Material vegetal

Se utilizaron semillas de haba de diferente precocidad, la variedad Zac-22 (45 - 50 días a la floración), y la variedad Diamante (65 días a la floración). El experimento se realizó en campo abierto, en los meses de marzo a junio de 2018, en la localidad San Agustín Calvario, Cholula, Puebla. Las características físico-químicas del suelo fueron de textura arena migajonosa, ligeramente alcalina (pH = 7.1) y con 0.75% de materia orgánica; rico en fósforo (62 mg·kg^-1) y hierro (60 mg·kg^-1), con concentraciones adecuadas de Na (0.34 cmol·kg^-1), Cu (1.28 mg·kg^-1), Mn (1.18 mg·kg^-1) y Zn (2.3 mg·kg^-1), pero pobre en K (0.28 cmol·kg^-1), Ca (3.75 cmol·kg^-1), Mg (1.75 cmol·kg^-1) y CIC (7 cmol·kg^-1). La temperatura promedio durante el experimento se mantuvo en 20 °C, mientras que la máxima estuvo en un rango entre 38 - 45 °C, y la temperatura mínima en 7 ° C. La humedad relativa (HR) presentó un promedio de 60%, pero en los meses de mayo a junio fue de alrededor de 80%. Se realizó un riego a la siembra. Las semillas de las dos variedades fueron sembrados en parcelas de 4.5 m² (3 x 1.5 m) a una profundidad de 5 cm, cada parcela estuvo conformada por tres surcos, la distancia entre ellos fue de 60 cm, con una distancia entre plantas de 30 cm. Cada parcela fue una repetición, estableciéndose cuatro repeticiones de cada variedad.

Cada tercer día se visitó el terreno de cultivo entre las 7:00 y 8:30 am, y en el momento de la emergencia de las plántulas, cuando se observó el epicótilo (tallo) expuesto por arriba del nivel del suelo, cada plántula se marcó con una cinta de estambre de diferente color, para identificar la edad de las plántulas. A los 10, 15 y 20 días después de emergencia (DDE) se recolectaron aproximadamente 25 plántulas de haba de cada edad.

Proceso de secado

Procesamiento por horno de convección. De cada variedad, 10 plántulas de cada una de las edades se introdujeron en bolsas de papel de estraza, y se sometieron a deshidratación a 38 ± 2 °C por 12 - 14 h en el horno con flujo de aire forzado (Shel Lab, Modelo 1370FX, E.U.A.), hasta obtener un porcentaje de humedad en los tejidos de 6 - 7%.

Procesamiento por liofilización. Inmediatamente después del corte las plántulas de las diferentes edades y del registro del peso fresco, se partieron en trozos de aproximadamente 1 cm, se colocaron en bolsas de tul debidamente etiquetadas y se congelaron a -70 °C, por 48 h. Posteriormente las muestras previamente congeladas en las bolsas se introdujeron a una liofilizadora (Labconco, catalogo 7400040, E.U.A), con un Sistema de Liofilización FreeZone® Triad, y se procesaron a una presión de 0.22 mBa, con una temperatura en el colector de -80 °C, por un periodo de aproximadamente 18 h hasta obtener tejidos con un porcentaje de humedad entre 6.5 - 7%.

Las plantas deshidratas por ambos procesos se molieron en un molino (Krups, Gx4100, E.U.A), el residuo molido se pasó a un mortero para un molido más fino de la muestra, posteriormente, se tamizó a un tamaño de partícula 420 µm y luego se conservaron en frascos ámbar a temperatura ambiente (22 ± 2 ºC).

Determinación de compuestos fenólicos totales

Se utilizó el micro-método de Folin-Ciocalteu propuesto por ^{Singleton y Rossi (1965)}. Se pesó 5 mg de tejido vegetal y se disolvió en 5 mL de metanol, posteriormente las muestras se colocaron en un baño ultrasónico (Ultrasonic Cleaner AS5150B, China) por 30 min y después se centrifugaron a 5488 x g por 5 min. Los sobrenadantes se utilizaron como extractos y se mantuvieron en refrigeración a 4 °C hasta su uso. Para los ensayos se utilizó 25 μL del sobrenadante (o de estándar ácido gálico), se añadió 75 µL de agua desionizada. En seguida se agregó a la mezcla 25 µL de reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu (Sigma Aldrich, No. Cat. 47641, Suiza) (1:1 en agua desionizada), se agitó por 10 s a 72 rpm en parrilla de agitación (Thermo Scientific, SP131015, Malasia). Se dejó reposar por 6 min a temperatura ambiente (22 ± 2 ºC) en la oscuridad. Se añadió 100 µL de carbonato de sodio (Na₂CO₃, J.T. Baker, numero de catálogo: 3604, E.U.A) al 7.5% (p/v) (disuelto en agua destilada). Se agitó por 10 s a 72 rpm. Se dejó reposar a temperatura ambiente por 60 min en la oscuridad. La lectura de absorbancia se registró a 725 nm en un espectrofotómetro de microplaca (Thermo Scientific Varioskan Flash, Reino Unido).

Determinación de L-DOPA

La cuantificación de L-DOPA se realizó por triplicado en tejidos de plántulas de 10, 15 y 20 DDE y en flores por medio del método de ^{St-Laurent et al. (2000)} con algunas adecuaciones. Se pesó 35 mg de las muestras de las plantas y se agregó 7.5 mL de la solución extractora agua: acetonitrilo (85:15) (v/v) a pH 5 y se conservaron en frascos ámbar en refrigeración a 4 °C por toda la noche. Al día siguiente, los frascos con las muestras se mantuvieron en agitación por 30 min a 72 rpm en parrilla de agitación (Thermo Scientific, SP131015, Malasia). Posteriormente la mezcla se centrifugó a 2800 x g por 10 min a una temperatura de 10 °C. Del sobrenadante de cada muestra se realizó una dilución 1:10 en fase móvil, que fue preparada con 98% de ácido acético y 2% de metanol. El extracto se filtró con acrodiscos de 30 mm con una membrana de nylon de poro de 0.45 µm (Titan 2, Thomas Scientific, E.U.A.), el filtrado se colocó en viales ámbar de 2 mL para realizar el análisis. Para el análisis se usó un equipo HPLC (Perkin Elmer, 200a, E.U.A) con un detector de arreglo de diodos y una columna SuperC18 (5 µm tamaño de partícula) (250 x 4.6 mm di) (ACE Ultra Core, ACE-121-2546, Reino Unido). La fase móvil consistió de 0.1% de ácido acético glacial (98%) y 2% de metanol. El volumen de muestra fue de 10 µL, el flujo fue isocrático (1 mL·min^-1) y la detección fue a una longitud de onda de 283 nm, con una temperatura de análisis de 25 °C.

Actividad antioxidante

La actividad antioxidante in vitro frente al radical DPPH se analizó con base en el método ^{Brand-Williams et al. (1995)} con algunas modificaciones para micrométodo. En el ensayo se utilizaron 50 µL del mismo extracto usado para el análisis de compuestos fenólicos totales, y se mezcló con 200 μL de DPPH 0.1 mM (1,1-difenil-2-picrilhidrazil; Sigma-Aldrich, No Cat. D9132), después la mezcla se agitó por 10 s a velocidad media. La absorbancia se determinó a una longitud de onda de 521 nm, cada minuto por un periodo de 30 min, en el blanco (metanol) (A₀) y en las muestras (A₁), en un espectrofotómetro de microplaca (Thermo Scientific, Varioskan Flash, Reino Unido).

La actividad antioxidante se expresó como porcentaje de inhibición, lo cual corresponde a la cantidad de radical DPPH neutralizado por el extracto a una determinada concentración, de acuerdo a la siguiente ecuación: % Inhibición=% I=[A-A₁/A₀](100).

Se calculó el CI₅₀, que es la concentración media inhibitoria que causa la reducción del 50% de color y concentración del DPPH. Para obtener el CI₅₀ se realizaron diluciones del extracto de metanol a diferentes concentraciones de los tejidos analizados de las plántulas de haba: 40, 60, 80, 100, 200 y 400 µg·mL^-1. El cálculo se realizó mediante una regresión lineal de al menos cuatro puntos de los resultados del porcentaje de inhibición del extracto de las diferentes diluciones. Por lo que, a mayor actividad antioxidante, el valor de CI₅₀ será menor (^{Kedare y Singh, 2011}).

Análisis estadístico

Los datos por proceso de secado se analizaron mediante un modelo equivalente al diseño de bloques incompletos al azar, con cuatro repeticiones para cada variedad, desbalanceado (PROC GLM, ^{SAS, 2002}). Las variables de contenido de compuestos fenólicos totales, de L-DOPA y la actividad antioxidante fueron sometidas a un análisis de varianza, las cuales se evaluaron en tres diferentes fechas de corte (10, 15 y 20 DDE), con tres repeticiones por cada fecha de corte. La comparación de medias para cada fuente de variación se realizó mediante la prueba de Tukey.

Efecto de variedad, tejido, edad y secado en el contenido de compuestos fenólicos totales, L-DOPA y actividad antioxidante

Los resultados indicaron un efecto significativo del tejido, edad y método de secado de la plántula (P < 0.0001) sobre compuestos fenólicos totales y L-DOPA. Mientras que la variedad sólo mostro un efecto significativo en la actividad antioxidante (Cuadro 1). El coeficiente de variación tuvo una amplitud entre 20.25 y 29.76%.

Aunque la literatura documenta que la concentración de L-DOPA varía entre cultivares o variedades de haba (^{Etemadi et al., 2014}; ^{Hu et al., 2015}), las dos variedades de haba utilizadas en este trabajo no mostraron diferencias en la concentración de CFT ni en la de L-DOPA (Cuadro 2). La actividad antioxidante frente al radical DPPH mostró una actividad mayor en la variedad Diamante (CI₅₀: 114.99 µgˑmL^-1) (Cuadro 2). Por tejido, la flor tuvo una concentración mayor de CFT y de L-DOPA, y también una actividad antioxidante mayor. La edad de las plántulas afectó la concentración de los metabolitos. Se detectó que las plántulas más jóvenes de 10 DDE mostraron la concentración más alta de CFT (110.12 mg·g^-1 MS) y de L-DOPA (61.08 mg·g^-1 MS), y también las plántulas de 10 y 15 DDE presentaron una actividad inhibitoria mayor que las plántulas de 20 DDE (Cuadro 2).

El contenido mayor de compuestos fenólicos totales en etapas tempranas de la planta se debe a la necesidad de activar un mecanismo de defensa hacia el medio que los rodea. Al respecto se sabe que las condiciones del ambiente y el estrés ambiental afecta la acumulación de los metabolitos en las plantas (^{Afshar et al., 2015}). Según ^{Chon (2013)} los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios sintetizados durante el desarrollo normal y responden a condiciones de estrés y también se encuentran en diferentes partes de la planta.

Las plántulas secadas en estufa tuvieron una concentración significativamente mayor tanto para los CFT (118.67 mg·g^-1 MS) como para L-DOPA (67.65 mg·g^-1 MS) (Cuadro 2). El secado de tejidos vegetales con temperaturas mayores a 60 °C puede inducir la condensación oxidativa o degradación de compuestos termolábiles, mientras que la liofilización crea cristales de hielo en la planta, que rompen la estructura celular y permiten mejor el acceso y la extracción de los solventes (^{Asami et al., 2003}). Los resultados de nuestro estudio coinciden con la teoría mencionada, ya que el secado en estufa a una temperatura de 38 °C fue más efectivo para la conservación de L-DOPA. De acuerdo con ^{Mediani et al. (2014)} el método de secado en algunas circunstancias puede ser beneficioso para proteger algunos compuestos y no reducir su calidad siempre y cuando se mantengan condiciones adecuadas de temperaturas menores a 60 °C. Lo cual corresponde con nuestros resultados en la temperatura utilizada, y con un mayor contenido de L-DOPA.

Comparación de niveles y de rendimiento de los compuestos fenólicos totales y L-DOPA por variedad y por método de secado

El rendimiento de los CFT y de L-DOPA se consideró como el producto de la concentración de cada uno de ellos con base en la materia seca de las plántulas. El patrón de acumulación de la concentración y de rendimiento de CFT por variedad presentó una tendencia diferente en relación con el método de procesamiento de secado de las plántulas de haba. En el método de secado en estufa las plántulas de edad más joven (10 DDE) tanto de la variedad Diamante (125.94 mg·g^-1 MS) como la variedad Zac-22 (121.42 mg·g^-1 MS) presentaron los contenidos más altos y tendieron a disminuir en relación con las de mayor edad (20 DDE), contrario a la expresión con base en rendimiento (mg·plantula^-1) que mostró un valor mayor o igual a los 20 DDE, donde la variedad Diamante alcanzó un rendimiento de 119.02 mg·plantula^-1 y de 127.30 mg·plantula^-1 en la variedad Zac-22 (Figura 1). En el procesamiento por liofilización, en la variedad precoz (Zac-22) la tendencia en la concentración de CFT fue similar a disminuir de los 10 a los 20 DDE, aunque el rendimiento por plántula (58.06 mg·plantula^-1) a los 20 DDE fue menor. Sin embargo, en la variedad Diamante que es de floración tardía, la concentración en las plántulas (93.53 mg·g^-1 MS) de 20 DDE se mantuvo similar al rendimiento por plántula (90.59 mg·plantula^-1) (Figura 1).

Figura 1 Contenido de compuestos fenólicos totales (CFT) a los 10, 15 y 20 días después de emergencia (DDE), en las variedades de haba, Diamante y Zac-22, expresados en mg por gramo de materia seca (MS) (■) y por plántula (□). Cada punto es la media de tres repeticiones ± desviación estándar. Barras con letras diferentes por edad son estadísticamente diferentes (Tukey P ≤0.05). 

Se sabe que la inestabilidad y sensibilidad de los compuestos fenólicos en plantas suelen estar relacionado a ciertos tratamientos de secado (^{Lim y Murtijaya 2007}). En general nuestros resultados mostraron que el método de secado en estufa a 38 °C presentó los contenidos más altos de CFT en relación a las muestras secadas por liofilización a -80 °C. En contraste, en la especie Cosmos caudatus de la familia Astereacea y de amplia importancia en la medicina tradicional, se menciona que el secado por liofilización con congelamiento previo a -20 °C, favoreció una mayor conservación de CFT en relación con el secado por estufa a 44.5 °C (^{Mediani et al., 2014}) en el que se redujo considerablemente la concentración de estos compuestos por el efecto del calor.

Probablemente los resultados de nuestro estudio difieren, debido a que utilizamos una temperatura de secado en estufa de aire forzado más baja (38 °C), que la utilizada en el trabajo de C. caudatus, y la temperatura de congelamiento previo de las muestras y del colector durante la liofilización, fue mayor (-80 °C). Además, como mencionan ^{Petkovsek et al. (2010)} que la acumulación de compuestos fenólicos puede ser influenciada por las condiciones de cultivo de la especie, condiciones climáticas, estación de cultivo, entre otras.

La literatura reporta que el procesamiento de los tejidos de leguminosas afecta de forma negativa la concentración de L-DOPA, como en las semillas de Mucuna pruriens, donde la concentración disminuye por el proceso de cocimiento a alta temperatura y el uso de soluciones alcalinas (^{Echeverría y Bressani, 2006}). Para esta misma especie también señalan que la cocción de las semillas afecta la concentración de L-DOPA pero no el tostado (^{Dahouda et al., 2009}). Mientras que en los cotiledones de semillas maduras de Vicia faba L., la L-DOPA se removió completamente por tratamientos térmicos de hervido y tostado a 120 °C (^{Cardador-Martínez et al., 2012}), lo que apunta que es un compuesto termolábil.

La revisión realizada recientemente por ^{Etemadi et al. (2019)} sobre aspectos agronómicos, de valor nutricional y aplicaciones medicinales de Vicia faba L., refiere que “la distribución de L-DOPA no es uniforme en las estructuras de la planta de haba, y que los diferentes órganos acumulan L-DOPA en diferentes proporciones”. ^{Etemadi et al. (2018b)} señala que el pico de concentración de L-DOPA en los órganos de Vicia faba L. se alcanza en estados tempranos del desarrollo, como se observó en este estudio, donde ambas variedades de haba acumularon la concentración mayor a los 10 DDE, pero a esta misma edad expresado con base en la biomasa por plántula se tuvieron los valores más bajos (Figura 2). Debido a que en Vicia faba, el rendimiento de L-DOPA es el producto de la concentración y biomasa de la planta (^{Etemadi et al., 2018b}), de tal forma que a medida que la planta se desarrolla se puede obtener un rendimiento mayor con base en la biomasa. Por ejemplo, las muestras procesadas por secado en estufa a los 10 DDE de la variedad Diamante tuvieron la concentración más alta (65.26 mg·g^-1 MS) y similar a la variedad Zac-22 (66.82 mg·g^-1 MS). Sin embargo, a esta misma edad, el contenido de L-DOPA expresado por plántula^-1 tuvo los valores más bajos, 34.57 mg·plántula^-1 en la variedad Diamante y 37. 68 mg·plántula^-1 en Zac-22 (Figura 2).

Figura 2 Contenido de L-DOPA expresado en mg por gramo de materia seca (■) y rendimiento por plántula (□) de las variedades de Vicia faba L., Diamante y Zac-22 a los 10, 15 y 20 días después de emergencia. Cada punto es la media de tres repeticiones ± desviación estándar. Barras con letras diferentes por edad son estadísticamente diferentes (Tukey P≤0.05). 

Aunque en general el secado por liofilización mostró una tendencia similar de acumulación de L-DOPA en las diferentes edades de las plántulas como en el secado por estufa, en la variedad Diamante a los 20 DDE se obtuvieron valores similares expresados tanto en concentración (53.30 mg·g^-1) como por plántula (59.79 mg·plántula^-1) (Figura 2). Inclusive en la variedad Zac-22 el contenido fue mayor expresado en concentración (50.24 mg·g^-1) que por plántula (55.52 mg·plántula^-1). Lo que sugiere que el método de liofilización afectó significativamente el contenido de L-DOPA, probablemente por la baja temperatura de congelamiento (-80 °C) previo al proceso y durante la liofilización.

Es notable destacar que bajo las condiciones de este estudio, de plantas sembradas en suelo y en campo abierto con valores promedio de radiación fotosintéticamente activa de 788 µmol m^-2 s^-1, 20 °C de temperatura, y 60% de humedad relativa durante el periodo de cultivo de las plantas, las concentraciones más altas de L-DOPA se obtuvieron a los 10 DDE (110.12 mg·g^-1 MS) en promedio de ambas variedades. En contraste en plantas de Vicia faba L. cultivadas en macetas de plástico con perlita y crecidas bajo iluminación continua de luz blanca fluorescente (1500 µmol m^-2 s^-1), las plántulas de 10-12 de edad presentaron contenidos de L-DOPA de 8.70-40.01 mg·g^-1 de MS y los valores más bajos los detectaron en las semillas (^{Kirakosyan et al., 2004}), por lo que estos autores explican que las rutas para la biosíntesis de L-DOPA se activan después de la germinación y durante el desarrollo de la planta.

Actividad antioxidante

Diferentes compuestos como vitaminas, polifenoles, carotenoides, terpenoides, y minerales traza pueden actuar en sinergia para conferir la capacidad antioxidante a las plantas (^{Pérez-Jiménez et al., 2008}). En particular, los compuestos fenólicos son fitoquímicos con una alta relevancia por sus propiedades que promueven la salud. Recientemente ^{Turco et al. (2016)} realizaron una revisión sobre los beneficios para la salud de los polifenoles de Vicia faba L., y señalan que estos compuestos en el haba podrían estar implicados en la protección contra el desarrollo de enfermedades humanas. En este trabajo se calculó la concentración de extracto necesaria para disminuir la concentración inicial de DPPH en 50% (CI₅₀) bajo las condiciones experimentales especificadas, tanto en plántulas de diferente edad como en flores de dos variedades de haba bajo dos métodos de secado.

Los resultados obtenidos en la determinación de la actividad antioxidante CI₅₀ mostraron diferencia significativa (P <0.05) por variedad, entre métodos de secado, dentro de tejidos (Cuadro 3). En la variedad Diamante el secado afectó de manera diferente en los tejidos, los extractos de las plántulas de 10 y 15 DDE tuvieron una actividad inhibidora del radical DPPH significativamente mayor en el método de secado por estufa respecto al liofilizado. En contraste, las plántulas de 20 DDE y las flores liofilizadas mostraron una actividad antioxidante significativamente mayor respecto al secado por estufa (Cuadro 3). En la variedad Zac-22, tanto en plántula como en flor, el método de secado por estufa mantuvo la actividad inhibitoria mayor respecto a los tejidos liofilizados (Cuadro 3).

Algunos autores mencionan que los tratamientos de calentamiento pueden desactivar algunas enzimas y también degradar algunos fitoquímicos causando un contenido bajo de metabolitos, específicamente en los antioxidantes. Debido a que algunos procesos de secados pueden beneficiar o no a la actividad natural de los antioxidantes, ya que muchos de ellos suelen ser muy inestables a altas temperaturas (^{Lim y Murtijaya 2007}). En este estudio el método de secado y el estado fenológico influyeron en la actividad antioxidante, en general, el método de secado en estufa y las flores mantuvieron una alta capacidad de captación de radicales libres del DPPH (CI₅₀).

Existe una clasificación de la capacidad antioxidante de los extractos vegetales en relación a la concentración del valor de CI₅₀ (^{Ramos et al., 2003}). Así extractos con alto potencial antioxidante se refiere a aquellos con concentraciones menores a 30 µg·mL^-1, extractos con moderado potencial aquellos que presenten un intervalo entre 30 y 100 µg·mL^-1 y extractos con bajo potencial antioxidante aquellos que presenten un CI₅₀ por encima de 100 µg·mL^-1. No obstante, autores como ^{Lee et al. (2008)} describen que todo extracto que tenga efecto antioxidante con una concentración de CI₅₀ menor a 10 mg·mL^-1 se puede considerar un antioxidante efectivo.

En nuestros resultados, a pesar de que en los extractos de flor, por variedad o método de secado no se detectaron diferencias significativas en la actividad antioxidante, la actividad inhibidora del radical DPPH fue mayor que en plántula. En general podemos considerar que los valores obtenidos en este estudio tanto en plántula como en flor, evidencian una actividad antioxidante alta respecto a lo que se documenta en vainas de Vicia faba L. (^{Mateos-Aparicio et al., 2012}), que mostraron un valor de CI₅₀ de 400 µg·mL^-1.

Correlación entre actividad antioxidante (CI₅₀) frente al radical DPPH y el contenido de compuestos fenólicos totales y L-DOPA

El contenido de CFT y de L-DOPA de los extractos de tejidos de plántula y flor de haba tuvieron correlaciones negativas estadísticamente significativas con la actividad antioxidante frente al radical DPPH (CI₅₀), con valores de correlación de -0.5049 y de -0.6041 respetivamente (Cuadro 4). Estos resultados sugieren que los CFT y L-DOPA de las plántulas y flores de haba juegan un papel significativo en los mecanismos antioxidantes con el radical DPPH. Estos hallazgos corroboran los resultados previos descritos por ^{Mateos-Aparicio et al. (2012)} que mencionan que en extractos de vainas de Vicia faba L., la fuerte actividad de atrapamiento de radicales contra el radical DPPH, estuvo relacionado primordialmente a los compuestos fenólicos. Además, se detectó una fuerte correlación (r=0.7917) entre el contenido de CFT con el contenido de L-DOPA.

Al respecto Randhir y Shetty (2003) mostraron que plántulas de Vicia faba de 16 días tuvieron una disminución en la actividad antioxidante y conjuntamente un aumento en el contenido de L-DOPA, lo que apunta a que en ese estado de desarrollo del haba, la mayoría de los fenólicos se canalizan hacia la producción de L-DOPA. Mientras que en el primer día de germinación de semillas de esta misma especie, se detectaron niveles altos de actividad antioxidante y también contenidos altos de L-DOPA, lo que sugiere que inicialmente los compuestos fenólicos son de naturaleza antioxidante y que solo una parte menor de ellos se convierten en lignina (^{Randhir y Shetty, 2004}).