomatenoide 7; la (±)-licarina A presentó un T_R 10.09 min, el eupomatenoide 7 presentó un T_R de 13.7 min y la (±)-licarina B presentó un T_R 14.6 min. Las condiciones analíticas empleadas para detectar estos compuestos presentan buena resolución, cabe señalar que solo se ha descrito las condiciones analíticas para determinar (±)-licarina A en plasma²⁴ por lo que los datos descritos en este trabajo servirán para detectar y/o identificar la presencia de los compuestos en mezcla más complejas.

El eupomatenoide 1 (1.0 g) se obtuvo como polvo color crema soluble en CHCl₃, con R_f de 0.7 en el sistema de CHCl₃:Hex (1:1) y con p.f. de 154-155°C (158-159°C, 157-158°C)^3,25, y presentó un T_R de 13.7 min (Figura 2) al emplear un sistema isocrático de acetonitrilo:ácido fórmico 98:2. Dada la similitud estructural de este compuesto con el eupomatenoide 7, en el análisis por CLAR ambos presentaron el mismo T_R al emplear como sistema de elución MeOH 100%, por lo que fue necesario utilizar un sistema de elución diferente para detectarlo. La identificación química de este último compuesto se realizó por análisis de sus datos espectroscópicos y espectrométricos.

Los datos en el espectro de RMN-¹H fueron muy similares al del eupomatenoide 7 (Tabla 1) con la diferencia que el eupomatenoide 1 presenta un grupo metilendioxi entre los carbonos 2'y 3', la señal para este grupo aparece en δ 6.00, señal que está ausente en el caso del eupomatenoide 7 ya que en esta misma posición tiene un grupo metoxilo e hidroxilo (Tabla 1). En el espectro de masa del eupomatenoide 1 se observa un pico base de 322 que concuerda con el peso molecular (p.m.) reportado para este compuesto^2,3 y presenta 2 unidades menos que el eupomatenoide 7 (p.m. 324).^2-5

Actividad antimicrobiana: el extracto hexánico fue el que resultó más activo presentando una CMI=0.5 mg/mL contra las tres cepas de bacterias y el eupomatenoide 1 presentó una CMI=0.7 mg/mL. La (±)-licarina A, B y el eupomatenoide 7 resultaron inactivos presentando una CMI >1 mg/mL. Es importante señalar que la actividad antibacteriana para A. taliscana y para algunos compuestos puros no ha sido descrita, pero existen algunos trabajos donde se describe esta actividad para otras especies de Aristolochia^26-28 y para compuestos semejantes, como el eupomatenoide 3, 5 y 6,^29,30 por lo que los resultados obtenidos de la evaluación antibacteriana aquí descritos constituyen una contribución sobre el potencial biológico de la especie y de los compuestos puros. Cabe señalar que solo se ha descrito la actividad antimicrobiana para la (±)-licarina A, el cual resultó inactivo contra Staphylococcus aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa, E. coli, Candida tropicalis, C. glabrata, C. dubliniensis (CMI > 0.1 mg/mL), al ser evaluados por el método de microdilución en medio.³¹ En este trabajo se encontró que la (±)-licarina A fue inactivo contra E. coli y P. aeruginosa lo que concuerda con lo descrito previamente por Barros.³¹

Cuantificación de polifenoles totales: los estándares empleados fueron ácido gálico, ácido ascórbico y catecol; en la Tabla 2 se muestra el contenido de polifenoles del extracto hexánico de A. taliscana y de los compuestos puros. En el caso de las referencias empleadas se observa que fueron los compuestos puros los que presentaron mayor contenido de PT que el extracto hexánico. Además encontramos que la (±)-licarina A es el que presenta mayor contenido de PT, le sigue el eupomatenoide 7 y el menos activo fue el extracto hexánico. La (±)-licarina B y eupo-matenoide 1 resultaron inactivos.

Actividad antioxidante: el ensayo de ABTS mide la capacidad de compuestos para atrapar el radical ABTS^•+. En la Tabla 2 se describen los resultados obtenidos y están expresados como actividad antioxidante equivalente a la referencia (ácido gálico, ácido ascórbico o quercetina), como se observa sólo el eupomatenoide 7 y la (±)-licarina A fueron los más activos en ambos puntos de la determinación (minuto 1 y 7 de la reacción), el extracto hexánico resultó poco activo. Cabe señalar que tanto el eupomatenoide 7 como la (±)-licarina A presentan en su estructura grupos fenólicos; a los cuales se les atribuye el efecto AO. Está bien establecido que a mayor contenido de grupos fenólicos existe mayor AAO,²⁰ efecto que se observó para la (±)-licarina A y eupomatenoide 7, en cambio la (±)-licarina B y eupomatenoide 1 no presentan grupo fenólico por lo que el valor de PT fue de cero y por lo tanto no presentaron AAO. A la fecha, no se había descrito el efecto AO para la especie vegetal, ni para los compuestos puros, solo se ha descrito que la (±)-licarina A preserva la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) en células dañadas con glutamato; en este caso el compuesto atrapa RL y mantiene bajo los niveles del radical superóxido (*0₂^-) e inhibe la sobreproducción de óxido nítrico y del radical peroxinitrilo³². Este mismo compuesto presentó una significativa AAO con una concentración atrapadora media (CA₅₀) de 56.1 μg/mL al ser evaluado con 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH).³¹ Estudios adicionales están en curso para determinar el potencial AO de la (±)-licarina A y eupomatenoide 7 en modelos in vivo, así mismo se determinará la actividad antimicrobiana del eupomatenoide 1 contra cepas de bacterias resistentes y aislados clínicos.

 

Conclusiones

La (±)-licarina A y eupomatenoide 7 aislados del rizoma de A. taliscana presenta efecto antioxidante. Únicamente el extracto hexánico y el eupomatenoide 1 inhibieron el crecimiento de las tres cepas de bacterias. A. taliscana constituye una fuente de compuestos AO y antibacterianos.

 

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