nueva página del texto (beta)
Español (pdf)
Artículo en XML
Referencias del artículo
Traducción automática
Enviar artículo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
Introducción
Los refrescos son bebidas populares que consisten principalmente en agua carbonatada, azúcar y saborizantes, con un consumo mundial de más de 534 mil millones de litros al año (Euromonitor internacional, 2013, 2). Aun cuando las bebidas gaseosas siguen dominando el mercado global de bebidas, su cuota de mercado está disminuyendo. Esto a consecuencia del rápido crecimiento en volúmenes de consumo de las bebidas funcionales (entre las que se encuentran las bebidas isotónicas o deportivas) y el agua mineral embotellada. En 2008, las bebidas funcionales alcanzaron ventas globales de 26,9 mil millones de dólares, con una tasa de crecimiento promedio de 15 a 20% anual (Shanker et al., 2012, 23; Corbo et al., 2014, 1196).
La no conformidad de los parámetros normados para estas bebidas no alcohólicas es la principal causa su descarte en Venezuela, tales como: la falta de gas, el cumplimiento de la fecha de caducidad, las fallas en el envasado y los errores en el etiquetado (Covenin, 1995, 5). Este descarte representa un promedio de 700.000 L mensuales de residuos líquidos, con un contenido de azúcares simples que van desde 5,5 a 12% (P/V) y una elevada Demanda Química de Oxígeno o DQO (entre 70.000 y 126.000 mg O2/L) (Woodard, 2001, 120; Coombes, 2005, 101; Taylor, 2006, 53; Empresas Polar, 2014, 5; Galindo, 2014, 30). En consecuencia, es de interés emplear microorganismos capaces de usar estos desechos como fuente energética en procesos fermentativos para sintetizar nuevos compuestos de valor comercial, tales como la levadura Saccharomyces cerevisiae la cual es capaz de metabolizar azúcares simples y adicionalmente reducir los costos derivados del manejo de estos residuos, disminuyendo el impacto ambiental de los mismos (Obeta et al., 2009, 78; Nuruddin et al., 2011, 347: Otero et al., 2011, 272; Saval, 2012, 15; Vidhyalakshmi et al. 2012, 56). Es por ello que en esta investigación se evaluaron productos de desecho de la industria de bebidas no alcohólicas para ser usados como sustrato fermentable por S. cerevisiae.
Método
Microorganismos
El material biológico que se empleó en el ensayo fue una levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae, de la marca comercial Saf Instant Dorado® (Lesaffre Yeast Corporation, Milwaukee, USA).
Medio de cultivo
Se realizaron pruebas experimentales utilizando como sustrato fermentable líquido, dos bebidas no alcohólicas descartadas: una cola negra identificada como P y una bebida isotónica con sabor a naranja, designada como G (ambas bebidas descartadas, fueron suministradas por la Planta de concentrados Pepsi-Cola Venezuela, C.A., Venezuela). La bebida isotónica (G) presentó en su composición, principalmente: ácido cítrico, sales y 7% de azúcares. Mientrás que la cola negra (P) era una bebida a base de: agua carbonatada, ácido fósforico, cafeína y 12% de azúcares.
La cola negra se acondicionó para ser empleada como sustrato, retirando el CO2 de la misma, mediante la inyección de aire empleando un aireador y evitando así la interferencia de este gas en la medición de algunos parámetros como el contenido de sólidos solubles. Seguidamente, se ajustó el pH de ambos residuos hasta los valores fijados para éste estudio (4 o 4,5). Se trasvasaron 100 mL de las bebidas de descarte en matraces de 500 mL de capacidad y se esterilizaron a 121 °C durante 15 mi, empleando para ello, un autoclave Marca Napco Model 8000- DSE, Thermo Electron Corporation, USA (Matute et al., 2014, 50).
Proceso de fermentación
Una vez los tratamientos alcanzaron la temperatura ambiente (30 °C), se inocularon con 10 g/L de Saccharomyces cerevisiae y se incubaron a 30 °C durante 12 horas a dos velocidades: 100 o 130 rpm para favorecer la fermentación aerobia, empleando para ello un agitador Precision Scientific Modelo 66722 Dubnoff Metabolic Incubator, USA (Gualtieri y Sánchez, 2003, 19; Gualtieri et al., 2007, 5). Se efectuó la toma de muestras durante las 0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 h de incubación.
Tratamiento de las muestras
Las muestras fueron filtradas utilizando una bomba a vacío (Marca Thomas Scientific, Modelo DOA-9104E-AA, USA), conectada a filtro y membrana filtrante Millipore de 0,2 μm de peso conocido, en el que fue retenida la biomasa de S. cerevisiae. Mientras que en el kitasato se recogió el líquido fermentado clarificado (Bar-Shimon et al., 2014, 141).
Determinación de biomasa
Los sólidos retenidos en el filtro se sometieron a secado a 100 °C, en una estufa Precision Scientific modelo 25-EG, USA, hasta alcanzar peso constante, determinando la biomasa expresada en gramos (Gualtieri y Sánchez, 2003, 19; Gualtieri et al., 2007, 5).
Determinación de sólidos solubles, alcohol, densidad y grado de fermentación
La determinación de la concentración de sólidos solubles, el contenido de alcohol, la densidad y el grado de fermentación de los medios de cultivo, se llevó a cabo a través del análisis del líquido clarificado obtenido de cada filtración según los tiempos de incubación señalados. Para conocer la concentración de sólidos solubles se empleó un Hidrómetro Brix, marca Brannan, Inglaterra (Covenin, 1995,1). Los 50 mL del líquido clarificado a tubos de ensayo que se colocaron en el disco rotatorio de un densímetro Alcolyzer Plus Anton Parr, modelo Beer (USA), el cual giro durante 3 minutos a 20 °C de temperatura, se determinó el contenido de alcohol en V/V y P/V en las muestras (Okon y Nwabueze, 2009, 218), la densidad en g/cm3 (Páez et al., 2009, 48) y el grado de fermentación (expresado en porcentaje) en las muestras analizadas (Shengli et al., 2009, 372).
Determinación de color
El color de las bebidas no alcohólicas descartadas tanto antes como luego de la fermentación fue medido por espectrofotometría. Se empleó una longitud de onda de 425 nm para medir el color amarillo de G, mientras que para P se efectuaron las lecturas a 610 nm por el empleo de color caramelo (Kamuf et al., 2003, 65; Empresas Polar, 2011, 17; Sha et al., 2014, 2).
Determinación de la demanda química de oxigeno (DQO)
La valoración de la demanda química de oxígeno se realizó empleando el método de digestión por reactor usando viales de dicromato (sin mercurio). Se agregaron 2 mL del líquido clarificado a viales de digestión de DQO 20-1500 mgO2/L, se colocaron los viales en el equipo Themoreactor Merck TR 300 (Alemania) por 2 h a una temperatura de 150 °C, transcurrido el tiempo se dejó enfriar hasta 20 °C se midió la concentración de DQO en mg de O2/L (ppm O2) por colorimetría a través de un colorímetro (marca Hach, modelo DR/890, USA) (Gargouri et al., 2013, 33).
Determinación de la velocidad de crecimiento
Se empleó el método de turbidimetría, el cual se basa en la medición de la cantidad de luz dispersa a través del cultivo bacteriano, haciendo diluciones del caldo de fermentación en agua destilada utilizando un factor de 1:9, midiendo la absorbancia de la dilución en un espectrofotómetro (marca Spectronic Instruments, modelo Genesys 4001/4, USA) a una longitud de onda de 640 nm, construyendo la curva de calibración con los valores obtenidos a través de las lecturas (Muñoz y Catrilaf, 2013, 7). El crecimiento microbiano fue estudiado siguiendo el modelo Monod para un sistema discontinuo (Jakyme et al., 2001, 55).
El valor velocidad específica máxima de crecimiento (μ max ) se obtuvo a partir de la pendiente máxima de la curva de crecimiento del microorganismo, expresándose en h-1 (Ramírez y Molina, 2005; Rivera et al., 2005). Así mismo, se determinó el rendimiento (Y) a través de la línea de tendencia empleando la ecuación Y=mX+b, expresando la razón entre la producción de biomasa y el agotamiento del sustrato o azucares totales (Ramírez y Molina, 2005; Muñoz y Catrilaf, 2013).
Análisis estadístico
Se empleó un diseño experimental completamente aleatorizado, con arreglo factorial 23 con dos réplicas, cuyo análisis muestra la interacción entre los factores empleados (Camacho-Ruiz et al., 2003, 533; Gutiérrez y de la Vara, 2008, 183) y en donde se estudiaron los siguientes factores y niveles: agitación (100 y 130 rpm), pH (4 y 4,5) y bebida descartada (bebida isotónica y cola negra). Con los datos recolectados se efectuó un análisis de varianza (ANDEVA, α=0,05) con la finalidad de determinar si las interacciones eran estadísticamente significativas o no y se aplicó la prueba de comparación de medias de las mínimas diferencias significativas (LSD) (Gutiérrez y de la Vara, 2008, 74). Finalmente, se empleó la prueba de Shapiro-Wilks para verificar la distribución normal de la data empleada y comprobar la validez de ajuste del coeficiente de determinación, R2 (Gutiérrez y de la Vara, 2008, 85, 178). La información recopilada fue procesada con los programas informáticos IBM© SPSS® Statistics versión 20, USA (2011).
Resultados y Discusión
Estudio de la cinética del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en los productos de desecho de la industria de bebidas no alcohólicas usados como sustrato fermentable.
En la Figura 1, se puede apreciar el comportamiento de S. cerevisiae (SC) en el trascurso de la fermentación. La mayor producción de biomasa bajo las condiciones de estudio, se obtuvo cuando se ajustó el pH inicial a 4,5 y usando 130 rpm como velocidad de agitación para ambos sustratos. Bajo estas condiciones, SC alcanzó 15,4 g de biomasa/L en 8 h de fermentación empleando P como sustrato (P<0,05) y al degradar el medio líquido G, generó 12,8 g de biomasa/L en 6 h de incubación. Asimismo, se verificó que después de que en cada tratamiento se alcanzó la máxima producción de biomasa, está disminuyó. Al respecto, Maragatham y Panneerselvam (2011, 16) y Amata (2013, 166) atribuyen este comportamiento a la reducción de nutrientes disponibles en el sustrato una vez alcanzado el máximo crecimiento celular (Figura 2).
Figura 1 Producción de biomasa (g/L) llevada a cabo por Saccharomyces cerevisiae en los diferentes tratamientos estudiados
Figura 2 Cinética del consumo de los sólidos solubles (°Brix) durante la fermentación llevada a cabo por Saccharomyces cerevisiae en los tratamientos estudiados
En este ensayo, la mayor producción de biomasa se obtuvo cuando se empleó el refresco de cola negra descartado (P) como sustrato, el cual presentó un contenido inicial de azúcar del 12%, coincidiendo con lo indicado por Montañez et al. (2011, 7), Quienes señalan que a causa de su naturaleza poco osmotolerante, SC lograr un mayor crecimiento cuando el sustrato presenta concentraciones de azucares menores al 15%. En tanto que en las fermentaciones llevadas a cabo usando G, se produjo el menor crecimiento celular (Figura 1), esto puede atribuirse a la menor concentración inicial de azúcares en G (7%), ya que se ha reportado que una concentración de azúcares iniciales entre 10 y 15% favorece la productividad de estos microorganismos (Arifa et al., 2010, 73; Dhanasekeran et al., 2011, 28).
La disminución en la concentración del sustrato disponible (azucares) observado en la Figura 2 es confirmado por los resultados registrados en la Figura 3, en la que se muestra que SC consumió el 90% de los azúcares presentes en el sustrato P (refresco de cola negra descartado). Mientras que en los tratamientos usando G como medio de cultivo, el grado de fermentación fue del 80%. Estos resultados, son similares a los reportados por Ferreyra et al. (2009, 151), Ton et al. (2010, 745), Maragatham y Panneerselvam (2011, 16), y Amata (2013, 166), quienes apuntan que la disminución de los sólidos solubles en el sustrato fermentado (Figuras 2 y 3), es consecuencia del consumo de los mismos durante el proceso de oxidación respiratoria llevado a cabo por SC para la obtención de biomasa (Figura 1), así como para la conversión del alcohol (Figura 4) ocasionando la disminución del pH en el medio de cultivo (Cuadro 1).
Figura 3 Cinética del Grado de fermentación (%) llevado a cabo por Saccharomyces cerevisiae en los tratamientos estudiados
Figura 4 Producción de alcohol (P/V) llevada a cabo por Saccharomyces cerevisiae en los tratamientos estudiados
Cuadro 1 Variación del pH durante la fermentación llevada a cabo por Saccharomyces cerevisiae en los tratamientos estudiados.
| pH 4,0 | pH 4,5 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Tiempo (h) | 100 RPM | 130 RPM | 100 RPM | 130 RPM | ||||
| P | G | P | G | P | G | P | G | |
| 0 | 4,00±0E-7 | 4,00±0E-7 | 4,00±0,007 | 4,00±0E-7 | 4,50±0E-7 | 4,50±0E-7 | 4,50±0E-7 | 4,50±0E-7 |
| 2 | 3,43±0,05 | 3,87±0,05 | 3,44±0,084 | 3,82±0,007 | 3,39±0,001 | 4,04±0,06 | 3,46±0,042 | 4,16±0,064 |
| 4 | 3,30±0,028 | 3,77±0,07 | 3,38±0,063 | 3,78±0E-7 | 3,35±0,021 | 4,07±0,014 | 3,41±0,007 | 3,97±0,007 |
| 6 | 3,28±0,030 | 3,71±0,021 | 3,27±0,028 | 3,76±0,014 | 3,27±0,028 | 3,94±0,007 | 3,34±0,064 | 4,00±0,007 |
| 8 | 3,27±0,007 | 3,7±0E-7 | 3,29±0,014 | 3,75±0,007 | 3,25±0,014 | 3,95±0E-7 | 3,15±0,006 | 3,86±0,006 |
| 10 | 3,14±0,013 | 3,60±0,028 | 3,19±0,042 | 3,65±0,014 | 3,26±0,042 | 3,91±0,015 | 3,16±0E-7 | 3,88±0,028 |
| 12 | 3,05±0,013 | 3,58±0,05 | 3,17±0,029 | 3,61±0,007 | 3,19±0,030 | 3,89±0,015 | 3,11±0,007 | 3,84±0,010 |
Con respecto a la producción de etanol llevada a cabo por SC durante el proceso fermentativo estudiado (Figura 4), se obtuvo la mayor concentración de alcohol etílico en el residuo P, usando la mayor velocidad de agitación (130 rpm) y un pH inicial de 4,5 (6,3% P/V). Este resultado se asemeja a lo señalado por Arifa et al. (2010, 73) y Serna et al. (2013, 119), quienes reportaron hasta 6,7% P/V de etanol. Por el contrario, la menor concentración de alcohol medida en este ensayo fue de 3,3% P/V, valor obtenido en el tratamiento que empleó G como sustrato a un pH inicial de 4,0 y con 100 rpm de agitación. Según Arifa et al. (2010, 73), este resultado puede atribuirse a la menor concentración inicial de azúcar en el sustrato a fermentar.
Asimismo, se observó que durante el proceso de crecimiento de SC con la consecuente producción de etanol, los valores de pH disminuyeron (Cuadro 1) en el sustrato fermentado, probablemente a consecuencia del consumo de los azúcares contenidos en el medio (Arifa et al., 2010, 73; Blanco et al., 2012, S235).
Con base en los resultados obtenidos a través de las cinéticas evaluadas para lograr la descripción cuantitativa de los efectos de las diferentes variables propuestas sobre el crecimiento de SC, se aplicó un ANDEVA (Cuadro 2). El estudio estadístico demostró que el sustrato empleado en las fermentaciones y la velocidad de agitación influyeron de forma altamente significativa (p<0,01) sobre el proceso de obtención de la biomasa microbiana.
Cuadro 2 Análisis de varianza para la producción de biomasa
| Fuente | Suma de cuadrados | gl | Cuadrados medios | F | P |
|---|---|---|---|---|---|
| Tipo de bebida | 0,126 | 1 | 0,126 | 9,661 | 0,002 |
| pH | 0,120 | 1 | 0,120 | 0,946 | 0,333 |
| Agitación | 0,099 | 1 | 0,099 | 7,640 | 0,007 |
| Tipo de bebida*pH | 6,542.10-5 | 1 | 6,54.10-5 | 0,005 | 0,944 |
| Tipo de bebida*Agitación | 0,001 | 1 | 0,001 | 0,049 | 0,826 |
| pH*Agitación | 9,80.10-5 | 1 | 9,80.10-5 | 0,008 | 0,931 |
| Tipo de bebida*pH*Agitación | 0,001 | 1 | 0,001 | 0,101 | 0,751 |
| Error | 1,353 | 104 | 0,13 | ||
| Total | 145,256 | 112 |
De acuerdo con Arifa et al. (2010, 76), la condición aeróbica es necesaria para lograr el crecimiento de la levadura a través de la biosíntesis de grasas y lípidos poliinsaturados necesarios en la mitocondria y la membrana plasmática. Por el contrario, la deficiencia de oxígeno restringe el crecimiento, reduce la viabilidad de la levadura y ocasiona una fermentación lenta e incompleta. De igual forma, estos autores señalan que la concentración inicial de azucares en el sustrato es un factor relevante en la producción de proteína unicelular de SC. Por otra parte, las pruebas aplicadas mostraron que en esta experiencia, el pH inicial no afectó significativamente el proceso fermentativo (p > 0,05), coincidiendo con los resultados obtenidos por Ramírez y Molina (2005, 96).
En síntesis, se puede afirmar que bajo las condiciones en las que fue llevado a cabo este ensayo la producción de biomasa de S. cerevisiae fue favorecida por el contenido de azúcar inicial del sustrato fermentable y la circulación de aire suministrada a través de la agitación.
Adicionalmente, es importante destacar que durante el proceso fermentativo, se registró la clarificación de las bebidas no alcohólicas descartadas empleadas como sustratos, con un 80% de remoción en el color (Figura 5), demostrándose la capacidad de S. cerevisiae como biosorbente. Es decir, que S. cerevisiae capta compuestos a través de mecanismos fisicoquímicos (transferencia de masa), en donde se involucran una fase sólida (adsorbente) y una fase líquida (disolvente) que contiene el compuesto que será adsorbido (adsorbato) (Barreda-Reyes et al., 2015, 217). Esto coincide con el estudio efectuado por Mahmoud (2014, 10), quien reseñó la capacidad de S. cerevisiae para la eliminación de colorantes como el azul de remazol bajo condiciones de pH, temperatura y agitación controladas; y el trabajo de Barreda-Reyes et al. (2015, 225), quienes reportan que S. cerevisiae la es capaz de biosorber el colorante azoico naranja ácido 10 a pH 2.
Figura 5 Remoción de color por Saccharomyces cerevisiae en los tratamientos en los que se empleó cola negra de descarte como sustrato fermentable
Modelización de la cinética del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en proceso discontinuo
Fijadas las condiciones óptimas que favorecieron la producción de biomasa de SC en los sustratos estudiados, se determinaron los parámetros cinéticos de los procesos en discontínuo (Cuadro 3). Los ensayos demostraron que el tiempo óptimo de generación de biomasa fue de 8 h en P y de 6 h con G como sustrato, con un crecimiento aproximado de la biomasa de 60 y 30% más, respectivamente, durante los tiempos de generación señalados. En cuanto a las velocidades específicas determinadas en los procesos biotecnológicos realizados para cada bebida descartada en condición óptima de crecimiento, éstas se aproximaron a la de 0,38 h-1 reportada por Ramírez y Molina (2005, 100), para el crecimiento de S. cerevisiae en agua de coco en un proceso en discontinuo. Mientras que los valores obtenidos para el rendimiento (Y) de SC en los ensayos efectuados, estos fueron menores al 1,69 g de levadura/g de azúcar obtenido por Ramírez y Molina (2005, 100).
Cuadro 3 Parámetros cinéticos de crecimiento microbiano de Saccharomyces cerevisiae en bebidas no alcohólicas descartadas.
| Parámetro. | P | G |
|---|---|---|
| Velocidad especifica de crecimiento, μ (h-1) | 0,41 | 0,39 |
| Velocidad específica máxima de crecimiento, μ max (h-1) | 0,45 | 0,45 |
| Rendimiento, Y (g levadura/ g azúcar) | 1,38 | 1,37 |
Asimismo, se verificó la correlación entre la producción de biomasa y el consumo de azucares del medio, al respecto se obtuvo un coeficiente de determinación R2 de 0,87 en ambos sustratos (Figura 6), lo cual indica que la producción de biomasa es explicada en un 87% por la concentración azúcares disponibles en el sustrato para consumo durante la fase de crecimiento exponencial de SC (Díaz, 2009, 196). Asimismo, la Prueba de Shapiro-Wilk demostró que los datos presentan una distribución normal (p>0,05), por lo que se considera que el 87% de los valores de biomasa pueden ser predichos o explicados a través de la recta de regresión ajustada (Bernal, 2013, 21).
Finalmente, los análisis efectuados para medir la reducción de los valores de DQO en las bebidas empleadas como sustrato fermentable, se llevaron a cabo en los tratamientos con mayor producción de biomasa para cada bebida descartada, registrándose una disminución de aproximadamente 10% del DQO en los líquidos fermentados al comparárseles con los DQO de las bebidas no alcohólicas antes de la fermentación en un máximo de 8 h incubación (Cuadro 4). La reducción en el DQO en procesos con SC fue reportada por: Menegatti et al. (2013, 161), quienes después de 24 h de fermentación, obtuvieron un DQO 27,65% menor al DQO inicial; así como por Singh et al. (2011, 213), en cuyo estudio se observó 40% de remoción del DQO al quinto día del cultivo.
Conclusiones
Bajo las condiciones en las que fue llevado a cabo este trabajo, se concluye que pueden emplearse las bebidas no alcohólicas descartadas en procesos fermentativos para la obtención de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, (15,4 g/L de biomasa a las 8 h de incubación en el sustrato P y 12,8 g/L de biomasa en el sustrato G a las 6 h de fermentación) y etanol. Finalmente, se determinó que la fermentación de estos residuos permitió la remoción del color de las bebidas descartadas empleadas y reducir en 10% el DQO de las mismas, lo que conlleva a un beneficio para el ambiente.
