Introducción

El género Selenicereus (A. Berger) Britton et Rose (Hylocereeae, Cactaceae), es nativo de las regiones tropicales de México y Centroamérica, se caracteriza por incluir plantas trepadoras con tallos cilíndricos o planos, flores nocturnas, generalmente blancas y grandes, así como frutos carnosos (^{Bauer, 2003}; ^{Bravo-Hollis, 1978}; ^{Korotkova et al., 2017}). Un análisis filogenético reciente para Hylocereeae revela que Selenicereus es monofilético (tipo S. grandiflorus (L.) Britton et Rose), solo si además incluye a Cryptocereus, Hylocereus, Mediocactus, Werckleocereus y Wilmatea, que en conjunto incluyen aproximadamente 31 especies (^{Korotkova et al., 2017}). Sin embargo, son escasos los estudios que permiten entender la diversidad taxonómica del género. Por ejemplo, ^{Bauer (2003)}, con base en una revisión de herbario propuso que S. purpusii (Weing.) S. Arias et N. Korotkova y S. ocamponis (Salm-Dyxk) D.R. Hunt representan la misma especie al no encontrar cambios discretos en los caracteres observados; sin embargo, ^{García-Aguilar et al. (2013)} mostraron evidencias moleculares que permiten reconocer de forma independiente ambos taxones.

^{Bauer (2003)} propuso algunos grupos taxonómicos informales en Selenicereus a partir de caracteres morfológicos, entre los que se encuentra el grupo S. vagans, caracterizado por tener costillas con margen obtuso y distribución hacia el oeste (Sinaloa a Michoacán) del territorio mexicano. Este grupo está compuesto por 3 especies: S. atropilosus Kimnach, S. murrillii Britton et Rose y S. vagans K. Brandegee. Más recientemente, ^{Bauer (2009)} describió a S. dorschianus de la costa de Jalisco, resaltando la similitud morfológica del tallo con S. vagans. Los taxones mencionados presentan dificultades en cuanto a su reconocimiento; por ejemplo, S. murrillii ha sido considerado en sinonimia con S. vagans (^{Guzmán et al., 2007}; ^{Terrazas et al., 2013}), mientras que para S. dorschianus no existe una base morfológica sólida, que demuestre su pertenencia al grupo S. vagans.

Algunos estudios sobre la anatomía de los tallos en Cactaceae enfatizan la relevancia taxonómica y filogenética de los caracteres de la epidermis a nivel de género y especie, principalmente dentro de la subfamilia Cactoideae (^{Bravo-Hollis, 1978}; ^{García Aguilar et al., 2009}; ^{Gibson y Nobel, 1986}; ^{Loza-Cornejo y Terrazas, 2003}; ^{Terrazas y Arias, 2002}; ^{Terrazas y Loza-Cornejo, 2002}; ^{Terrazas y Mauseth, 2002}). El córtex y el xilema secundario parecen no tener valor taxonómico debido a la plasticidad reportada (Terrazas y Arias, 2002). Además, los caracteres de la hipodermis, así como el tipo de matriz en el que se encuentren embebidos los vasos y la variación en el desarrollo de la madera, fueron reportados como informativos a nivel de género en la tribu Cacteae (^{Vázquez-Sánchez et al., 2017}).

Por otro lado, los análisis morfométricos aplicados a la sistemática vegetal han permitido reconocer especies con amplia variación morfológica o pertenecientes a complejos de especies en diversas familias de plantas (ArroyoCosultchi et al., 2010; ^{Cope et al., 2012}). A pesar de que este tipo de trabajos son escasos en Cactaceae, en ellos se ha demostrado que los caracteres morfológicos del tallo tienen valor taxonómico en la delimitación de taxones pertenecientes a complejos de especies en Cephalocereus (^{Arroyo-Cosultchi et al., 2010}), Coryphantha (^{Baker y Butterworth, 2013}), Echinocereus (^{Baker, 2006a}, ^b; ^{Sánchez et al., 2013}), Escobaria (^{Baker y Johnson, 2000}) y Melocactus (^{Mota-Lambert et al., 2006}).

Teniendo en cuenta las evidencias que señalan la relevancia de los caracteres anatómicos en Cactaceae para reconocer especies, este artículo tiene como objetivos: a) describir la anatomía del tallo en el grupo Selenicereus vagans (S. atropilosus, S. murrillii, S. vagans) y S. dorschianus, b) reconocer y evaluar los atributos anatómicos que permitan definir grupos discretos reconocibles como especies mediante el uso de métodos multivariados y c) mediante un análisis de similitud, poner a prueba la pertenencia de Selenicereus dorschianus a este grupo taxonómico.

Materiales y métodos

Se analizaron individuos de todos los taxones del grupo Selenicereus vagans, recolectados en campo y depositados en la colección de cactáceas del Jardín Botánico, Instituto de Biología UNAM. Se obtuvieron muestras de 3 localidades por cada taxón sobre las cuales se realizaron todos los análisis, excepto para S. murrillii, de quien sólo se contó con muestras de 1 localidad (Tabla 1). Todos los ejemplares tienen un respaldo depositado en MEXU.

Por cada individuo incluido, se cortaron segmentos de aproximadamente 1 cm de longitud de la región media de tallos maduros y se fijaron con FAA (formaldehidoácido acético-alcohol-agua) por 48 h, posteriormente se ablandaron con GAA 1:1:1 (glicerina-alcohol-agua) por varios meses. Las muestras se procesaron a través de la microtecnia convencional de inclusión en parafina (^{Sandoval-Zapotitla et al., 2005}). Se realizaron secciones transversales de 30 μm de espesor con un micrótomo de deslizamiento, se tiñeron con safranina-verde rápido y se montaron como preparaciones permanentes. Se obtuvieron segmentos epidérmicos mediante la técnica de aislamiento mecánico de epidermis (^{Sandoval-Zapotitla et al., 2005}) y se montaron con gelatina glicerinada como preparaciones semipermanentes. Para el estudio de la composición celular del xilema secundario, se recurrió a la técnica de maceración con solución Jeffrey (^{Sandoval-Zapotitla et al., 2005}), los elementos celulares disociados se tiñeron con safranina y se montaron en resina sintética.

Las observaciones fueron realizadas en un fotomicroscopio Axioskop (Carl Zeiss). Se capturaron fotomicrografías con una cámara de video ExwaveHAD (Sony) y las mediciones para los caracteres cuantitativos se realizaron con el analizador de imágenes ImageJ v.1.48. Se evaluó un total de 25 caracteres, entre cuantitativos y cualitativos (Tabla 2). En la descripción anatómica, se utilizó la terminología propuesta por ^{Koch et al. (2009)} para la superficie epidérmica; por ^{Terrazas y Mauseth (2002)} y por ^{Terrazas y Arias (2002)} para el sistema fundamental; mientras que para el xilema secundario, se siguieron las recomendaciones de la Asociación Internacional de Anatomistas de la Madera (IAWA, ^{Angyalossy-Alfonso et al., 1989}).

Se registraron 60 datos correspondientes a 3 individuos por especie (con excepción de S. murrillii donde se registraron 20 datos), para 19 caracteres anatómicos cuantitativos. Los datos de los caracteres cuantitativos continuos fueron transformados a logaritmo natural, mientras que los datos de los caracteres cuantitativos discretos fueron transformados mediante raíz cuadrada (^{Arroyo-Cosultchi et al., 2010}). Se aplicó un análisis discriminante canónico (ADC) evaluando los caracteres anatómicos cuantitativos por especie, se calcularon las distancias cuadradas de Mahalanobis (D²) y se probó su significancia estadística mediante la prueba de distancias de Fisher (^{Tapia et al., 2016}). Se llevó a cabo un análisis discriminante clasificatorio (AC) y a los caracteres con mayor carga seleccionados por el ADC, se les aplicó un análisis de varianza (Anova) y se compararon las medias entre grupos mediante una prueba HSD de Tukey; finalmente, se calculó el promedio (caracteres cuantitativos continuos) o moda (caracteres cuantitativos discretos) y la desviación estándar.

Se realizó un análisis fenético con NTSYS-PC v.2.1, para lo cual, se generó una matriz de datos mixta, en donde se incluyen los 6 caracteres cualitativos codificados como binarios sin orden específico, así como los promedios de los parámetros cuantitativos más relevantes generados a partir del análisis discriminante canónico. Se obtuvo una matriz de similitud mediante el coeficiente de distancia taxonómica y se utilizó ligamiento promedio (UPGMA) como algoritmo de agrupamiento. Todos los estadísticos fueron realizados con el programa JMP v.7, con excepción de la estandarización de las matrices de datos, el cálculo de las distancias de Mahalanobis y la prueba de distancias de Fisher, que fueron realizados con el programa XLStat.

Resultados

Las células epidérmicas en vista superficial son poligonales en todas las especies y sus paredes anticlinales son onduladas “tipo S” (Fig. 1A). En todos los casos las células epidérmicas presentan cristales prismáticos variables en tamaño y forma (Fig. 1B). Los estomas son paralelocíticos (Fig. 1C) y el poro estomático se encuentra orientado al azar en las 4 especies. En sección transversal la cutícula es lisa y puede desarrollar intrusiones (Fig. 1D). La epidermis es uniestratificada, conformada por células de paredes delgadas, oblongas con paredes periclinales externas convexas bajas (S. atropilosus y S. dorschianus, Fig. 1E), a elevadas (S. murrillii y S. vagans, Fig. 1F). Las células oclusivas respecto al resto de las células epidérmicas, pueden encontrarse al mismo nivel del resto de las células epidérmicas como en S. dorschianus (Fig. 1G), o estar semihundidas como en S. atropilosus, S. murrillii y S. vagans (Fig. 1H).

Figura 1 Anatomía del tallo de las especies del grupo S. vagans. A) Selenicereus atropilosus (H. Arreola 1473), células epidérmicas con paredes anticlinales onduladas. B) S. atropilosus (S. Arias 2216), cristales prismáticos epidérmicos. C) S. vagans (S. Arias 1832), estomas paralelocíticos. D) S. atropilosus (H. Arreola 1473), intrusiones cuticulares (flecha). E) S. dorschianus (S. Arias 2219), paredes periclinales externas convexas bajas. F) S. vagans (S. Arias 1832), paredes periclinales externas convexas elevadas. G) S. dorschianus (S. Arias 2219), estomas a nivel. H) S. murrillii (H. Sánchez-Mejorada 4206), estomas semihundidos. I) S. atropilosus (H. Areola 1473), córtex heterogéneo. J) Selenicereus vagans (S. Arias 1832), madera en sección transversal, vasos solitarios. K) S. dorschianus (S. Arias 2219), madera en sección transversal, vasos agrupados. L) S. vagans (J. Blancas 111), elemento de vaso con placa de perforación (*) y punteaduras intervasculares simples (flechas). M) S. atropilosus (S. Arias 2217), madera en sección tangencial. N) S. dorschianus (S. Arias 2220), madera en sección radial. O) S. vagans (J. Blancas 111), célula erecta de los radios, punteaduras simples en forma de ranura y punteaduras laterales grandes (flechas). Barras en A-H = 20 μm; I = 1000 μm; J, K, M, N = 100 μm; L, O = 50 μm. 

Debajo de la epidermis se encuentra la hipodermis, conformada por células colenquimatosas, con un engrosamiento uniforme de sus paredes primarias y difieren en grosor en los 4 taxones evaluados. En todos los taxones el córtex es heterogéneo, conformado por parénquima en empalizada inmediatamente debajo de la hipodermis y por parénquima de reserva hacia el cilindro vascular (Fig. 1I); sin embargo la proporción de parénquima en empalizada en S. atropilosus es mucho mayor y más evidente que en S. dorschianus, S. murrillii y S. vagans, las cuales presentan una mayor proporción de parénquima de reserva. En todos los casos el córtex presenta células de mucílago y abundantes cristales estiloideos y rafidios, así como haces vasculares con fibras sobre el floema como en S. murrillii y S. vagans, o sin ellas (S. atropilosus y S. dorschianus).

El floema secundario tiene asociado en la región más externa, esclerénquima conformado por estratos variables de fibras. El xilema secundario no presenta anillos de crecimiento, los vasos se encuentran embebidos en fibras y pueden ser solitarios como en S. atropilosus, S. murrillii y S. vagans (Fig. 1J), o en grupos como en S. dorschianus (Fig. 1K). El contorno de los vasos es redondeado, tienen placas de perforación simples, así como punteaduras intervasculares escalariformes grandes (Fig. 1L). El diámetro promedio de los vasos es de 36.19 ± 5.42 μm en S. murrillii y S. vagans, mientras que en S. atropilosus y S. dorschianus es de 48.33 ± 9.49 μm. El número de vasos/mm², en todos los casos es mayor a 100. La longitud de los elementos de vaso varía de 194 a 200 μm en todas las especies; mientras que la longitud de las fibras libriformes presentes tanto en el xilema secundario como en el esclerénquima asociado al floema secundario, varía de 400 a 500 μm en todas las especies.

El parénquima axial es paratraqueal escaso. Los radios son homogéneos, multiseriados (4 a 5 series), la altura de los mismos excede los 1,000 μm (Fig. 1M), conformados por células erectas (Fig. 1N), lignificadas y con punteaduras simples, en forma de ranura de célula radial a célula radial y con punteaduras laterales simples evidentes cuando se encuentran asociadas a los elementos de vaso (Fig. 1O). En todos los casos la médula es parenquimatosa, carece de haces vasculares y presenta células de mucílago así como gran cantidad de almidón de reserva.

El resultado del ADC mostró que las 3 primeras funciones canónicas poseen una representatividad de 100%. Los valores propios y lo valores de correlación canónica de estas funciones son altos (valores muy próximos a 1), lo cual indica que los parámetros evaluados tienen un gran peso en la discriminación de grupos (Tabla 3). El valor de Lambda de Wilks es bajo (λ = 0.01) y posee un valor crítico de F, estadísticamente significativo (p <0.05), lo que revela que los grupos tienen centroides distintos en las variables discriminantes.

En la representación gráfica (Fig. 2), a la derecha del eje canónico 1 se ubica la especie que tiene la cutícula más gruesa, las células oclusivas más largas, así como las paredes anticlinales de las células epidérmicas más gruesas (S. atropilosus); hacia el lado izquierdo sobre este mismo eje se encuentran las especies con las cutículas más delgadas, las células oclusivas más cortas, así como las paredes anticlinales de las células epidérmicas más delgadas (S. dorschianus, S. murrillii y S. vagans). Sobre el eje canónico 2, hacia la parte superior se ubica la especie con las células hipodérmicas más anchas y con paredes más engrosadas (S. dorschianus), mientras que hacia la parte inferior se localizan las especies que poseen células hipodérmicas más angostas y con paredes más delgadas (S. atropilosus, S. murrillii y S. vagans). Al analizar el eje canónico 3 (no incluido gráficamente), resulta que hacia el extremo positivo del mismo se ubican las especies que poseen las fibras de esclerénquima asociadas al floema secundario con paredes más gruesas (S. atropilosus, S. dorschianus y S. vagans), mientras que hacia el extremo negativo se ubica S. murrillii cuyas fibras de esclerénquima asociadas al floema secundario, tienen paredes más delgadas (Tabla 4).

Figura 2 Diagrama de dispersión de puntos en el espacio bidimensional del análisis discriminante canónico de 19 caracteres anatómicos cuantitativos evaluados por especie. Selenicereus atropilosus (+), S. dorschianus (♦), S. murrillii (◘), S. vagans (Z). 

El análisis clasificatorio arrojó que 98% de los registros se clasificaron correctamente a los grupos establecidos a priori, 4 registros de S. vagans se clasificaron en S. murrillii. Los valores de las distancias cuadradas de Mahalanobis muestran que la distancia entre las nubes de puntos es grande (Tabla 5); el valor de la prueba de distancias de Fisher es estadísticamente significativo (p <0.05). Los 7 caracteres con mayor carga en el ADC presentaron diferencias significativas (p <0.05) en el análisis de varianza para al menos 2 especies (Tabla 6).

El análisis de agrupamiento mostró 2 grupos de especies (Fig. 3). El primero y de mayor similitud está conformado por S. murrillii y S. vagans, quienes comparten una menor área de células epidérmicas, paredes anticlinales delgadas en las células epidérmicas, presencia de paredes periclinales convexas altas en las células epidérmicas, células hipodérmicas más angostas, así como haces vasculares corticales con fibras de paredes muy engrosadas. El segundo grupo y con menor similitud está integrado por S. atropilosus y S. dorschianus, que tienen cutículas más gruesas, células epidérmicas más grandes, paredes anticlinales más gruesas en las células epidérmicas y células epidérmicas con paredes periclinales externas convexas bajas. También comparten las células hipodérmicas más anchas, mayor grosor de la pared de las células hipodérmicas y mayor grosor de la pared de fibras asociadas al floema secundario.

Figura 3 Fenograma de las 4 especies analizadas a través del coeficiente de distancia taxonómica y UPGMA. 

Discusión

En el ADC, los caracteres con valores de carga más altos corresponden a atributos de la epidermis y la hipodermis, lo que es congruente con lo reportado por ^{Terrazas y Arias (2002)}, quienes enfatizan la importancia de estos tejidos como fuente de caracteres con relevancia taxonómica. Las 4 especies aquí estudiadas comparten la forma convexa de la pared periclinal externa de las células epidérmicas con variación en el grado de elevación (Fig. 1D-F), así como el córtex heterogéneo con diferente proporción de parénquima en empalizada. Este cambio gradual no había sido reportado para miembros de la tribu Hylocereeae y puede ser taxonómicamente informativo en la nueva propuesta filogenética de la tribu, particularmente en Selenicereus y los clados internos recuperados por ^{Korotkova et al. (2017)}, como ocurre en otras especies de Cactaceae (^{Bravo-Hollis, 1978}; ^{Gibson y Nobel, 1986}; ^{Terrazas y Arias, 2002}; ^{Terrazas y Mauseth, 2002}).

Tradicionalmente se considera que el índice estomático es útil para el reconocimiento de taxones a diferentes niveles (^{Meidner y Mansfield, 1968}; ^{Salisbury, 1928}; ^{Sharma y Dunn, 1968}). Sin embargo, ^{Conde (1975)} refiere que en Cactaceae, el índice estomático cambia con la adición de nuevas células epidérmicas, mientras que ^{Herrera-Martínez et al. (2015)} demostraron que en Selenicereus undatus las condiciones de cultivo y la región del tallo donde se calcule este parámetro, influyen en su variación, por lo que no representa un carácter diagnóstico. Nuestros resultados son congruentes con lo señalado por ^{Conde (1975)}, al encontrar que el índice estomático no mostró tener una representatividad alta en el análisis. Por otra parte, los estomas de S. dorschianus son superficiales, congruente con lo reportado por ^{Eggli (1984)} para S. anthonyanus (Alexander) D.R. Hunt y S setaceus (Salm-Dyck ex DC.) Werderm., en el complemento de las especies analizadas, los estomas se encuentran semihundidos. Por tanto, consideramos que la posición de los estomas respecto a las células epidérmicas es de importancia taxonómica y podría tener un mayor peso en el reconocimiento de especies de Selenicereus poco conocidas (p.ej., S. ocamponis / S. purpusii, S. costaricensis (F.A.C. Weber) S. Arias et N. Korotkova / S. monacanthus (Lem.) D.R. Hunt, como en el caso de Ferocactus (^{Grego-Valencia et al., 2014}).

En estudios previos se reportan cristales múltiples en las células de la epidermis sólo en algunos miembros de Cactoideae (^{Loza-Cornejo y Terrazas, 2003}; ^{Terrazas y Arias, 2002}). En este trabajo se reportan cristales múltiples por célula en las 4 especies analizadas, la presencia de cristales en las células epidérmicas es una condición compartida con S. ocamponis, S. purpusii y S. undatus (^{García-Aguilar et al., 2009}). De acuerdo con ^{Terrazas y Arias (2002)}, las condiciones ambientales influyen sobre el grosor de la cutícula y la hipodermis, por lo que recomiendan evitar su uso como caracteres taxonómicos. Sin embargo, en este caso, el espesor de la cutícula, el grosor de la pared de células hipodérmicas, así como el ancho de las mismas en sección transversal tienen valores de carga altos en el ADC y permiten distinguir a las especies. Aunque no hay otros estudios que respalden la eficacia de estos atributos en el reconocimiento de especies, el espesor de la cutícula, es importante para diferenciar a Cylindropuntia y Opuntia (^{Conde, 1975}). ^{Terrazas y Mauseth (2002)}, señalan que el córtex en Cactaceae no es informativo; sin embargo, en el grupo de Selenicereus analizado, el córtex puede tener una proporción diferencial de células de parénquima en empalizada y de reserva, siendo una mayor proporción de parénquima en empalizada un atributo que permitió diferenciar a S. atropilosus del resto de las especies.

Las células epidérmicas con menor área, las paredes anticlinales adelgazadas en las células epidérmicas, las paredes periclinales externas convexas más altas, las células hipodérmicas más angostas, así como los haces vasculares corticales con fibras de paredes muy gruesas, son caracteres comunes en S. vagans y S. murrillii. Es relevante interpretar esos atributos en un análisis de evolución de caracteres que permitan evaluar si representan apomorfias de estas especies. Por otra parte, reconocemos que caracteres como la cutícula más delgada, las células oclusivas más cortas y las células hipodérmicas con paredes más gruesas están presentes en S. murrillii pero no en S. vagans.

En este estudio, la longitud de los elementos celulares del xilema secundario no tuvo un valor de carga alto en el ADC; sin embargo, el grosor de la pared de las fibras de esclerénquima asociado al floema secundario, sí tuvo un valor de carga alto en dicho análisis. ^{Conde (1975)} reporta en el género Opuntia un comportamiento similar en los elementos del xilema secundario y señala que la amplia variación en la longitud de estos tipos celulares, se debe a que en el origen, las células iniciales cambiales tienen un diámetro bien definido que se conserva hasta su madurez, lo contrario ocurre con la longitud de estas células, en donde la fase de elongación es variable y se ve afectada por el ambiente (^{Bailey y Srivastava, 1962}). En el presente estudio, S. dorschianus, a diferencia del resto de las especies estudiadas, tiene madera dimorfa, en donde se presenta una fase de desarrollo de la madera que tiene los vasos embebidos en una matriz parenquimatosa, alternándose con una fase de madera con vasos embebidos en una matriz fibrosa. La condición de dimorfismo en la madera ya había sido reportada para S. monacanthus (Lem.) D.R. Hunt por ^{Mauseth y Plemons (1995)}; de acuerdo a ^{Reyes-Rivera et al. (2015)}, las maderas fibrosas proveen soporte mecánico significativo, mientras que las maderas parenquimatosas son propias de plantas con tallos procumbentes, lo que podría favorecer el hábito trepador en Selenicereus.

^{Korotkova et al. (2017)} comprobaron que el grupo S. vagans es monofilético y fuertemente soportado y está integrado por S. atropilosus, S. dorschianus, S. murrillii y S. vagans. Los 4 grupos establecidos a priori en el ADC, se mantienen independientes con centroides estadísticamente distintos entre sí; sin embargo, las similitudes anatómicas, morfológicas, así como su distribución geográfica corroboran que las especies analizadas están estrechamente relacionadas. El presente estudio anatómico, comparado con un enfoque numérico, demostró que los caracteres anatómicos cuantitativos del tallo (particularmente los de la epidermis y la hipodermis) son tan importantes como los caracteres cualitativos y dado que permiten delimitar especies dentro del grupo S. vagans, podemos decir que son taxonómicamente informativos. Estos resultados aportan más información que permite considerar a S. murrillii como una entidad taxonómica distinta de S. vagans, con lo que se complementan los estudios morfológicos y moleculares que se han llevado a cabo hasta el momento (^{Korotkova et al., 2017}). Más de 60% de los caracteres cuantitativos, además de algunos cualitativos como la ausencia de intrusiones cuticulares y una menor proporción de parénquima en empalizada en el córtex, avalan la afinidad filogenética de Selenicereus dorschianus con el grupo S. vagans.