Artículo

 

Haplotipos del parasitoide Tamarixia radiata (Waterston) (Hymenoptera: Eulophidae) en los cítricos del estado de Tamaulipas, México*

 

Haplotypes of parasitoid Tamarixia radiata (Waterston) (Hymenoptera: Eulophidae) in citrus in the state of Tamaulipas, Mexico

 

Kenzy Ivveth Peña-Carrillo¹§, Alejandro González-Hernández², José Isabel López-Arroyo¹ y Sostenes Varela-Fuentes³

 

¹ Campo Experimental General Terán-INIFAP. Carretera Montemorelos-China km 31, Nuevo León, México C. P. 67400. §Autora para correspondencia: pena.kenzy@inifap.gob.mx.

² Universidad Autónoma de Nuevo León, Av. Pedro de Alba, Manuel L. Barragán, s/n, Cd. Universitaria, C. P. 66450, San Nicolás de los Garza, Nuevo León, México. (lopez.jose@inifap.gob.mx). (alejandro.gonzalezhd@uanl.edu.mx / agonzahdz@gmail.com).

³ Facultad de Ingeniería y Ciencias, Universidad Autónoma de Tamaulipas, C. P. 87194, Cd., Victoria Tamaulipas, México. (svarela@uat.edu.mx). Tel: 01 834 318 17 21. Ext. 212.

 

* Recibido: agosto de 2013.
Aceptado: febrero de 2014.

 

Resumen

Tamarixia radiata (Waterston) (Hymenoptera: Eulophidae) es un ectoparasitoide específico de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) vector de Candidatus Liberibacter spp., el agente causal del Huanglongbing, una enfermedad devastadora de los cítricos a nivel mundial. El parasitoide se introdujo accidentalmente a diversas regiones del continente Americano, entre ellas México, en donde actualmente es reproducido masivamente y liberado. Como contribución al conocimiento del uso de las poblaciones silvestres del parasitoide en beneficio de la citricultura mexicana, el objetivo del presente estudio fue caracterizar genéticamente poblaciones de T. radiata en el estado de Tamaulipas, México; mediante secuenciación de ADN mitocondrial (gen de la citocromo oxidasa subunidad 1) analizando muestras del parasitoide colectadas durante los años 2006-2013. De los especímenes obtenidos se encontraron dos haplotipos (H1 y H2) de los cuales el H1 se ha encontrado en la mayor parte de las zonas citrícolas infestadas por D. citri en México, mientras que el H2 sólo ha sido detectado hasta el momento en los estados de Tamaulipas y Yucatán. La distribución limitada del H2 sugiere las posibles entradas del parasitoide a México, lo cual es apoyado por el agrupamiento del H2 en el análisis estadístico de parsimonia con haplotipos que hasta el momento sólo se han encontrado en Florida.

Palabras clave: Diaphorina citri, control biológico, haplotipo, Parasitoide.

 

Abstract

Tamarixia radiata (Waterston) (Hymenoptera: Eulophidae) is a specific ectoparasite of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) vector of Candidatus Liberibacter spp., the causative agent of Huanglongbing, a devastating disease of citrus worldwide. The parasitoid was accidentally introduced to various regions of the Americas, including Mexico, where currently it is massively reproduced and released. Contributing to the knowledge of parasitoid wild populations use to benefit the Mexican citrus industry, this study aimed to genetically characterize T. radiate populations in the state of Tamaulipas, Mexico, by sequencing mitochondrial DNA (cytochrome oxidase subunit 1 gene), analyzing parasitoid samples collected during the years 2006-2013. From the specimens two haplotypes (H1 and H2) were found, from which H1 is present in most citrus areas infested by D. citri in Mexico, while H2 has only been detected so far in the states of Tamaulipas and Yucatán. The limited distribution ofH2 suggests the possible entries of the parasitoid to Mexico, which is supported by the clustering of H2 in the statistical parsimony analysis with haplotypes only found in Florida so far.

Keywords: Diaphorina citri, biological control, haplotype, parasitoid.

 

Introducción

Tamarixia radiata (Waterston) (Hymenoptera: Eulophidae) es un ectoparasitoide ninfal del psílido asiático de los cítricos, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liividae) (Étienne andAubert, 1980), vector de la bacteria Candidatus Liberibacter spp., el agente putativo de la enfermedad Huanglongbing (HLB), la plaga más devastadora de los cítricos a nivel mundial (da Graca, 1991; da Graca and Korsten, 2004; Halbert and Manjunath, 2004; Bové, 2006). El parasitoide es considerado como uno de los principales agentes de control biológico del vector, debido a que su capacidad de parasitismo y disminución de las poblaciones de D. citri han sido notables en las diversas partes del mundo a donde se ha introducido como parte de programas de control biológico del psílido asiático de los cítricos (Etienne and Aubert, 1980; Quilici, 1986; Chiu et al, 1988; Hoy et al., 1999; Étienne et al, 2001).

En México, T. radiata se ha presentado de forma accidental al igual que en Argentina (Cáceres y Aguirre, 2005; Lizondo et al., 2007), Brasil (Gómez-Torres et al., 2006), Colombia (Kondo et al., 2012), Cuba (González et al., 2005), Puerto Rico (Pluke et al, 2008), Texas (French et al., 2001) y Venezuela (Barr et al., 2009). En México, durante el año 2003, se encontró por primera vez un parasitoide del género Tamarixia en ninfas de D. citri colectadas en el estado de Tamaulipas (Coronado-Blanco et al., 2003). Posteriormente, en el año 2009, se registró la presencia de T. radiata en colectas de Colima, Michoacán, Nuevo León, Sinaloa, Sonora y Tamaulipas, las cuales fueron efectuadas durante los años 2005 a 2008 (González-Hernández et al., 2009).

En el año 2010 se inició el análisis de la diversidad genética del parasitoide en México, mediante el uso de las regiones ITS1, ITS2 y citocromo oxidasa subunidad I (COI) (González Hernández et al., 2010a, b); mediante este último gen se identificó la existencia de cinco haplotipos distribuidos en los estados de Campeche, Colima, Jalisco, Michoacán, Nuevo León, Oaxaca, Quintana Roo, San Luis Potosí, Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tamaulipas, Veracruz y Yucatán. Recientemente, Peña-Carrillo (2012) indica que en el estado de Tamaulipas se encuentran dos de los cinco haplotipos (H1 y H2) registrados por González-Hernández et al. (2010a), mientras que en los estados de Colima, Michoacán y Nuevo León, sólo se ha encontrado el H1. Los haplotipos H1 y H2 localizados en México, son los mismos que se presentan en las poblaciones de Taiwán y sur de Vietnam, que han sido importadas y liberadas en los Estados Unidos de América (EUA) para el control de D. citri (Hoy and Nguyen, 2000; Skelley and Hoy, 2004; Barr et al, 2009) y cuya presencia ha sido registrada en Florida y Texas (EUA) (Barr et al., 2009; De León and Setamou, 2010).

Debido al hallazgo de individuos con H2 en Tamaulipas (Peña-Carrillo, 2012), en la presente investigación se expandió el análisis de los haplotipos de esta región del noreste de México, con el objetivo de indagar la existencia de haplotipos propios de poblaciones locales, las cuales podrían ser útiles para el mejoramiento de las estrategias de control biológico de D. citri en el país. El conocimiento de la abundancia, frecuencia y dominancia de los haplotipos pueden ser indicativos de su adaptación a diferentes ambientes, y por ende contribuirá a un mejor manejo del vector de la enfermedad HLB en México.

 

Materiales y métodos

Los parasitoides utilizados durante la presente investigación provienen de recolectas de campo realizadas entre los meses de febrero-noviembre de los años 2006-2012 y primer semestre de 2013 en la zona citrícola del estado de Tamaulipas, así como plantas rutáceas del área urbana de Cd. Victoria, y Matamoros (Cuadro 1). Los especímenes se capturaron mediante red de golpeo y algunos se obtuvieron a partir de brotes infestados con ninfas de D. citri de tercer a quinto instar, parasitadas y mantenidas en cajas Petri de plástico a temperatura ambiente. Este material fue revisado diariamente durante dos semanas; los parasitoides emergidos se recolectaron con aspirador bucal y se conservaron en alcohol al 96%. Se seleccionó un total de 56 ejemplares distribuidos en los municipios de Güémez (recolectas del año 2006), Hidalgo (2006, 2007, 2011), Matamoros (2013), Reynosa (2013), San Fernando (2013) y Victoria (2007, 2008, 2010) (Figura 1), a partir de los cuales se aisló su ADN de manera individual y posteriormente se amplificó, se envió a secuenciar y se determinó a que haplotipo pertenecen.

Para lograr la extracción de ácidos nucleicos se empleó el kit de extracción Pure Link Genomic DNA (Invitrogen, Carisbad, CA, USA); el ADN resultante se mantuvo a -20 °C hasta su uso. Posteriormente, mediante la técnica de PCR punto final se amplificó un fragmento del gen mitocondrial citocromo oxidasa subunidad I (COI) de igual forma a los estudios reportados por Barr et al. (2009), De León and Setamou (2010), González-Hernández et al. (2009) y Peña-Carrillo (2012); donde se utilizaron los oligonucleótidos CI-J-1718 (forward) y C1-N-2191 (reverse) diseñados por Simon et al. (1994).

Las reacciones de PCR se prepararon de acuerdo a las concentraciones: Buffer 1x, dNTP's [2 mM], MgCl2 [2 Mm], oligonucleótidos 100 ng/μl, 1U de Taq polimerasa, y se realizaron de acuerdo a las siguientes condiciones: un ciclo de 94 °C-3 min.; 40 ciclos a 94 °C-20 seg.; 48 °C-20 seg.; 72 °C-40 seg.; y un ciclo adicional de extensión a 72 °C-10 min. Los productos obtenidos se visualizaron en gel de agarosa (2%) para la identificación del fragmento amplificado (550 pb aprox.), se compararon con un marcador de peso molecular (100-2200 pb) y posteriormente fueron enviados a la compañía Macrogen EUA., para su secuenciación en ambos sentidos.

Las secuencias de ADN obtenidas se alinearon y compararon en el programa MEGA 5 (Tamura et al., 2011) en donde se identificaron los puntos de mutación (haplotipos), acto seguido se determinó la distancia genética existente entre los haplotipos resultantes y con el mismo programa se realizó un árbol filogenético de Neighbor-Joining, inferido con el modelo Tamura-3-parametros; se incluyó la especie hermana Tamarixia triozae (Burks) Hymenoptera: Eulophidae, (número de acceso a gene bank, GQ912291.1) y Gonatocerus metanotalis (Ogloblin) (Hymenoptera: Mymaridae) (De Leon and Setamou, 2010; De León et al, 2008, número de acceso a Gene Bank DQ922724.1) como grupos de referencia para señalar que las relaciones entre haplotipos son a nivel intraespecífico. Adicionalmente las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias disponibles en Gene Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), procedentes de los estudios de Barr et al. (2009) (Números de acceso GQ401914.1, GQ401916.1, GQ401918.1, GQ401920.1, GQ401921.1, GQ401870.1, GQ401875.1, GQ401880.1), De León and Setamou, (2010) (FJ807949.1, GQ912272.1-GQ912274.1, GQ912280.1-GQ912283.1), y secuencias proporcionadas por González-Hernández et al. (2009), las cuales también se incluyeron en el árbol filogenético y se distinguen por la presencia de (*), (**) y (***) respectivamente. Finalmente, con el programa TCS (Clement et al., 2000) se estimó la estructura filogenética de los haplotipos, estimada con un análisis de redes de parsimonia con 95% de límite de conexión a partir de las diferencias nucleotídicas entre las secuencias.

 

Resultados

Se identificaron dos haplotipos los cuales corresponden a transiciones y transversiones (Cuadro 2), cada uno con una distancia genética de 0.112 diferencias por sitio en comparación con la especie hermana T. triozae, mientras que la distancia genética entre los haplotipos 1 y 2 fue de 0.005 (diferencias por sitio). La distancia genética que existe entre los haplotipos de T. radiata se observa reflejada en el árbol filogenético (Cuadro 3), la cual permite la separación de los haplotipos en ramas distintas. En el árbol se distinguen con números las muestras provenientes de Güémez (#2, 3, 21, 22, 55, 56), Hidalgo (#1, 4-6, 11-14, 38-47), Matamoros (#28-32, 35-37), Reynosa (#34, 48), San Fernando (#33) y Victoria (#7-10, 15-19, 23-27, 49-54) (Figura 2).

En la red de haplotipos (Figura 3) las diferencias nucleotídicas o mutaciones se encuentran representadas por líneas y algunos haplotipos hipotéticos derivados de las diferencias mutacionales se encuentran representados por puntos negros; los haplotipos existentes se encuentran delimitados por los círculos blancos. En la red se demuestra que posiblemente la mayoría de los haplotipos encontrados enAmérica descienden del H1, con excepción del H5 de De León and Setamou (2010) que se encuentratotalmente aislado. Los cambios nucleotídicos separan al H2 del resto y lo ubican en un grupo formado con los haplotipos H3 de Barr et al. (2009) y H1 de De León and Setamou (2010) encontrados hasta el momento solo en Florida. Al igual que H2, el H6 de Barr et al. (2009) encontrado en Isla Guadeloupe y Puerto Rico se encuentra separado.

Además de inferir las relaciones filogenéticas de los haplotipos, se realizó una comparación cronológica de su orden de aparición en México y Estados Unidos de América basada en el año de recolecta de los ejemplares y publicación de la información, la cual se muestra a continuación (Barr et al., 2009; De León and Setamou, 2010; González-Hernández et al., 2010a, b) (Cuadro 4).

 

Discusión

Aun cuando la prescencia de Tamarixia sp. en territorio del estado de Tamaulipas se remonte al año 2003 (Coronado-Blaneo et al, 2003), el primer informe de haplotipos de la especie en dicha región se realizó a partir de muestras del año 2010 (González-Hernández et al, 2010a), donde solo se indicó la presencia del H1. Con el presente estudio, ahora se enfatiza la presencia y persistencia del H2 en Tamaulipas, al encontrarlo en muestras recolectadas durante los años 2006, 2007, 2010 y 2013 (Cuadros 1, 4). Las muestras del año 2006 representan los registros de haplotipos más antiguos hasta el momento para México, y se eentran en Tamaulipas. Al comparar la distribución del H2 en el estado y diversas áreas de EE. UU., es posible considerar una ruta probable de entrada al pais.

De acuerdo a los primeros informes del H2 en el Continente Amerieano, éste se encontró en muestras de Florida (EE. UU.) de 2004 (Barr et al., 2009) y posteriormente en Texas, EE.UU., y México (Güémez, Tamalipas) en el 2006 (De León y Setamou, 2010), en 2007 se encontró en los municipios de Güémez y Victoria, Tamaulipas., y en 2013 en Reynosa, Tamaulipas (Figura 1). Al agrupar el H2 con haplotipos que hasta el momento solo se han encontrado en Florida, la posible historia evolutiva de los haplotipos que se encuentra representada en la red de parsimonia (Figura 3) apoya la idea de que Tamaulipas ha sido una entrada probable del parasitoide a México. Cabe destacar que a diferencia del H2, el resto de los haplotipos encontrados en México (H3, H4 y H5) por González-Hernández et al. (2010a) derivan directamente del H1, y solo los H3 y H4 se encuentran agrupados demostrando relaciones filogenéticas cercanas.

Además de la separación del H2, el hecho de haberlo encontrado con mayor frecuencia en Florida (Barr et al., 2009), y que en México su distribución se ha limitado a los estados de Tamaulipas, y Yucatán, sugiere las posibles rutas de dispersión que ha mostrado el parasitoide desde el noreste y sureste del pais. Además, es importante señalar que la distribución aparentemente localizada y persistente del H2 en Tamaulipas, podria estar asociada a condiciones microclimáticas o de nicho, determinantes para el desarrollo de las poblaciones en las que se encuentra dicho haplotipo (Rodriguez-Trelles et al, 1998; Miehalak et al, 2001; Roslin et al., 2009; MeGaughran et al., 2010). Estudios subsecuentes en los que se consideré un mayor numero de muestras y áreas de colecta serán necesarios para evaluar estas hipótesis, asi como el posible ensamblaje de los diferentes haplotipos en la región y su impacto en las poblaciones del vector del HLB.

 

Agradecimientos

Los fondos para la realización de la presente investigación fueron provistos por el proyecto FONSEC SAGARPA-CONACYT número 2009-108591. Se agradece al M. C. Hugo Arredondo Bernal el habernos proporcionado ejemplares de T. radiata.

 

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