Artículos

 

Supervivencia de los esclerocios de Phymatotrichopsis omnivora en función del pH in vitro*

 

Survival of the sclerotia of Phymatotrichopsis omnivora as a function of pH in vitro

 

José Alfredo Samaniego Gaxiola^1§

 

¹Campo Experimental La Laguna - INIFAP. Blvd. Prof. José Santos Valdez # 1200 Pte. Matamoros, Coahuila, México. C. P. 27440. Tel: (871)1 82 30 81. ^§Autor para correspondencia: samaniego.jose@inifap.gob.mx.

 

* Recibido: abril de 2012
Aceptado: enero de 2013

 

Resumen

Phymatotrichopsis omnivora es un hongo fitopatógenos que ataca a miles de especies de plantas, principalmente en suelos alcalinos. En el presente trabajo, se evaluó la capacidad de los esclerocios de P. omnivora para cambiar el pH y sobrevivir en soluciones ácidas y amortiguadoras. Los esclerocios fueron colocados dos semanas en soluciones de ácidos acético (0.4, 0.8 y 1.7 mmol L^-1) y sulfúrico (0.25, 0.5 y 1 mmol L^-1), éstas soluciones no se recambiaron o se hicieron una, dos o tres veces. Los esclerocios también se pusieron siete días en soluciones amortiguadoras (pH 4, 5, 8 y 9) sin diluir o diluidas a razón de 1:2, 1:4 y 1:10 v/v. Otros esclerocios se colocaron en soluciones selectas de ácido sulfúrico 0.5 mmol L^-1 y amortiguadora a pH 5 diluida 1:10, luego se extrajeron y fueron sometieron a tratamientos de estrés. Estos tratamientos consintieron en colocar los esclerocios en: solución de NaOCl, arena inundada con glucosa, arena inundada, y arena a capacidad de campo. Los esclerocios cambiaron el pH de las soluciones de ácido acético sin recambio, y amortiguadoras de pH 8 y 9 diluidas 1:10. Pero, el cambio de pH de las soluciones fue marginal cuando los ácidos no se recambiaron y las soluciones amortiguadoras no se diluyeron. La supervivencia de los esclerocios fue nula con tres recambios de de ácido sulfúrico a l mmol L^-1 y en soluciones amortiguadora de pH 4, pH 5 diluida 1:4 o menos, y pH 9 sin diluir; en el resto de las soluciones, algunos esclerocios lograron sobrevivir. Los tratamientos de estés tuvieron un efecto sinérgicos en disminuir la supervivencia de los esclerocios que previamente fueron colocados en las soluciones selectas (ácido sulfúrico 0.5 mmol L^-1 y amortiguadora a pH 5 diluida 1:10).

Palabras clave: ácidos grasos volátiles, hongos fitopatógenos en suelo, materia orgánica.

 

Abstract

Phymatotrichopsis omnivora is a phytopathogenic fungus that attacks thousands of species of plants, mainly in alkaline soils. In this study, we assessed the capacity of sclerotia ofP. omnivora to change the pH and survive in acidic and buffer solutions. The sclerotia were placed in acetic (0.4, 0.8 and 1.7 mmol L^-1) and sulfuric acid solutions (0.25, 0.5 and 1 mmol L^-1) for two weeks; these solutions were not replaced or were remade one, two or three times. The sclerotia were also put in buffer solutions for seven days (pH 4, 5, 8 and 9), undiluted or diluted at 1:2, 1:4 and 1:10 v/v. Other sclerotia were placed in selected solutions of 0.5 mmol L^-1 sulfuric acid and in buffer solutions with pH 5 diluted 1:10; they were then extracted and subj ected to stress treatments. These treatments consisted in placing the sclerotia in: NaOCl solution, sand saturated with glucose, flooded sand, and sand at field capacity. The sclerotia changed the pH of the acetic acid solutions without replacement, and the Ph of buffer solutions with pH 8-9 diluted 1:10. However, the change of pH of the solutions was marginal when the acids were not replaced and when the buffer solutions were not diluted. The survival of the sclerotia was null with three replacements of sulfuric acid at 1 mmol L^-1 and in buffer solutions with pH 4 and 5 diluted 1:4 or less, and with pH 9 undiluted; some sclerotia survived in the rest of the solutions. Stress treatments had a synergistic effect of reducing the survival of sclerotia that had been previously placed in the selected solutions (0.5 mmol L^-1 sulfuric acid and buffer with pH 5 diluted 1:10).

Key words: organic matter, phytopathogenic fungi in soil, volatile fatty acids.

 

Introducción

Phymatotrichopsis omnivora (Duggar) Hennebert, se distribuye principalmente en suelos alcalinos, ataca las raíces de más de 2 000 especies de plantas y se encuentra solo en México y Estados Unidos de América (Uppalapati et al, 2010). Los rangos de pH en el suelo de 8.5 - 8, < 8 - 7.5 y < 7.5 - ≤ 7 se asociaron con frecuentes, medios y escasos síntomas del ataque por P. omnivora hacia plantas de algodón Gossypium spp., respectivamente (Bell, 1990). Los esclerocios de este hongo fueron más susceptibles a Trichoderma sp. y Propiconazol a pH 4 - 5 que a pH 7; sin embargo, los esclerocios modificaron el pH desde 3.6 - 3.8 a 5.0 - 5.5 después de permanecer en soluciones de ácido acético (Samaniego- Gaxiola, 2008 a). De manera indirecta, el pH ácido podría afectar la patogenicidad de P. omnivora, pues se redujo el número de plantas de vid con síntomas de ataque del hongo después de aplicar al suelo el fertilizante ácido tiosulfato de amonio durante 10 años (Olsen etal., 1988).

La humedad, temperatura y pH en su conjunto, indujeron en especies de Fusarium y Sclerotium consumo de energía y la pérdida de su supervivencia (Hyakumachi y Luckwood, 1989; Mondal y Hyakumachi, 1998). El pH de la solución del suelo deciende al degradar la materia orgánica en ausencia de oxígeno, aparcen ácidos grasos volátiles como el acético y mueren los microorganimos fitopatógenos (Momma, 2008). Así que, se aume que la muerte de estos microorganismos se debe en parte a los ácidos grasos volátiles (Momma et al., 2006). Pero no se sabe sí ácidos inorgánicos en soluciones diluidas como el sulfúrico, pudiesen matar hongos fitopatógenos, particularmente esclerocios de P. omnivora.

El modificar temporalmente el pH del suelo podría disminuir el inoculo de hongos fitopatógenos como P. omnivora; sin embargo, antes de intentar un cambio temporal del pH del suelo, es necesario determinar sí éste afecta la supervivencia de los esclerocios del hongo. Un cambio controlado de pH es técnicamente más fácil hacerlo in vitro que en el suelo, ya que el pH del suelo es dinámico, depende e interacciona con el contenido de materia orgánica, fertilizantes, sales, humedad, actividad microbiana y raíces de plantas (Imas, 2000; Sahrawat, 2005). Por tanto, in vitro, es factible estudiar la capacidad de los esclerocios de P. omnivora para cambiar el pH de su entorno inducido con ácidos orgánico e inorgánico.Asimismo, sería posible determinar la respuesta en supervivencia de los esclerocios al verse restringidos a cambiar el pH de su entorno, ello usando soluciones amortiguadoras o recambiaos de soluciones ácidas donde los esclerocios permanezcan.

En suma, el pH podría ser un factor de estés que induzca la muerte de los esclerocios de P. omnivora. Factores de estrés como el NaOCl, suelo adicionada con glucosa y humedad en suelo se han estudiado para los esclerocios de P. omnivora (Samaniego- Gaxiola, 1992; 1994; 2008 b), pero no se ha estudiado la posible interacción entre éstos factores y el pH. Los objetivos del presente estudio fueron: 1) registrar el cambio de pH causado por esclerocios de P. omnivora en soluciones de ácidos acético, sulfúrico y amortiguadoras; 2) determinar la supervivencia de los esclerocios después de permanecer en cada una de estas soluciones; y 3) evaluar la supervivencia de los esclerocios después de permanecer en soluciones selectas ácidas o amortiguadoras y posteriormente, someterlos a los siguientes tratamientos de estrés: enterrados en arena inundada y adicionada con glucosa, inmersos en una solución de hipoclorito de sodio, enterrados en arena inundada, y enterrados en arena a capacidad de campo.

 

Materiales y métodos

Material biológico

Esclerocios de P. omnivora se reprodujeron durante dos meses en frascos con arena y sorgo estéril, se cosecharon y finalmente se almacenaron a 10 °C inmersos en agua destilada estéril hasta su uso, como se indica en Samaniego-Gaxiola (2008 a). Los experimentos iniciaron 10 días después obtener los esclerocios. Grupos de 25 esclerocios se colocaron por vial de 20 ml que contenía 10 mL de la solución ácida o amortiguadora a evaluar. Cada vial representó una de las cuatro repeticiones por tratamiento en los experimentos.

 

Soluciones químicas

Soluciones de ácidos acético y sulfúrico fueron preparadas a razón de 0.4, 0.8 y 1.7 ó 0.25, 0.5 y 1 mmol L^-1, respectivamente. Soluciones amortiguadoras de pH 4 y 5 se prepararon usando 0.2 M de ácido acético - acetato de sodio. En la solución de pH 8, se uso 0.2 M de hidróxido de potasio - fosfato de sodio dibásico. Para la solución de pH 9, se emplearon 0.1 M de bicarbonato de sodio - carbonato de sodio (Plummer, 1981). Las soluciones amortiguadoras se usaron sin diluir (1:0) o diluidas en agua destilada en proporción de 1:2, 1:4 y 1:10 v/v. Cómo control, a todas las soluciones preparadas se le verificó el pH (pH observado) y fue comparado con el pH calculado según las siguientes ecuaciones: para el ácido acético pH= (1/2*pK)-(1/2)*log10(c), en donde pK y c son la constante de disociación y moles por litro del ácido, respectivamente (Tenuta et al, 2002); entre tanto, para el ácido sulfúrico el pH= -log 10 (c) donde c son moles por litro del ácido. Los resultados del pH de las soluciones se indican en el siguiente cuadro.

 

Incubación y supervivencia de los esclerocios en las soluciones ácidas y amortiguadoras

Los esclerocios fueron incubados por 14 días a temperatura de 28 °C en viales que contenían 10 mL de las soluciones de los ácidos acético (0.4, 0.8 y 1.7 mmol L^-1) y sulfúrico (0.25, 0.5 y 1 mmol L^-1), en el tratamiento testigo se incubaron los esclerocios en viales con agua destilada. Otros esclerocios fueron incubados en las soluciones ácidas señaladas, pero las soluciones de los ácidos se recambiaron una, dos o tres veces; el primer recambio fue al tercer, el segundo al sexto y el tercer al noveno día después de iniciar el período de incubación. Esclerocios adicionales se incubaron en soluciones amortiguadoras sin diluir (1:0 a pH 4, 5, 8 y 9) o diluidas (1:2, 1:4 y 1:10) durante siete días a 28 °C. Después de incubar los esclerocios en las soluciones ácidas o amortiguadoras, se evaluó su supervivencia al colocarlos sobre arena a capacidad de campo contenida en cajas petri, por dos semanas a 28 °C. Durante este tiempo, se observó la germinación de los esclerocios (viables) o su invasión y muerte por otros microorganismos del suelo (no viables) (Samaniego- Gaxiola, 2008 a).

 

Incubación y supervivencia de los esclerocios en soluciones selectas y posteriores tratamientos

Se colocaron esclerocios en soluciones de 0.5 mmol L^-1 de ácido sulfúrico y amortiguadora pH 5 diluida 1:10, en cuyos casos respectivos, permanecieron incubados por 3, 10 ó 13 y uno, tres o seis días a 28 °C. Después de incubar los esclerocios, éstos se extrajeron y se les aplicó los tratamientos siguientes: 1) se enterraron durante dos semanas a 28 °C en arena inundada y adicionado con 1 mg g^-1 de glucosa (Samaniego- Gaxiola, 1994); 2) se colocaron en viales que contenían 10 mL de solución de hipoclorito de sodio comercial al 0.3% por 4 h a 28 °C (Samaniego-Gaxiola, 2008 b); 3) se enterraron en arena inundada por dos semanas a 28 °C (Samaniego- Gaxiola, 1992); y 4) se enterraron dos semanas en arena cuya humedad inicial fue capacidad de campo. Después de cada tratamiento, los esclerocios se extrajeron y se evaluó su supervivencia en arena, excepto para los esclerocios en NaOCl, en cuyo caso se colocaron en medio agar agua (15 g de agar por litro), por una semana a 28 °C (Samaniego- Gaxiola, 1994 y 2008 b).

 

Monitoreo del pH en las soluciones

El pH se midió con un potenciómetro marca Orion y modelo 710 A. En las soluciones de los ácidos acético y sulfúrico donde permanecieron los esclerocios se midió el pH a los 1, 3, 6, 9, y 12 días; en estas soluciones las mediciones de pH a los 3, 6 y 9 días se realizaron justo antes de hacer cada recambio de los ácidos. El pH en las soluciones amortiguadoras se midió a los 1, 3, 5 y 7 días.

 

Análisis de datos

Todos los experimentos se repitieron dos veces. Los datos de los experimentos repetidos por segunda vez fueron los que se analizaron, debido a su menor desviación estándar de las medias. Los porcentajes de supervivencia de los esclerocios se transformaron (arco seno) antes del análisis estadístico. Cada experimento se manejó con un diseño completamente al azar, un arreglo factorial y un análisis de varianza con medias repetidas a través del tiempo. La prueba de Tukey fue usada para comparar medias (p≤ 0.05). Todos los análisis se efectuaron en SAS (1999).

 

Resultados

Monitoreo del pH en las soluciones

En solución de ácido acético sin recambio a 1.7 mmol L^.-1 donde permanecieron los esclerocios, el pH alcanzó ~ 5.5 hacia el sexto y se mantuvo así hasta el doceavo día; en contraste, en solución a la misma concentración con tres recambios, el pH se mantuvo 4.0-4.4 (Figura 1). El cambio de pH de las soluciones de ácido acético, dependió de los recambios, el tiempo, la concentración del ácido y sus interacciones (p≤ 0.001).

Esclerocios inmersos 12 días en solución de ácido sulfúrico a 0.25, 0.5 y 1 mmol L^-1 sin recambio tuvieron un pH entre 4.8 a 3.6; mientras tanto, el pH se mantuvo 3,6 a 3.4 en todas las soluciones de ácido sulfúrico con tres recambios (Figura 2). En las soluciones sin recambio de ácido sulfúrico, el cambio en el pH con relación al tiempo y sus interacciones no fueron significativas, pero fue significativo para la concentración del ácido (p≤0.001).

Las soluciones amortiguadoras sin diluir, donde estuvieron los esclerocios, se mantuvieron sin cambio de pH a través del tiempo; pero al diluir 1:10 las soluciones amortiguadoras de pH 8 y 9, se observó un cambio de pH hasta de una unidad. Mientras tanto, la variación observada en el pH en soluciones amortiguadora de pH 4 y 5 diluidas 1:10 sólo varió ~ 0.3 unidades (Figura 3). Los cambios de pH en las soluciones amortiguadoras de pH 4, 5, 8 y 9 fueron significativos con relación al factor de dilución, tiempo y su interacción (p= 0.01), excepto a pH 9, donde la interacción tiempo x factor de dilución no fue significativa.

 

Supervivencia de los esclerocios en las soluciones ácidas y amortiguadoras

Todos los esclerocios sobrevivieron en todas las soluciones de ácidos acético y sulfúrico sin recambio, pero, su supervivencia empezó a disminuir en las soluciones de 0.5 y 1 mmol L^-1 de ácido sulfúrico con tres o un recambio, respectivamente (Cuadro 2). En las soluciones de ácido sulfúrico la supervivencia de los esclerocios varió con respecto a la concentración y los recambios (p≤ 0.001).

A pH 8 y 9 en soluciones amortiguadora sin diluir, la supervivencia de esclerocios fue < 25%, pero los esclerocios sobrevivieron casi por completo cuando estas soluciones se diluyeron. Los esclerocios no sobrevivieron en cualquier solución amortiguadora a pH 4 y sobrevivieron sólo 24% en solución diluida 1:10 a pH 5 (Cuadro 3).

 

Supervivencia de los esclerocios en soluciones selectas y posteriores tratamientos

Los esclerocios no lograron sobrevivir después de permanecer en solución 0.5 mmol L^-1 de ácido sulfúrico durante 7 ó 10 días y posteriormente colocarse en solución de NaOCl o enterrarse en arena inundada que contenía glucosa, respectivamente. Por el contrario, los esclerocios sobrevivieron casi 100% después de 7 días de permanecer en la solución de este ácido y posteriormente enterrarlos en arena: inundada con glucosa, a capacidad de campo o inundada (Cuadro 4).

Al incrementar el tiempo de permanencia de los esclerocios en las soluciones de ácido sulfúrico 0.5 mmol L^-1 y amortiguadora a pH 5 diluida 1:10, y posteriormente someterlos a tratamientos de estés, su supervivencia disminuyó, el orden en que ello ocurrió fue: NaOCl > arena con glucosa > arena inundada > arena a capacidad de campo (Cuadros 4 y 5).

 

Discusión

Los cambios de pH más acentuados se observaron después de que los esclerocios permanecieron en las soluciones menos concentradas de los ácidos acético, sulfúrico y soluciones amortiguadoras diluidas 1:10. Cuando el ácido sulfúrico se recambió y se usaron soluciones amortiguadoras no diluidas, el pH en estas soluciones tuvo poco cambio y los esclerocios disminuyeron su supervivencia. Esto indica que el pH muy ácido es un factor que disminuye in vitro la supervivencia de los esclerocios de P. omnivora, lo que podría también ocurrir en suelos ácidos, y es un indicio del por qué el hongo no se manifiesta atacando plantas en suelos con pH ácido.

Los suelos ácidos favorecen la biodiversidad de hongos; sin embargo, los hongos tienen un amplio margen de crecimiento con relación al pH (4.0-8.3) y se encuentran menos en suelo alcalino debido a la competencia con las bacterias (Fierer y Jackson, 2006; Rousk et al., 2010). En general, P. omnivora parece romper ésta regla, pues preponderantemente se encuentra en los suelos alcalinos de Estados Unidos de América y México (Uppalapati et al, 2010).

Los hongos pueden alcalinizar el pH de su entorno al producir amoniaco (Prusky et al, 2001), pero al mismo tiempo necesitan una autorregulación de ese pH y de sus solutos intracelulares, lo cual pueden lograrlo al producir ácidos orgánicos y la salida de iones Na+ y H+ mediante el uso de energía (ATP) (Russel, 1992; Caracuel et al., 2003). Por tanto, el pH externo estimula a los hongos para que ellos a su vez lo modifiquen; sin embargo, no hay información de cómo regula el pH externo e interno los esclerocios de P. omnivora.

El pH alrededor de los hongos también induce la expresión de sus genes que codifican para: el cambio del pH extracelular (hasta cuatro unidades), la formación de metabolitos secundarios, la excreción de enzimas, la permeabilidad su pared celular y para atacar a plantas, por ello, manipular el pH del ambiente suelo o agua podría contribuir a combatir hongos que atacan a plantas, animales y al hombre (Eshel et al, 2002; Peñalva y Arst, 2002). Particularmente, el ácido acético y otros ácidos grasos volátiles penetran a las células de hongos e inducen degradación de ADN y cambio de pH intracelular (Giannattasio et al, 2012), ello podría también ocurrir cuando los esclerocios mueren en las soluciones amortiguadoras, como se consigna en este trabajo.

El ácido acético en forma no ionizada tiene un efecto tóxico muy acentuado sobre células, aunque también es tóxico en forma ionizada (Wang y Wang, 1984; Fernández-Sandoval et al, 2010). La forma no ionizada del ácido se realza al disminuir el pH, lo que hace que penetre a las células e induzca su muerte (Uhre y Arneborg, 1998). En este trabajo, la supervivencia de los esclerocios disminuyó en las soluciones amortiguadoras diluidas ≤ 1:10 a pH 5 cuyo contenido de ácido acético fue ≥ 6.4 mmol L^-1, que es en realidad equivale a 2.1 mmol L^-1 del ácido en forma no ionizada, según la ecuación de Henderson-Hasselbalch citada por Tenuta et al. (2002). En contraste, todos los esclerocios sobreviven hasta dos semanas en soluciones de 1.7 mmol L^-1 o (1.4 mmol L^-1 ácido en forma no ionizada).

Dosis de ácido acético de 17 o67mmol L^-1 donde permanecieron esclerocios de P. omnivora murieron en > 70% después de cinco horas o 15 minutos, respectivamente (Samaniego-Gaxiola, 2010). Lo anterior, sugiere que el efecto letal del ácido acético sobre los esclerocios de P. omnivora se debe al ácido en sí y no al pH inducido por éste acido. Esta idea es apoyada también, por la supervivencia por completo de los esclerocios que permanecieron dos semanas en la solución de 1 mmol L^-1 de ácido sulfúrico con un pH ~ 3.6 (Cuadro 2).

El ácido sulfúrico podría inducir la muerte de los esclerocios al reaccionar directamente con los compuestos celulares, ya que él ácido es sumamente reactivo. De manera similar, el NaOCl puede oxidar los compuestos orgánicos en disolución o pueden oxidar directamente estructura celular, en ambos casos puede inducir la muerte de las células (Estrela et al., 2002).

Por otra parte, los esclerocios de P. omnivora sobrevivieron 24 y 0% en soluciones amortiguadoras no diluidas a pH de 8 y 9, respectivamente, estas soluciones contenían 100 y 93 mmol L^-1 de fosfato de sodio dibásico y bicarbonato de sodio. No se tiene explicación del por qué murieron los esclerocios a pH 8 y 9; sin embargo, con anterioridad se reportó que los esclerocios de Sclerotium rolfsii Sacc únicamente sobrevivieron de 0 al 7%, en medio sólido que contenía 50 mmol de fosfato de sodio dibásico y bicarbonato de sodio, respectivamente, aunque tampoco se explicó la razón de ello (Punja y Grogan, 1982). El pH alcalino (8) también es un factor que se asoció con la pérdida de carbono endógeno y subsecuente muerte de Fusarium solani f. sp. phaseoli (Mondal y Hyakumachi, 1998).

Otros resultados de éste trabajo indican que, los esclerocios de P. omnivora disminuyeron su supervivencia cuando posterior a permanecer en las soluciones selectas (ácido sulfúrico 0.5 mmol L^-1 y amortiguadora pH 5 diluida 1:10) se sometieron a tratamientos adicionales de estrés (Cuadros 4 y 5). Dicha disminución de supervivencia fue mayor que la previamente reportada para esclerocios que nos estuvieron en contacto con las soluciones de ácido sulfúrico y amortiguadora (Samaniego- Gaxiola, 1992; 1994 y 2008 b). Es decir, los tratamientos de estrés fueron sinérgicos con las soluciones selectas para disminuir la supervivencia de los esclerocios.

La glucosa en suelo, resultó ser el compuesto que más incrementó la actividad metabólica de los microorganismos en el suelo, (Aldén et al, 2001). La adición de glucosa o residuos vegetales ricos en carbohidratos, seguida de inundar el suelo, favorece que los microorganismos generen ácidos grasos volátiles que son capaces de matar a hongos (Okazaki y Nose, 1986; Momma, 2008), así como un descenso del pH en el suelo, un potencial oxido reducción con valores negativos, entre otros (Sahrawat, 2005). Asimismo, la adición de ácidos grasos volátiles, también se han asociado con la muerte de microorganismos fitopatógenos (Tenuta et al, 2002; Conn et al, 2005; Abbasi et al, 2009).

Descomponer material orgánica bajo condiciones dirigidas como inundación, residuos ricos en carbohidratos y la adición de algún ácido inorgánico, podría permitir un cambio temporal del pH de la solución del suelo, en donde la combinación de los ácidos (grasos volátiles) e inorgánico podrían matar esclerocios de P. omnivora, como recientemente se sugiere (Samaniego- Gaxiola, 2012). En contraste, adicionar materia orgánica en el suelo como compostas, residuos de cosecha y abonos vegetales no siempre se asocia con la muerte de hongos fitopatógenos que atacan raíces de plantas cultivadas (Bonanomi et al, 2007).

 

Conclusiones

Se confirmó que los esclerocios de P. omnivora lograron cambiar el pH de soluciones de ácidos acético, sulfúrico y amortiguadoras (diluidas), aunque el cambio dependió de la concentración de los ácidos y sus recambios en el caso de los ácidos acético y sulfúrico.

Soluciones de ácido sulfúrico solo indujeron la muerte de los esclerocios, cuando alcanzaron valores 3.5 o menos durante dos semanas, lo cual requirió de recambiar las soluciones, lo que sugiere que a pH 4 éste ácido por si solo difícilmente podría disminuir la supervivencia del esclerocio en el suelo.

En soluciones amortiguadoras con > 2.1 mmol L^-1 de ácido acético en forma no ionizada los esclerocios perdieron por completo su supervivencia, no obstante que el pH de las soluciones oscilara de 4 a 5.

La supervivencia de los esclerocios disminuyó al aumentar el tiempo de permanencia en ácido sulfúrico 0.5 mmol L^-1 y solución amortiguadora pH 5 diluida 1:10, y posteriormente, aplicarles los tratamientos de estrés; el orden en que los tratamientos disminuyeron la supervivencia de los esclerocios fue: NaOCl > arena con glucosa > arena inundada y arena a capacidad de campo.

 

Literatura citada

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