a) Lugar de estudio y características de los animales

Los animales se ubicaron en el campo experimental “La Huerta” del Colegio de Postgraduados, Campus San Luis Potosí, Salinas de Hidalgo, San Luís Potosí, localizado al Oeste del Altiplano del mismo Estado, con coordenadas 23° 11′ N 101° 22′ O, a altura de 2,070 msnm, temperatura media anual de 18.7 °C y con precipitación pluvial de menos de 391mm (^{INEGI, 2009, 2}).

Dos semanas antes de iniciar la investigación, seis cabras adultas de raza Criolla adquiridas de diferentes rebaños de la región, con edad promedio de tres años y condición corporal de 2.5 a 3 en escala de uno a cinco, se mantuvieron en condiciones similares de manejo.

b) Distribución de los animales y trabajo experimental

Todos los animales fueron manejados bajo normas de ética y cuidado animal establecidas en el Colegio de Postgraduados. La investigación inició en el mes de noviembre del año 2010. Las cabras fueron alimentadas con dieta (2.87 Mcal EM kg MS^-1 y 11% de PC) elaborada con base en heno de alfalfa molido, mezquite, maíz rolado, sal de mar y nopal. El total de alimento ofrecido fue de 1, 500 g animal^-1, dividido en dos porciones, una por la mañana y otra por la tarde; en cada tiempo de alimentación, los animales fueron separados para ofrecer cada porción en comederos individuales, asegurándose que todo el alimento fuera consumido por el animal, el agua fue proporcionada ad libitum.

Cabras adultas de entre 35 y 40 kg de PV se dividieron al azar, en dos grupos de tres animales (n=3). El estro y la ovulación se indujeron colocando a cada cabra un dispositivo intravaginal con 0.3 g de P4 (CIDR; pfizer^®) durante 11 días. Al momento de retirar el CIDR se administró una sola dosis de 400 UI de gonadotropina coriónica equina (eCG) y 1 ml de PGF2α (Celosil^®).

Un día antes de la inducción de la ovulación, a un grupo testigo y otro grupo tratado (n=3) se les aplicó vía IM un ml de solución salina o piroxicam (1.5 mg^-1 kg de PV) por tres días con intervalos de 24 h y, 144 h después del primer día que se aplicó piroxicam, se extrajeron los ovarios. Se realizó muestreo sanguíneo desde 48 h antes de inducir la ovulación hasta la ovariectomía, las muestras fueron colectadas por venopunción de vena yugular, con utilización de un BD vacutainer^®, agujas BD vacutainer^® de 21G x 25 mm y tubos de ensayo al vacío y sin anticoagulante, la sangre se dejó en reposo a 4 ^oC durante 24 h, posteriormente, se separó el suero del coagulo colocandolo en tubos eppendorf de 1.5 ml (Bio Plas Inc) y se congeló a -20 ^oC hasta el análisis hormonal, realizado con la técnica de radioinmunianalisis (RIA) de fase sólida, Se utilizaron kits comerciales de Siemens, EE,UU; el de P4, con sensibilidad de 0.02 ng ml^-1 y coeficiente de variación intra e interensayo de 4.2% y 6% respectivamente y, el de E2, con sensibilidad de 8 pg ml^-1 y coeficiente de variación intra e interensayo de 4 y 7.8%, respectivamente.

Las ovariectomias se realizaron con una incisión de aproximadamente 2 cm a nivel de la línea alba. En ambos ovarios (derecho e izquierdo) recién colectados, se cuantificaron los folículos y CL que se encontraban en la superficie ovárica (estructuras fácilmente visibles por encontrarse en desarrollo; las cuales en atapa temprana de desarrollo pueden confundirse con folículos próximos a ovular y en etapa tardía es difícil su observación); posteriormente, los ovarios fueron fijados en paraformaldehido al 4% para preparación histológica y conteo de estructuras, utilizando un microscópio de óptica simple. Los folículos fueron clasificados de acuerdo a su diámetro como: pequeños (1 a 3 mm), medianos (˃3 mm y ≤ 6 mm) y grandes (˃ 6 mm).

c) Análisis de laboratorio

Se prepararon 16 cortes histológicos de cada ovario con grosor de 4 micrómetros (μm) teñidos con hematoxilina-eosina (^{Ross y Bojciech, 2007, 2}) y se observaron con microscopio compuesto (Axiom Optic Broadway, 14th floor, Cambridge, MA 02142, USA), se tomarón fotografías con objetivos: 5X, 10X y 20X, se contabilizaron los folículos intraováricos, CL en desarrollo y en regresión, tomando en consideración las características de luteinización mencionadas por ^{Murphy (2000, 6)}, este manejo permitió diferenciar estructuras. El conteo se realizó en fotografías tomadas con objetivo 20X, iniciando de la parte superior del corte y recorriendo toda la muestra, tomando siempre como referencia de reinicio la última estructura observada y marcando las estructuras en cuanto eran contadas (Figura 1).

Figura 1. Esquema de la forma de contar las estructuras intraováricas de cada corte histológico. 

Tanto la concentración de P4 como la de E2 fueron evaluadas en suero sanguíneo mediante RIA de fase sólida. El inmunoanálisis se realizó en el Laboratorio de Hormonas Protéicas, del Departamento de Biología de la Reproducción, en el Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición, Salvador Zubirán.

d) Modelo y Análisis estadístico

En el estudio, estructuras ováricas como número de folículos y cuerpos lúteos, tanto superficiales e intraováricos, se analizaron con estadística no paramétrica utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (^{Myles y Douglas, 1973, 68}), con P≤ 0.05. Los análisis fueron realizados usando el paquete estadístico R. (^{R Core Team, 2015}).

Los datos para evaluar secreción de P4 se analizaron con el modelo mixto lineal: Yijk=μ+τi+β1tiempoijk+β2tiempoijk2+β3tiempoijk3+cj+eijk, donde y _ijk es el valor de P4 para tratamiento i (i=1,2), cabra j (j=1,..,6), en el tiempo k (k=1,...,8, Número de mediciones en cada cabra a lo largo del tiempo), τ _i es el efecto del tratamiento i, tiempo _ijk representa el número de horas transcurridas desde el inicio del experimeto hasta el momento de realizar la determinación de y _ijk; β ₁ , β ₂ , β ₃ son coficientes de regresión; cj~N0,σc2 representa el efecto aleatorio que permite considerar el hecho de que se tienen medidas repetidas y eijk~N0,σe2 es un término aleatorio que representa el error. Para la variable E2, se utilizó un modelo similar, pero se eliminó el término cúbico. Los modelos fueron ajustados usando el paquete estadístico R (^{R Core Team, 2015}).

Número de folículos

Para el número de folículos superficiales no se presentaron diferencias (P= 0.12; Cuadro 1). Mientras que la población de folículos intraováricos, se redujo a menos de la mitad por la aplicación de piroxicam (P< 0.0001; Cuadro 1).

^◊Tx=tratamiento, EE= error estándar. Literales diferentes entre columnas muestran diferencias con P< 0.0001.

Cuadro 1. Número de folículos superficiales e intraováricos de cabras tratadas con piroxicam (inhibidor de COX-2). 

Para la población de folículos superficiales se ovservó tendencia a reducirse; no obstante, ésta no fue estadísticamente significativa; lo anterior, probablemente debido al tamaño pequeño de muestra. Los hallazgos futuros pueden subsanarse aumentando el número de repeticiones.

Figura 2. Diagrama de caja y bigotes para la distribución del número de folículos intraováricos, presentes en ovarios de cabras tratadas con piroxicam (inhibidor de COX-2). 

Este trabajo representa el primer reporte del efecto de piroxicam sobre el número de folículos intraováricos afectados por este producto, ya que la mayoría solamente reporta el efecto como AINE en el retraso o inhibición de la ovulación (^{Akil et al.,1996, 77}; ^{Bata et al., 2006, 925}; ^{Pall et al.,2001, 1328}; ^{Jesam et al., 2010, 372}). En base a la disminución de folículos observada en este estudio; se establece que el Piroxicam comprometió el número de ovulaciones, aunque ésta fue una variable que no se midió de forma directa, pero que puede predecirse por la disminución de CL; lo cual, también se documentó.

Número de cuerpos lúteos

De los CL que se estudiarón solo el número de CL intraováricos en desarrollo se redujó por aplicación del piroxicam (P=0.04; Cuadro 2).

^◊Tx=tratamiento, CL=cuerpos lúteos, EE= error estándar. Literales diferentes dentro de columnas muestran diferencias con P= 0.04.

Cuadro 2. Número de cuerpos lúteos (CL) superficiales e intraováricos (en desarrollo y regresión). 

Tanto COX-2 y prostaglandinas sintasa E2, ambas involucradas en la síntesis de prostaglandinas, se elevan en perros (^{Kowalewski et al., 2015, 1038}) y roedores (^{Rogan et al., 2008, 5861}) en etapa de formación y rescate de CL, lo que indica que COX-2 es importante para la formación y rescate del CL en éstas especies (^{Arosh et al., 2004, 5280}; ^{Kawaguchi et al., 2013, 225}); sin embargo, ésto se ha estudiado someramente en pequeños rumiantes, por lo que buscadores de información médico científica arrojan escasa información al respecto (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed; noviembre, 2015). En el caso específico de este trabajo, bloquear la sintesis de COX-2 con la administración de piroxicam disminuyó el número de CL intraováricos en desarrollo a menos de la mitad, este resultado al igual que la reducción en folículos grandes sugiere que el número de ovulaciones disminuyó.

Concentración sérica de P4

La hormona P4 se considera marcador de la función lútea. Para corroborar la alteración de la función de los CL superficiales e intraováricos provocada por la aplicación de un inhibidor de COX-2, se evaluó la concentración sérica de esta hormona, la cual fue similar tanto para el grupo testigo (2.22 ng ml^-1) como para el tratado (2.19 ng ml^-1) con piroxicam (P=0.2), por lo que se puede afirmar que el número de cuerpos lúteos superficiales en desarrollo, aún presentando la capacidad estrogénica, no influyeron en la concentración de P4, resultado similar se reportó por ^{Gonzalez de Bulnes et al. (2000, 67)} en ovejas y ^{Tolentino-Castro et al. (2015, 267)}, en cultivo in vitro de CL provenientes de cabras; quienes al estudiar la producción de progestrona de CL superficiales con cavidad, con la posibilidad de presentar menor concentración de P4 por su formación estructural incompleta, afirman que el área de tejido luteal no influye en la concentración de P4. En base a los resultados mostrados, se observa que la localización de CL en desarrollo tampoco es determinante para producir concentraciones de P4 diferentes.

Los niveles de secreción de P4 fueron diferentes respecto al tiempo (Figura 3; P=0.002), se presento un pico en la producción de ésta; en el momento de inducir la ovulación, sin embargo, el tratamiento no fue la causa de la diferencia. La producción de P4 puede relacionarse con el inicio de luteinización que sucede en algunas especies poco antes de la ovulación o aproximadamente 36 horas después del pico preovulatorio de LH (^{Costa et al., 2004, 1752}). Si se considera que las cabras recientemente se habían expuesto a un dispositivo intravaginal de liberación de P4; lo cual, también sería causal de elevación de esta hormona. Otro factor de elevación se puede atribuir a la persistencia de CL del ciclo anterior, aunque en esta investigación es poco probable, dado que se realizó aplicación de PGF2α; la cual, produce regresión de CL y con ello, disminución de P4 de CL formados en ciclos estrales anteriores.

Figura 3. Distribución de la concentración sérica de P4 en cabras tratadas con piroxicam. * Muestran diferencias en horas. TS= Tiempo de sangrado en horas, AP= Aplicación de piroxicam, IO= Inducción de la ovulación, X muestra el tiempo de realización de TS, AP e IO. 

La disminución de P4 registrada a las 24 horas, concuerda con reportes que mencionan que en algunas especies, P4 puede presentarse por corto tiempo y que a su vez, es reflejo de CL afuncionales (^{Stouffer et al., 2013, 266}). En cabras, se reporta la presencia de ciclos estrales cortos que van desde tres a siete días de duración y que se relacionan con cuerpos de vida media corta; sobre todo, al inicio de la fase reproductiva (^{Garverick et al., 1992, 122})

Concentración sérica de E2

El marcador de la función folicular por excelencia es el E2; el cual, no se afectó por la aplicación de piroxicam (P=0.2; Figura 4), aún cuando se encontró menor número de folículos intraováricos de cabras tratadas. Este resultado se considera normal, dado que en esta investigación los folículos intraováricos fueron en su mayoría los observados con ayuda del microscopio; lo cual, es indicador de que se trató de folículos pequeños con poca o nula actividad estrogénica. ^{Sousa et al. (1997, 485)}, reportaron que en borregas, la máxima producción de estrógenos se registra cuando el folículo alcanza un tamaño mayor a 5 mm de diámetro. Por otro lado ^{Fatum et al.(2006, 407)}, indican que en ratonas solo los folículos con antro y células de la granulosa con capacidad de aromatización, son capaces de producir esta hormona y, similarmente, que folículos que alcanzan 8 mm disminuyen la capacidad de producción estrogénica, proceso inducido por la elevación del pico preovulatorio de LH, que disminuye la producción de andrógenos, sustancias fundamentales para ser aromatizadas (Ericson et al., 1985; citado por ^{Walters, 2015, R194}).

Figura 4. Distribución de la concetración sérica de E2 en cabras tratadas con piroxicam. 1= Testigo, 2= Tratamiento con piroxicam, TS= Tiempo de sangrado en horas, AP= Aplicación de piroxicam, IO= Inducción de la ovulación. Las líneas representan los modelos ajustados. X muestra el tiempo de realización de TS, AP e IO. 

La aplicación de AINE como tratamiento anti-inflamatorio y para contrarestar sintomás de varias patologías, es de uso cotidiano, aunque los efectos secundarios pocas veces se consideran. Se sabe que estos productos reducen la tasa de ovulación, o bien que ésta puede ser defectuosa (^{Gaytan et al., 2006, 572}), alterando con ello la fertilidad. En animales domésticos esta baja fertilidad es motivo de desecho de hembras por considerarse poco productivas. Con los resultados de este estudio, se puede observar que la ovulación no solo es alterada en el proceso per se, también por disminución del número de folículos, principalmente la población de folículos intraováricos, grupo de folículos que abastecen la poblaciones folciulares subsecuentes.