Introducción

Para optimizar la producción agrícola en el desarrollo y crecimiento de plantas, se utilizan los invernaderos los cuales establecen condiciones óptimas de radiación, temperatura, humedad y dióxido de carbono (^{Castañeda et al., 2007, 317}). Para cumplir con este fin, se utilizan películas plásticas, sustratos y sistemas de automatización climática (^{Matallana y Montero, 2001, 209}). Por la adaptación de tecnologías en los invernaderos, éstos se clasifican en niveles de acuerdo al uso de tecnología en: bajo, medio y alto nivel (^{Pieter de Rijk 2008, 1}; ^{García et al., 2011, 193}).

Las tecnologías implementadas, influyen principalmente en las condiciones ambientales generadas en el interior del invernadero, reflejadas en el aumento de la producción así como en el crecimiento y desarrollo de organismos tanto benéficos como perjudiciales. Éstas, se manifiestan como plagas y enfermedades, cuya presencia implica mayor riesgo económico por tratarse de un sistema intenso de producción. Por ello, el productor recurre de manera continua al uso de plaguicidas para eliminar dichos riesgos (^{Muiño et al., 2007, 1}; ^{Sonneveld y Voogt 2009, 1}; ^{Ortega et al. 2014, 3}; ^{Reinoso, 2015, 147}). La aplicación de agroquímicos origina la exposición de los jornaleros, siendo ésta un problema importante de contaminación al ambiente y eminente riesgo para la salud de los trabajadores (^{Bortoli et al., 2009, 1}; ^{Muñoz, 2011, 95}).

Los jornaleros que laboran en invernaderos, están expuestos ocupacionalmente a los plaguicidas que se aplican a través del contacto y a sus vapores aspirando el aire contaminado. Por las condiciones sociales y culturales de los jornaleros, desconocen la actividad tóxica de plaguicidas minimizando el riesgo para su salud (^{Tinoco y Halperin, 2001, 93}; ^{Haro et al., 2002, 19}; ^{Ortega et al., 2014, 3}). Aunado a que es frecuente que no respetan o no conocen las instrucciones del uso y manejo de los agroquímicos, aumentando así la probabilidad de afectación para la salud (^{Acaccia et al., 2003, 1}; ^{Sammons et al., 2005, 1}).

Anteriormente se han desarrollaron diversos estudios de biomonitoreo en grupos humanos expuestos a plaguicidas en invernaderos utilizando una variedad de biomarcadores como: aberraciones cromosómicas, estudio de micronúcleos, intercambio de cromátidas hermanas y el ensayo cometa. Estas investigaciones encontraron una relación positiva (^{Falck et al., 1999, 225}; ^{Gómez et al., 2000, 17}; ^{Bolognesi et al., 2002, 391}; ^{Castillo et al., 2006, 1}; ^{Costa et al., 2006, 343}; ^{Peralta et al., 2011, 7}) así como una relación negativa (^{Lucero et al., 2000, 255}; ^{Pastor et al., 2001,539}; ^{Bolognesi et al., 2003, 251}; ^{Piperakis et al., 2003, 104}; ^{Bolognesi et al., 2004, 109}; ^{Piperakis et al., 2006, 355}; ^{Lamadrid Boada et al., 2011, 235}), con la intensidad de la expresión del biomarcador. Las discrepancias en los resultados pueden ser originadas por las por características sociodemografias y biográficas asi como por las condiciones ambientales, presentes en el interior del invernadero, las cuales se asocian con el implemento de tecnologías aplicadas que modifican las condiciones de exposición y el comportamiento de los plaguicidas en el interior del invernadero. El comportamiento de los plaguicidas rociados en el sistema cerrado del invernadero, es muy diferente comparando con el sistema de cultivo convencional al aire libre donde las condiciones ambientales promueven la degradación y/o dispersión de los mismos (^{Wu et al., 2013, 843}; ^{Bojacá et al., 2013, 403}; ^{Sonneveld y Voogt, 2009, 1}). La constante exposición de los jornaleros en invernaderos por la inhalación, absorción dérmica o ingestión oral (^{Benítez et al., 2010, 97}) en espacios cerrados favorece el proceso de absorción de sustancias tóxicas, lo que se refleja en el daño citogenético (^{Costa et al., 2006, 343}; ^{Peralta et al., 2011, 7}).

Para considerar los posibles riesgos en la salud de los trabajadores expuestos a plaguicidas en invernaderos, es esencial contar con biomarcadores confiables y mínimamente invasivos. En este sentido, el ensayo de micronúcleos (MN) de células de exfoliación bucal, es reconocido como una valiosa herramienta para determinar la presencia de micronúcleos los cuales son fragmentos o cromosomas completos que quedan fuera del núcleo durante la mitosis asi como otras anormalidades nucleares como son las: células binucleadas, células picnóticas, células con brotes nucleares, células cariolíticas, células con condensación de cromatina y células cariorréxicas. Estas anormalidades, se relacionan con la citotoxicidad presente en el organismo y son una evidencia de daño de origen clastogénico. Encuentran su utilidad en estudios epidemiológicos de biología molecular, para investigar el estilo de vida, el impacto de la nutrición, la exposición a sustancias químicas y ambientales, exposición a genotoxinas del ADN (^{Holland et al. 2008, 93}; ^{Thomas et al., 2009, 825}; ^{Martínez et al., 2015, 397}).

El objetivo de este trabajo fue determinar el daño genotóxico visto en muestras de células epiteliales de exfoliación bucal a través del ensayo de micronúcleos, así como evaluar el riesgo para la salud en personas expuestas a los agroquímicos utilizados en invernaderos de alta y baja tecnología en Atlixco, Puebla, México.

Método

El monitoreo se realizó en el municipio de Atlixco, localizado en el centro Oeste del estado de Puebla, altitud promedio de 1840 msnm, 18 49 30 y 18 58 30 LN y 98 18 24 y 98 33 36 LO. El criterio para seleccionar los invernaderos, se basó en el inventario del estado de Puebla (SAGARPA, 2008, 1). Los invernaderos seleccionados representaban una superficie sembrada de 5.000 m² y 7.000 m² para la producción de tomate (Licopersicon esculentum Mil.) utilizando baja y alta tecnología respectivamente, clasificados de acuerdo a ^{García et al. (2010, 509)}. Para el estudio, se seleccionaron 40 jornaleros que han laborado entre 3 y 4 años en los mismos, fueron informados sobre el objetivo del estudio y aceptaron participar voluntariamente mediante la firma de un consentimiento informado. A los participantes, se les aplicó un cuestionario de manera individual sobre sus condiciones laborales, socioculturales y biograficas. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Popular Autónoma del Estado de Puebla.

A los participantes, se les solicitó enjuagar la boca con agua, posteriormente mediante un raspado con una espátula estéril, se obtuvieron células epiteliales de descamación de la mucosa bucal. Las muestras se colocaron en laminillas previamente codificadas para evitar el sesgo durante el conteo y se dejaron secar al aire libre, se fijaron con metanol-ácido acético (3:1), para su posterior tinción mediante la reacción de Feulgen descrita por ^{Stich y Rosin (1984, 241)} y ^{Stich (1987, 1)}. Las anormalidades nucleares, se evaluaron de acuerdo con el procedimiento de ^{Stich y Rosin (1984, 241)} y ^{Martínez et al. (2009, 1155)} observando en el microscopio de campo claro de 1000 células por participante con núcleos bien definidos en cada muestra, con el fin de determinar la frecuencia de micronúcleos (MN) y otras anormalidades nucleares como: picnosis, cromatina condensada, brotes nucleares, cariolisis, y células binucleadas. Las células degeneradas no se contaron para el estudio. El conteo y la clasificación se realizó de acuerdo a ^{Tolbert et al. (1992, 840)} y ^{Thomas et al. (2009, 825)}, para determinar la frecuencia de MN y otras anormalidades nucleares. Para evitar el sesgo en el conteo de las laminillas, éste se realizó por dos personas entrenadas para este fin. Los criterios de clasificación, se realizaron de acuerdo a la forma típica y el tamaño de la célula con un núcleo celular y citoplasma claramente definidos (^{Reali et al., 1987, 145}). Las identificaciones de anormalidades nucleares, se basaron en la morfología y localización en la célula.

En los invernaderos participantes, se monitoreo durante 90 días la humedad relativa, la temperatura y radiación mediante un datalogger CEM DT-171® y un luxómetro Hanna HI97500®.

Los resultados obtenidos, se analizaron con el paquete estadístico SPSS (Statical Package for the Social Sciences Versión 19.0) para medir las variables cuantitativas. Se utilizaron medidas de tendencia central, para comparar la frecuencia de micronúcleos y otras anormalidades entre el grupo no expuesto con los jornaleros expuestos en invernaderos de alta y baja tecnología. Se aplicó la prueba paramétrica t-Student para los grupos independientes. Además, se calculó la relación de variable por laborar en invernadero con tecnología y sin tecnología en la cantidad de micronúcleos, por medio de una medida del tamaño del efecto en razón de probabilidades (OR). Las variables elucidadas por el cuestionario, que podrían influir en la magnitud de anormalidades nucleares, se sometieron a un análisis de correlación para determinar una relación explicativa o de predicción.

Resultados

En el estudio participaron 40 jornaleros que laboraron en los invernaderos de Atlixco, Puebla (19 mujeres y 21 hombres, con una edad promedio de 28.9 y 29.8 años respectivamente) expuestos ocupacionalmente a plaguicidas en el cultivo de tomate. El grupo control de 40 participantes (20 mujeres y 20 hombres con edad promedio de 28.1 y 30.2 años respectivamente), no expuestos a plaguicidas, dedicados a la administración y comercio. De los jornaleros expuestos a plaguicidas, 20 laboraron en invernaderos de baja tecnología, tipo para clima templado con ventana cenital, con nulos controles climáticos, sistema de producción en el suelo con acolchado plástico y sistema de riego por goteo. En el interior del invernadero de baja tecnología, se registraron las temperaturas de 22.3°C, 47% de humedad relativa (HR) y 750 watt/m² promedio. Los 20 jornaleros que laboraron en invernaderos de alta tecnología, fueron de tipo gótico, el cual permite mayor volumen de aire e iluminación interior, con sistema de producción hidropónico en sustrato perlita, con el riego por goteo programado, control automatizado de temperatura, humedad relativa (HR) e inyección de C0₂. Las actividades agronómicas, se apegaron a los protocolos de manejo agroecológico e integrado de plagas. Las condiciones promedio de temperatura fueron 19.9°C, 55.9% (HR) y 640 watt/m².

Los jornaleros participantes realizaron actividades propias del sistema productivo de tomate (Tabla 1) y declararon estar expuestos a distintos agroquímicos Tablas 2 y 3. Todos los jornaleros de invernaderos de alta tecnología fueron capacitados para el manejo de los agroquímicos, 12/20 asperjaron plaguicidas, productos fitosanitarios y fertilizantes, sin embargo, todos los jornaleros participantes de baja tecnología no supieron distinguir entre los tipos de agroquímicos y su acción tóxica ya que no fueron capacitados para ello (Tabla 2).

La estructura de los invernaderos y la tecnología empleada generan diferentes condiciones ambientales, por lo que se desarrollan distintas plagas y enfermedades. Para su control, se emplea una variedad de plaguicidas Tablas 2 y 3. En su aplicación, los jornaleros de invernaderos de alta tecnología utilizan el equipo de protección, mientras tanto todos los jornaleros de invernaderos de baja tecnología aplican los agroquímicos sin equipo de protección.

Los invernaderos de baja tecnología indicaron como principal plaga la presencia de Bemisia tabaci que impacta disminuyendo el rendimiento para eliminarla se utiliza principalmente imidacloprid en ocho diferentes formas comerciales. Por su parte, los jornaleros de alta tecnología mencionaron la presencia de Pseudomona currugata, el cual no representó una amenaza para el cultivo. No obstante, al presentarse niveles umbrales que pudieran poner en riesgo el cultivo, se utilizaron plaguicidas, pero previo su uso, se aplicaron trampas monocromáticas, extractos botánicos, repelentes e inductores de resistencia enlistados en la Tabla 3.

Discusión

Por las discrepancias entre los tipos de invernaderos, el uso de tecnología, manejo de distintos agroquímicos y tipo de cultivo, se presentan en ellos diferentes plagas que obligan el uso de plaguicidas para el manejo de la producción. Como principales plaguicidas utilizados en los invernaderos para la protección del cultivo, ^{Varona et al. (2006, 4000)}, ^{Ortega et al. (2014, 3)} reportaron mayor uso de hidróxido cúprico, ^{Salcedo y Melo, (2005, 168)}, ^{Uribe et al. (2012, 96)}, clorpirifos y metamidofos, ^{González et al. (2010, 221)} reportaron cipermetrina y carbofuran, ^{Ruiz et al. (2011, 129)} mencionaron endosulfan y amitraz, mientras que ^{Catarino et al. (2015, 1)}, ^{De Evert et al. (2015, 138)} los extractos vegetales. El uso de los herbicidas fue nulo coincidiendo con ^{Abell et al. (2000, 131)} quienes descartan el uso de herbicidas en los invernaderos.

El uso de extractos vegetales en los invernaderos de alta tecnología fue mayor al de plaguicidas. ^{Rodríguez, (2007, 200)} considera éstos como plaguiestáticos debido a que su modo de acción no consiste en matar la plaga, sino a mantener las poblaciones de plagas por debajo del umbral económico y al aplicarlos de manera continua, se logra el efecto deseado como compuestos bioactivos.

El invernadero, al ser un espacio cerrado, con el uso intensivo de plaguicidas, ocasiona la exposición elevada y constante a los vapores y residuos de agroquímicos aplicados (^{Varona et al., 2006, 400}; ^{Silva et al., 2015, 373}). ^{Bogliani et al. (2005,1)} mencionan que la falta de capacitación y conocimiento técnico de los jornaleros en el manejo de plaguicidas disminuye la efectividad de los mismos, impactando negativamente a la economía de la producción y contaminando innecesariamente el ambiente laboral.

^{Sammons et al. (2005, 1)} indicaron, que el grado de exposición está condicionado por la variabilidad del tiempo laboral, la superficie y tipo de invernadero. Este último influye en la ventilación, mientras más alta es la ventilación, se reduce la concentración de plaguicidas volatilizados, se modifican las propiedades fisicoquímicas de los agroquímicos y las condiciones ambientales al interior (^{Bedos et al., 2002, 21}; ^{Guth et al., 2004, 871}; ^{Ruiz et al., 2015, 187}) disminuyendo así el riesgo para los trabajadores (^{Doan et al., 2015, 670}).

Se ha documentado que el cambio en las propiedades físicas y ópticas de las películas plásticas que cubren los invernaderos puede influir en la composición espectral lumínica transmitida. Este cambio impacta en la temperatura y humedad modificando el desarrollo de la planta, lo cual puede incrementar el rendimiento y la calidad de la producción agrícola, así como también puede conducir al desarrollo masivo de plagas (^{Li et al., 2000}, ^{García et al., 2015, 215}).

El uso de la protección personal por parte de los trabajadores participantes en los invernaderos no tecnificados fue incompleta, lo que aumentó su exposición. ^{Gil, et al. (2003, 27)} señalan que, a pesar de que no todos los jornaleros asperjaron plaguicidas, pero todos ellos laboran dentro del invernadero donde inhalan sus vapores y tienen contacto con plantas y frutos de forma cutánea, absorbiendo los residuos de plaguicidas durante la jornada laboral (^{Jurewicz et al. 2009, 261}).

Los resultados de nuestro estudio con los jornaleros agrícolas de invernaderos en Atlixco, Puebla, marcan un incremento significativo en frecuencias de células con anormalidades nucleares comparando con las de los controles. El incremento de èstas es el resultado de la inhalación continua de los vapores de plaguicidas rociados en invernaderos. Los estudios referidos de ^{Martínez et al. (2009, 397)}, ^{Bortoli et al. (2009, 1)}, ^{Carbajal, (2010, 1)}, ^{Larrea et al. (2010, 31)}, ^{Kvitko et al. (2012, 1060)}, ^{Benedetti et al. (2013, 28)}, muestran solo un moderado incremento de células con anormalidades nucleares, mientras que los resultados de nuestro estudio fueron pronunciados con significancia estadística mayor y relacionándose con la condiciones laborales, propias de un invernadero.

Micronúcleos (MN), es el biomarcador de genotoxicidad más frecuentemente empleado en mamíferos, y en la actualidad se utiliza para la evaluación de exposiciones ocupacionales o habitacionales a mutágenos (^{Vaglenov et al., 2001, 295}; ^{Norppa y Falck, 2003, 221}), se caracteriza por ser una técnica no invasiva, sensible, de bajo costo y ha sido validada a nivel mundial. Los MN, son fragmentos cromosómicos que se forman durante la mitosis en la división celular y su presencia refleja daño cromosómico (^{Márquez et al., 2005, 1}).

También diversos cambios nucleares degenerativos han sido sugeridos como marcadores de genotoxicidad y apoptosis tal es el caso de otras anormalidades nucleares , como picnosis, condensación de cromatina y cariorrexis, que están relacionados con citotoxicidad (necrosis y queratinización), mientras que la cariólisis está asociada con toxicidad celular (^{Jen et al., 2002}).

El análisis de frecuencias de micronùcleos y otras anormalidades nucleares considerando el factor de uso de tecnología aplicada en los invernaderos y el grado de educación de los jornaleros para laborar en condiciones insalubres y manejar el agroquímico con mayor precaución, indica aumentos significativos de èstas comparando con el grupo control. El aumento de frecuencias de micronùcleos y otras anormalidades nucleares en la mucosa normal, observado en las lesiones precancerosas y en el carcinoma, sugirió un vínculo de éste biomarcador con la progresión neoplásica causada por múltiples factores que incluyen la exposición a los vapores de plaguicidas inhalados durante la jornada laboral (^{Casartelli et al., 2000, 486}). La presencia de micronúcleos en células de exfoliación bucal, es un evento relativamente raro, cuya frecuencia es de una célula con micronúcleos por cada 1000 células de descamación con una variabilidad individual específica (^{Ceppi et al., 2010, 11}). Se han reportado las frecuencias desde 0.5 a 2.5 MN/1000 células (^{Kashyap et al., 2012, 184}). En nuestro estudio, el valor promedio del grupo control no expuesto a los plaguicidas fue de 1.7 MN/1000 células, valor que se encuentra dentro de los reportados. Para cuantificar el riesgo para la salud de los jornaleros, relacionado con las frecuencias de micronúcleos, se calculó la razón de probabilidades (OR) de micronúcleos en trabajadores de invernaderos comparados con el grupo control. Los valores de OR fueron muy altos, para los jornaleros de los invernaderos con tecnología baja OR fue de 50.66 (95 % IC 7.5 - 341.7) siendo un riesgo altamente significativo. Para los jornaleros que laboraron en invernaderos tecnificados el valor de OR fue de 2.96 (95 % IC 0.5-17.4) siendo éste no significativo. El valor de riesgo calculado claramente muestra el grado de exposición de los jornaleros y su posible alto riesgo para desarrollar enfermedades relacionadas con la exposición laboral a los agroquímicos. Los datos obtenidos sugieren, que los efectos genotóxicos incrementan en los tejidos epiteliales de los participantes, por exposición al mutágeno, conduciendo al desarrollo de enfermedades degenerativas. Los plaguicidas considerados como carcinógenos del tracto aerodigestivo aumentan la frecuencia de anormalidades nucleares en las células bucales y llegan a la corriente sanguínea, presentando un efecto sistémico en otros tejidos. Finalmente, en las células bucales, las anormalidades nucleares, se expresan en las células basales en división de las capas profundas de la mucosa bucal (^{Ceppi et al. 2010, 11}). Otros factores que valora el ensayo de micronúcleos, son las condiciones tecnológicas de los invernaderos, como indicadores de riesgo laboral con consecuencias de afectaciones para la salud.

En casos de la exposición laboral crónica, las diferencias entre la cinética de replicación y la vida media de las células epiteliales bucales puede contribuir a la aparición de micronùcleos y otras anormalidades nucleares. La exposición crónica conduce a una expresión elevada en estado estacionario de estas anormalidades, independientemente de la tasa de división celular, si el periodo de exposición excede el tiempo necesario para la división nuclear (^{Ceppi et al., 2010, 11}). En nuestro estudio al comparar los jornaleros con el grupo control, el daño al ADN se nota a consecuencia de la inhalación de los vapores de plaguicidas que persisten en los invernaderos, cuya magnitud depende de la tecnificación de la producción agrícola y las condiciones de humedad, temperatura y ventilación.

Conclusiones

Los estudios de biomarcadores nucleares, en células bucales y las frecuencias de anormalidades nucleares, muestran alteraciones en la cinética celular, el metabolismo, el perfil estructural de la mucosa bucal y los eventos de inestabilidad genómica. Nuestros resultados proporcionan información sobre las frecuencias de micronùccleos y otras anormalidades nucleares y citotoxicidad, originada por el uso de plaguicidas en los invernaderos y el trabajo en condiciones de tecnificación que influyen en el grado de exposición a sus vapores. La combinación del monitoreo del grado de alteraciones nucleares específicas en las células bucales con el uso de tecnologías en la producción agrícola, puede jugar un papel importante en la identificación de personas con un alto riesgo de desarrollar enfermedades laborales. Nuestros resultados ponen de manifiesto que los jornaleros que laboran en los invernaderos de baja tecnología mostraron una mayor frecuencia de células con anormalidades nucleares, debido al efecto de las condiciones laborales de exposición a los plaguicidas. La investigación evalúa la calidad del ambiente la boral, así como también transmite el mensaje para educar a los trabajadores en el manejo de plaguicidas y prevenir el desarrollo de enfermedades graves.