Notas de investigación

 

Competencia entre aislamientos de Septoria tritici Rog. Ex. Desm., en trigos harineros (Triticum aestivum L.)*

 

Competition between isolates of Septoria tritici Rog. Ex Desm. in bread wheat (Triticum aestivum L.)

 

Santos Gerardo Leyva Mir^1§, Emma Zavaleta Mejía², Lucy Gilchrists Saavedra³, Mireille Khairallah³ y Luis Antonio Mariscal Amaro⁴

 

¹ Universidad Autónoma Chapingo. Carretera México-Texcoco, km 38.5. C. P. 56230. Estado de México. Tel. 9521500. Ext. 6179. ^§Autor para correspondencia: lsantos@correo.chapingo.mx.

² Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, C. P. 56230. Montecillo, Estado de México.

³ Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo, Carretera México-Veracruz, km 45. El Batán, 56130, Texcoco, Estado de México.

⁴ Campo Experimental Bajío-INIFAP. Carretera Celaya-San Miguel de Allende, km 6.5. C. P. 38110. Tel (461)6115323.

 

*Recibido: julio de 2012
Aceptado: marzo de 2013

 

Resumen

Para la obtención de genotipos de trigo resistentes a Septoria tritici se hacen inoculaciones con diferentes aislamientos; sin embargo, existe evidencia de competencia entre estos que sobrevalua la respuesta de resistencia de los genotipos. Para comprobar esto, el objetivo de este estudio fue probar tres genotipos de trigo con diferente nivel de resistencia a éste hongo inoculado con aislamiento, P8, P9 y B1, individuales y en mezclas. El experimento se estableció en 2006 bajo un diseño de parcelas divididas con tres repeticiones. Se recolectaron picnidios de la hoja bandera y de la hoja inferior para identificar, mediante RFLP's, los aislamientos que se establecieron y prevalecieron en los diferentes genotipos. Cuando P8, P9 y B1 se inocularon individualmente se recuperó al aislamiento original; cuando se inocularon mezclados no se reaisló P9, evidenciando la competencia entre aislamientos y la baja agresividad de P9. B1 tuvo la frecuencia de recuperación más alta. Con B1 y P8 se reaislaron variantes genéticas cuya presencia fue influenciada por el genotipo de trigo y los aislamientos con que se mezclaron. Debido a que la competencia puede reducir la agresividad y la patogenicidad de los aislamientos inoculados en mezcla, la mejor estrategia en los programas de mejoramiento de trigo para seleccionar resistencia, es la inoculación individual de aislamientos.

Palabras claves: agresividad, competencia, picnidios, variantes genéticas.

 

Abstract

Inoculations with different isolates are done to obtain wheat genotypes resistant to Septoria tritici; however, there is evidence of competition between the isolates that overestimates the resistance response of the genotypes. To check this, the aim of this study was to test three wheat genotypes with different levels of resistance to this fungus, which was inoculated with isolates P8, P9 and B1, individually and in mixtures. The experiment was established in 2006 under a split plot design with three replicates. Pycnidia were collected from the flag leaf and the lower leaf to identify, using RFLPs, the isolates that established and prevailed in the different genotypes. When P8, P9 and B1 were inoculated individually, the original isolate was recovered; when they were inoculated in mixture, P9 was not re-isolated, which evidenced the competition between the isolates and the low aggressiveness of P9.B1 had the highest recovery rate. With B1 and P8, genetic variants were reisolated whose presence was influenced by the wheat genotype and the isolates with which they were mixed. Because competition can reduce the aggressiveness and pathogenicity of the isolates inoculated in mixture, the best strategy in wheat breeding programs to select resistance is to inoculate the isolates individually.

Key words: aggressiveness, competition, genetic variants, pycnidia.

 

El tizón del trigo causado por S. tritici afecta la producción de este cereal en zonas lluviosas y frías, atacando genotipos enanos y de alto rendimiento. Los factores determinantes del hongo para la penetración y colonización del hospedante son alta humedad relativa y temperaturas de 15-22 °C (Chungu et al., 2001). Los programas de mejoramiento genético de trigo para obtener resistencia a S. tritici inoculan con una mezcla de aislamientos del hongo para ampliar la representación de su variación patogénica y la respuesta de los cultivares de trigo; sin embargo, mediante RFLP's, McDonald et al. (1995), Linde et al. (2002) y Cohen et al. (2000) encontraron variación genética del hongo; mientras que otros investigadores han encontrado evidencia de interacciones y competencia entre aislamientos del hongo y genotipos de trigo (Kema et al., 1996; Cárdenas et al., 2003; Leyva et al., 2008b; Simón et al., 2012). Por otro lado, investigadores(as) (Zelikovitch y Eyal, 1991; Zelikovitch et al., 1992; Gilchrist y Velázquez, 1994; Cárdenas et al., 2003) reportaron que en S. tritici la inoculación con mezclas de aislamientos reduce significativamente la producción de picnidios en comparación con inoculaciones individuales. Zelikovitch y Eyal (1991) observaron que S. tritici produce metil-3, indolcarboxilato, un inhibidor de la formación de picnidios e involucrado en la regulación de los síntomas del hospedante. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue observar la competencia entre aislamientos de S. tritici en tres genotipos de trigo y caracterizar los diferentes aislamientos del hongo mediante RFLP's.

Aislamientos del patógeno. Se usaron tres aislamientos de S. tritici con diferente virulencia y origen: P8 el más virulento y P9 menos virulento, de Pátzcuaro, Mich.; y B1, de virulencia similar a P8, de Atizapán, México (Leyva et al., 2008a).

Hospedero. Los genotipos de trigo TRAP#1/BOW y SUZ6//ALONDRA/PAVON resistentes a S. tritici, y el susceptible KAUZ (Gilchrist y Velázquez, 1994) fueron sembrados en el ciclo primavera-verano 2006 en CIMMYT, Toluca, México. El diseño experimental fue de parcelas divididas con tres repeticiones, la parcela grande fueron los siete tratamientos, P8, P9, B1, P8×P9, P8×B1, P9×B1 y P9×P8×B1; y las parcelas pequeñas los tres genotipos de trigo. La parcela experimental fueron tres surcos de 0.80×3 m de longitud. Las prácticas agronómicas fueron las que se realizan en siembras comerciales de la región.

Inoculación y reaislamiento del hongo. Se realizó con los siete tratamientos, mezclándose según Zelikovitch y Eyal (1991) una hora antes de realizar la inoculación para mantener viables los conidios, agregándoles Tween20^® (0.5). Las plantas se inocularon en etapa de amacollamiento con una aspersora de ultra bajo volumen, con presencia de lluvia para asegurar 18 h de HR al 100%, la concentración fue de 1×10⁶ esporas mL^-1. En cada repetición se marcaron al azar seis plantas de cada genotipo. Cuando los aislamientos inoculados se establecieron y el hongo avanzó en sentido vertical a partes superiores de la planta, en etapa de grano masoso se colectó la hoja bandera en el genotipo susceptible, y la hoja inferior a ésta en los genotipos resistentes, de las seis plantas marcadas. Las hojas se etiquetaron y conservaron a 5 °C.

Las hojas se desinfestaron por 15 s en etanol (70%) y 90 s en hipoclorito de sodio (0.5%), el tejido se mantuvo en cámara húmeda por 12 h a temperatura ambiente para inducir la formación de cirrus en cada picnidio. Por medio de un conteo previo de la densidad de picnidios × área foliar de la hoja bandera y hoja inferior, se determinó el tamaño de muestra, seleccionándose los picnidios por medio de un muestreo aleatorio (Cochran, 1980). De cada tratamiento de aislamiento individual se tomaron dos picnidios por hoja, en las mezclas de dos aislamientos cuatro picnidios, y en la mezcla de los tres aislamientos ocho picnidios. El cirrus de cada picnidio se transfirió a una caja Petri con medio LMSA.

Multiplicación de aislamientos. Se caracterizaron 468 aislamientos a partir de los picnidios individuales, 36 para cada tratamiento individual, 72 para cada tratamiento de P8×P9, P8×B1 y P9×B1, y 144 para P9×P8×B1; más los tres aislamientos originales. Para obtener 3 g de tejido fungoso se cultivaron los aislamientos en medio de cultivo líquido por 7 d en movimiento continuo a 150 rpm a temperatura ambiente. El hongo formó bolas de micelio y esporas, se extrajo el micelio por centrifugación a 1 900 g por 15 min, se congeló con nitrógeno líquido y se pulverizó en un mortero.

Extracción, cuantificación y digestión de DNA. Los tres procedimientos se hicieron de acuerdo al protocolo para especies vegetales de CIMMYT (CIMMYT, 2006). Para la digestión se utilizaron las endonucleasas: EcoRI, EcoRV, HindIII y BamIII.

Electroforesis. Los fragmentos de DNA se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 0.7% (SeaKem agarose FMC Bio Productor), de 20 x 25 cm, utilizando dos peines y un amortiguador a 0.03 V/cm por 22 h. Se tiñó el gel con bromuro de etidio y se visualizó bajo luz UV.

Transferencia. Para este procedimiento se siguió el protocolo citado por CIMMYT, (2006). Se transfirió el DNA cortado a una membrana de nylon (MS Magnagraph Nylon Membrane), utilizando un amortiguador de transferencia por 20 h, según la técnica Southern. Después de las 20 h, la membrana se remojó en citrato sódico salino por 15 min, se secó por 10 min y luego se fijó el DNA en la membrana con luz UV (120 000 µjoules). Se puso la membrana a hornear a 95 °C 3 h, y se almacenó a 4 °C.

Sondas. Se utilizaron ocho clones de plásmidos de Escherichia coli con fragmentos al azar de DNA de diferente tamaño. Se utilizaron los clones que permitieron separar los aislamientos de S. tritici. El marcaje de sondas se hizo con la técnica de nick translation (McDonald y Martínez, 1990) utilizando digoxigenina al 2.5%.

Hibridación y detección. Se realizó con la metodología de quimioluminiscencia citada por CIMMYT (2006). Las membranas se reusaron de tres a cuatro veces lavándolas para quitar todo vestigio de la sonda anteriormente hibridada utilizando SSC 0.1 X y SDS al 0.01% a 82 °C por 4 min.

Análisis de datos. Los datos de las bandas de los 468 aislamientos se observaron y compararon con los patrones de los aislamientos originales P9, P8 y B1. Se registró la presencia o ausencia de cada uno de los aislamientos y se contabilizaron las bandas de algunos reaislamientos provenientes de campo. Con la frecuencia de aislamientos de picnidios por hoja se hizo un análisis de varianza y prueba de Tukey (Martínez, 1988) incluyendo el porcentaje de recuperación de los aislamientos originales y sus variantes.

Las inoculaciones en trigo fueron inóculo primario de S. tritici que se presentó en hoja bandera en la variedad susceptible KAUZ, y en la hoja inferior en los genotipos resistentes. Las sondas PSTL192, PSTL70 y las enzimas EcoRI y EcoRII mostraron mayores polimorfismos, permitiendo diferenciar los tres aislamientos de S. tritici; se usó la combinación PSTL70 y EcoRI para la identificación del hongo, coincidiendo con McDonald y Martínez (1990), donde esta combinación permitió una adecuada separación de aislamientos. De los 468 aislamientos procesados por RFLP's, los primeros correspondieron a los aislamientos originales P8, P9 y B1. Las variantes de P8 y B1 se evidenciaron por cambios en el bandeado en el DNA; esta variación genética entre aislamientos de S. tritici ha sido atribuida a la presencia de la fase sexual del hongo; sin embargo, esta variación puede resultar de parasexualidad entre núcleos del micelio (McDonald et al., 1995); este fenómeno, en este estudio, pudo ser el responsable de la variación, ya que la fase sexual no se ha detectado en México.

La rápida variación en el genoma, como lo observado en este estudio se ha reportado también por Kabbage et al. (2008). Las tres variantes del aislamiento P8 fueron P8*1, P8*2, P8*3 y P8*1-2; de B1 fueron: B1*1, B1*2 y B1*3. En el Cuadro 1 se observa que los aislamientos inoculados de forma individual se recuperaron 100%. P9 se reparó 100% en dos genotipos, en KAUZ se recobró 91%. De las inoculaciones de P8×P9 el 88 y 100% de reaislamientos en los tres genotipos correspondió a P8 sin recuperar a P9. En P8×B1, P8 se aisló en 42 y 84%; B1 se aisló en 100, 58 y 16%, y varió dependiendo del genotipo de trigo. En P9×B1, 86 y 99% de reaislamientos correspondieron a B1 y al igual que en P8×P9 no se recuperó P9. La prevalencia de B1 y P8 en mezclas dependió de la combinación de los aislamientos y del genotipo. Con la mezcla de los tres aislamientos solamente se recuperaron B1 (48, 93 y 91%) y P8 (52, 7 y 9%) según el genotipo, sin recuperar a P9.

Lo anterior claramente evidencia la competencia entre aislamientos, sugiriendo que P9 fue menos agresivo. Asimismo, los resultados sugieren que P8 fue menos agresivo que B1, dado que la frecuencia de recuperación de B1 fue más alta (16 a 100%) que la de P8 (7 a 100%) cuando ambos aislamientos estuvieron en mezcla (Cuadro 1). La prevalencia de B1 indica que este aislamiento fue el más agresivo. La existencia de competencia entre aislamientos, cuando se realizan inoculaciones con mezclas, ha sido previamente señalada por otros investigadores (Zelikovitch y Eyal, 1991; Eyal, 1992; Gilchrist y Velázquez, 1994; Linde et al., 2002).

El análisis de varianza indicó interacciones entre aislamientos y genotipos (datos no publicados). En todos los casos, con excepción de las variantes P8*1 y P8*1,2, la interacción aislamiento×genotipo fue significativa. Según el análisis, los genotipos de trigo influyeron de manera significativa en la presencia de los aislamientos y las variantes P8, B1*1, B1*2, P8*2 y P8*3. Con P9 y P8 inoculados individualmente no se presentó ninguna variación en los reaislamientos recuperados. Con la inoculación individual de B1 se reaislaron las variantes, B1*1 en 5% y B1*2 en 8% y el resto, 86%, fue del aislamiento B1 original.

En la mezcla de P8×P9 la variante P8*1 se reaisló 15%, P8*2; 5% y P8*1, 2; 7%; el resto fue del P8 original. En P8×B1 se detectaron con baja frecuencia las variantes B1*1, 1%, B1*3, 4%, P8*1, 1%, y con frecuencia de 40 y 53% los aislamientos P8 y B1. En P9×B1 las variantes que se aislaron fueron P8*1, 1%, P8*3, 10%, y B1 y P8 con una frecuencia de 80 y 8%, no se detectaron variantes con la mezcla de los tres aislamientos. El genotipo de trigo influyó en la presencia de variantes del hongo, en SUZ6//ALONDRA/PAVON sólo se desarrollaron las variantes de P8, en KAUZ y TRAP#1/BOW se aislaron variantes de P8 y B1 (Cuadro 2). La frecuencia más alta de reaislamientos correspondió a B1 (48 a 56%) (Cuadro 2). En aislamientos × genotipo (Cuadro 2), el aislamiento B1 fue el más prevalente (48 a 56%) independientemente del genotipo inoculado; seguido de P8 (30 a 35%), en este caso, la máxima recuperación de P9 fue 8%.

La frecuencia de recuperación de variantes de B1 y P8 fue influenciada por la combinación de los aislamientos en la mezcla y por el genotipo de trigo (Cuadro 3). La agresividad de los aislamientos dependió del genotipo en el que se inoculó la mezcla, por ejemplo, la variante P8*1 fue aislada con una frecuencia alta (13 a 17%) en los tres genotipos de trigo cuando éstos fueron inoculados con P9×P8, pero su frecuencia fue baja (4%) o nula cuando se inoculó con P8×B1.

Fue evidente que la prevalencia de B1 y P8 fue influenciada por los genotipos de trigo. McDonald y Martínez (1990) detectaron gran variación genética entre aislamientos de S. tritici señalando que esta variabilidad dar lugar a nuevos aislamientos capaces de sobrepasar la resistencia en variedades resistentes ó capaces de resistir el efecto de los fungicidas. Sin embargo, debe hacerse hincapié en que las variaciones detectadas en el DNA de los reaislamientos del hongo no necesariamente están relacionadas con cambios en virulencia o agresividad.

Las variantes genéticas de los aislamientos originalmente inoculados solamente se detectaron en los dos aislamientos más agresivos, B1 y P8, y las variantes de P8 únicamente se presentaron en inoculaciones de mezclas de dos aislamientos. En contraste las variantes de B1 solamente se presentaron cuando se inoculó sólo o en combinación con P8. La variación genética observada en las cepas reaisladas fue influenciada por el genotipo de trigo y por la combinación en las mezclas inoculadas. El genotipo SUZ6//ALONDRA/PAVÓN considerado el más resistente fue el que menos variantes indujo.

Cada hospedante ejerció diferente grado de presión de selección dependiendo del aislamiento con el cual interaccionó; asimismo, la presión de selección ejercida por la competencia dependió de la combinación de aislamientos y del efecto de la interacción hospedante-aislamiento. Las pruebas de selección de genotipos de trigo resistentes a S. tritici con inoculaciones de mezclas de aislamientos de este hongo propician el riesgo de sobrevaluar las respuestas de resistencia, debido a que la competencia puede reducir la agresividad y la patogenicidad de los aislamientos inoculados en la mezcla. Por lo tanto, la mejor estrategia en los programas de mejoramiento de trigo es inocular individualmente los aislamientos seleccionados como altamente patogénicos en una fase avanzada de selección.

 

Literatura citada

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