Artículos

 

Efectividad in vitro de Bacillus y polifenoles de plantas nativas de México sobre Rhizoctonia-Solani*

 

In vitro effectiveness of Bacillus and polyphenols of native plants from Mexico on Rhizoctonia-Solani

 

Francisco Castillo-Reyes¹, Francisco Daniel Hernández-Castillo^2§, Gabriel Gallegos-Morales², Alberto Flores-Olivas², Raúl Rodríguez-Herrera³ y Cristóbal N. Aguilar³

 

¹ Campo Experimental Saltillo-INIFAP. Carretera Saltillo-Zacatecas, km 342+119, Núm. 9515, Buenavista, Saltillo, Coahuila. C. P. 25315. (reyes.francisco@inifap.gob.mx).

² Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro-Departamento de Parasitología. Buenavista, Saltillo, Coahuila. (fdanielhc@hotmail.com; ggalmor@uaaan.mx.; afloli@.uaaan). Tel: 52 844 411 03 26, fax: +52 844 411 0226. ^§Autor para correspondencia: fdanielhc@hotmail.com.

³ Universidad Autónoma de Coahuila-Departamento de Investigación en alimentos, Facultad de Ciencias Químicas, 25000. Saltillo, Coahuila, México.

 

* Recibido: septiembre de 2014
Aceptado: enero de 2015

 

Resumen

Con el objetivo de encontrar alternativas para el manejo de patógenos que provocan enfermedades en el sistema radical de las plantas se evaluó el efecto in vitro de bacterias antagonista del género Bacillus aisladas de la rizosfera y de extractos etanolicos de plantas de las especies Larrea tridentata, Flourensia cernua, Opuntia ficus-indica, Agave lechuguilla y Yucca filifera endémicas del desierto Chihuahuense contra el fitopatógeno Rhizoctonia solani. Las bacterias se obtuvieron de la forma esporulada, una suspensión de suelo se calentó 15 min 80 °C para eliminar formas no esporuladas. Los extractos vegetales se obtuvieron por infusión. Como resultado se encontró que las cepas de Bacillus aislados presentan un efecto antagonista in vitro sobre la inhibición micelial de Rhizoctonia solani desde 40 a 67%. La caracterización por secuenciación del gen 16S del ADNr se determinó que los aislamientos pertenecen a las especies de B. subtilis, B. pumilus y a B. atrophaeus, quienes están reportadas con efecto antagónico sobre organismos fitopatógenos. Para el caso de los extractos se encontró un efecto en la inhibición micelial hasta 100% en su mayoría todos los extractos inhibieron el crecimiento del micelio de R. solani al 100% excepto el extracto de Y. filifera que solo tuvo 46% con la dosis más alta evaluada (3 000 ppm). Los extractos de F. cernua muestran que a 160 ppm de polifenoles totales se inhibe completamente a R. solani.

Palabras clave: Rhizoctonia solani, antagonismo, bacterias, extractos, extracto vegetal, inhibición micelial, rizosfera.

 

Abstract

In order to find alternatives for pathogen management causing diseases in the root system of plants, was evaluated the in vitro effect of antagonistic bacteria of the genus Bacillus isolated from rhizosphere and from ethanolic extracts of plants species Larrea tridentata, Flourensia cernua, Opuntia ficus-indica, Agave lechuguilla and Yucca filifera, that are endemic from the Chihuahua desert against plant pathogen Rhizoctonia solani. Bacteria were obtained as spore form; a soil suspension was heated for 15 min at 80 °C to remove non-sporulating forms. Plant extracts were obtained by infusion. As a result it was found that strains of Bacillus isolates have an in vitro antagonistic effect on mycelia inhibition of Rhizoctonia solani from 40 to 67%. The characterization 16S rDNA gene sequencing determined that the isolates belong to the species of B. subtilis, B. pumilus and B. atrophaeus, that are reported with antagonistic effect on plant pathogenic organisms. In the case of extracts, an effect on mycelial inhibition of up to 100% was found; most extracts inhibited micelial growth of R. solani at 100% except for Y. filifera extract that only obtained 46% with the highest dose evaluated (3 000 ppm). F. cernua extracts show that at 160 ppm of total polyphenols completely inhibited R. solani.

Keywords: Rhizoctonia solani, antagonism, bacteria, extracts, mycelial inhibition, plant extract, rhizosphere.

 

Introducción

Uno de los hongos que limita la producción del cultivo de papa en México es Rhizoctonia solani Kühn, la enfermedad que ocasiona es conocida como la costra negra de la papa, la que puede llegar a producir daños serios en el rendimiento y en la calidad de los tubérculos (Hernández et al., 2001). El principal control de este fitopatógeno se realiza con la aplicación de agroquímicos; sin embargo, el uso de estos productos ha originado diversos problemas debido al impacto ambiental que ocasionan, consecuencias como toxicidad al hombre, además de resistencia de ciertos patógenos (Hernández et al., 2005).

Una alternativa para disminuir el efecto de R. solani en el cultivo, es la utilización de metabolitos secundarios de plantas (polifenoles) y microorganismos antagónicos, principalmente de la bacteria del genero Bacillus considerada como uno de los agentes de control biológico más eficaces por sus propiedades en la inhibición de fitopatógenos (Sid et al., 2003; Schisler et al., 2004). En la microbiota del suelo existe una gran variedad de microorganismos, compuesta por una mezcla de actinomicetos, hongos, bacterias, protozoarios, etc., siendo mayor en la zona de la rizosfera al ser fisiológicamente más activa (Guetsky et al., 2001). El efecto antagonista que presentan ciertos grupos de hongos y bacterias contra hongos fitopatógenos de suelo es una acción que puede ser aprovechada como una forma de control biológico de patógenos en vegetales.

De esta manera los microorganismos del suelo juegan un papel crítico en la interacción planta-suelo a nivel rizosfera, tanto los patógenos como los agentes de biocontrol (López et al., 2007). En función a lo anterior, el objetivo de este estudio fue determinar el efecto antagónico in vitro de Bacillus sp. de la rizosfera y antifúngico de extractos aislados de plantas del semidesierto Chihuahuense sobre Rhizoctonia solani Kühn.

 

Materiales y métodos

Tejido vegetal. Plantas completas (hojas, tallos y raíces) de las especies Larrea tridentata, Flourensia cernua, Opuntia ficus-indica, Agave lechuguilla y Yucca filifera, se recolectaron en la región sur de Coahuila (sobre el km 27 de la carretera Saltillo-Monclova). Las muestras obtenidas se transportaron al Laboratorio de Microbiología del Departamento de Investigación en Alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Autónoma de Coahuila, en bolsas plásticas etiquetadas. Cada tejido vegetal se deshidrató al medio ambiente y en una estufa (Labnet Internacional, Inc) durante dos días a una temperatura de 60 °C; y se pulverizó en un molino (Thomas Wiley) con malla de 1mm. El pulverizado se almacenó en frascos color ámbar o botes de plástico secos a temperatura ambiente y en oscuridad.

Extracción de polifenoles (polifenoles). La extracción de polifenoles de las muestras colectadas de se llevó a cabo en una relación de 1:4 (peso/volumen solvente) por el método de infusión. En un matraz Erlenmeyer de 1 litro cubierto con aluminio para evitar la oxidación de los polifenoles por efecto de la luz, se colocó 150 gramos de muestra vegetal y 600 mL del solvente en agitación constante en un sistema de reflujo a una temperatura de 60 °C por un tiempo de 7 h. Una vez terminado el reflujo se filtró el material utilizando papel Wattman de Núm. 4 sobre un embudo Buhner con la ayuda de bomba de vacío, recolectando el filtrado en un matraz Kitasato con capacidad de 2 litros. Los extractos etanolicos obtenidos se almacenaron a 4 °C.

Cuantificación de polifenoles totales. La cuantificación se determinó por espectrofotometría usando luz UV a través de las técnicas de Makkar (1999) para polifenoles hidrolizables equivalentes a ácido gálico y la de Swain y Hillis (1959) para polifenoles condensados equivalentes a catequina. De cada extracto se preparó una dilución 1:20 (extracto: agua). De cada dilución para polifenoles condensados se colocó 0.5 ml en un tubo ensaye, y agregó 3 ml de HCL/Butanol (1:9) y 0.1 ml de reactivo Férrico 0.1 N. Por otro lado se preparó catequina en agua destilada a las concentraciones de 0, 200, 400, 600, 800 y 1 000 ppm para determinar la curva de referencia.

Los tubos se taparon fuertemente y fueron calentados por 1 h en baño María a 90 °C, después de este tiempo se dejo enfriar y se leyó la absorbancia con UV/visible a 460 nm. Para polifenoles hidrolizables, se colocaron 400 µl de muestra diluida en un tubo de ensaye, enseguida se adiciono 400 µl del reactivo comercial Folin-Ciocalteu, se agito y dejo reposar por 5 min. Después se agregó 400 µl de NaCO₃ (0.01M), y 2.5 ml de agua destilada. Por otro lado se preparo ácido gálico en agua destilada a las concentraciones de 0, 200, 400, 600, 800, 1 000 ppm, mas cada reactivo anteriormente señalado y se leyó a 725 nm de UV/visible.

 

Obtención de bacterias antagonistas

Aislamiento de cepas bacterianas. Se realizó un muestreo dirigido a la zona de la rizosfera de plantas, se colectó 100 g de suelo. Las plantas muestreadas corresponden a mezquite, nopal, maguey, gobernadora, lechuguilla y yuca. Cada muestra se registró y se trasladó al Laboratorio de Fitopatología del Departamento de Parasitología Agrícola en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN). Las muestras se procesaron individualmente para lo que se pesó un gramo de suelo con raíces y se colocó en un tubo de ensaye que contenía 9 ml de agua destilada estéril. Todos los tubos se incubaron en baño maría a una temperatura de 80 °C por 15 min, después del tiempo transcurrido se dejaron enfriar y se procedió a la inoculación de cada una de las muestras en cajas petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA), colocando 100 µL de la solución de suelo-raíz que se dispersó en toda la caja con la ayuda de una varilla de vidrio; los medios de cultivo inoculados se incubaron a 25± 1 °C.

Preselección de colonias de Bacillus sp., con efecto antagonista. Después de 12 h de incubación de los medios de cultivo, se colocó un explante de 0.5 cm con micelio de R. solani y se volvió a incubar a la misma temperatura por 48 h al termino de este tiempo se seleccionaron las colonias de bacterias que mostraron un efecto en la inhibición del crecimiento micelial de R. solani y se resembraron en una nueva caja con PDA todos aquellas colonias bacterianas que presentaron un halo de inhibición, colocando cada colonia seleccionada en cada uno de los puntos cardinales de la caja petri y enseguida se colocó un disco con micelio del hongo y se incubo a la misma temperatura. Por último se purificaron las colonias que mostraron consistentemente el halo de inhibición a R. solani en medio King de B sembrando por estría sencilla y se verificó la pureza de la colonia bacteriana. Cada aislamiento bacteriano se identificó y conservó a 4 °C. Se realizaron tinciones de Gram y tinción de endospora, para verificar que la bacteria aislada fuera gran positiva y con presencia de endospora como corresponde a el género de Bacillus.

 

Caracterización de Bacillus spp., por secuenciación de la región ribosomal 16's.

Extracción de ADN. Cada cepa a identificar se incrementó en medio líquido a base de papa- dextrosa y se incubo a 25±1 °C por 72 h. En seguida se traslado a la cámara de transferencia laminar en donde se filtro para recuperar la biomasa fungosa y se colocó en papel aluminio estéril identificado con su respectiva clave. Inmediatamente después, se agregó 400 µl de buffer TE 1X, 2.5 µl de SDS al 20% y 20 µl de proteinasa K (20 mg/ml), se mezcló por vortex y se incubó por una hora a 37 °C. Posteriormente se le agregó 1/3 del volumen total de acetato de sodio al 3.3 M y pH= 6.1 más 0.1 volumen de etanol absoluto, se dejó precipitar por 10 min a - 20 °C. Enseguida se centrifugó a 12 000 rpm durante 10 min y se separó el sobrenadante a un tuvo nuevo estéril y adicionó 0.5 ml de Fenol-cloroformo- alcohol isoamilico, se mezcló y centrifugó a 12 000 rpm por 10 min. Posteriormente se recuperó el sobrenadante y agregó 0.5 ml de isopropanol, se centrifugó a 12 000 rpm por 5 min. Después se decantó y lavó la pastilla con etanol al 70%, se dejó secar a temperatura ambiente y se suspendió en agua miliQ, por último se verificó la integridad y calidad del ADN extraído en gel de agarosa al 1%, bajo electroforesis horizontal aplicando un voltaje de 65 volts por 30 min.

Reacción en cadena de la polimerasa: una vez obtenido el ADN de las cepas bacterianas, se procedió a amplificar la región ribosomal 16S. Se realizó una mezcla de amplificación en un volumen final de 50 µl, compuesto por 14.5 de agua destilada esteril, 2.5 µl de buffer PCR (10X), 1 µl de MgCl2 (25mM), 0.5 µl de dntp's (10 mM), 2.0 µl de cada iniciador (16s FGPL 5'CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3' y 16S FGPS 5'- GGA GAG TTA GAT CTT GGC TC-3), 0.5 µl de ADN Taq-polimerasa y 1 µl de ADN. Las reacciones de amplificación se efectuaron usando un termociclador (Thermo Electron Corporation P x 2 Thermal Cycler) bajo el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C por un min, 35 ciclos a 95 °C por 1, 54 °C por 1 y 72 °C por 1 min y una extensión final de 72 °C por 5 min. Las bandas amplificadas se observaron en un gel de agarosa al 1.5 %.

Secuenciación de productos de PCR: la secuenciación se efectuó en la unidad de síntesis y secuenciación de ADN del Instituto de Biotecnología de la UNAM (USSDNA), utilizando el método de Singer. Una vez obtenidos las secuencias, se analizaron en la base de datos del GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI), usando la herramienta BLAST (Basic Local Aligment Search Tool) para secuencias altamente similares, comparando cada secuencia del gen 16S amplificado obtenidas de los aislamientos de la rizosfera (Cuadro 3), con las secuencias almacenadas en la base de datos. Cada una de las secuencias obtenidas se le depuró la parte inicial y final (20 y 5 nucleótidos) por razón de aumentar la sensibilidad del análisis.

 

Determinación del efecto anti fúngico y antagonista

Efecto antagónico de Bacillus sp. El efecto antagonista se determinó por medio de la técnica de confrontación dual entre el antagonista y el fitopatógeno. En cajas petri con medio a base de papa-dextrosa-agar, se colocó una asada de cada cepa bacteriana en los cuatro puntos cardinales de la caja, enseguida se colocó un disco con micelio de R. solani y se incubo a 25± 1 °C, hasta que el testigo sin bacteria llenara la caja petri. Se realizaron cuatro repeticiones por tratamiento. La variable medida fue el crecimiento radial del hongo confrontado con cada cepa bacteriana, el cual se transformó a por ciento de inhibición. Las diferencias en inhibición se determinaron por la prueba de medias de Tukey.

Efecto anti fúngico de los extractos polifenolicos. La evaluación de los diferentes extractos se utilizó la técnica del medio envenenado. Para ello se determinó y cuantificó el volumen de cada extracto de acuerdo a la cantidad de polifenoles totales (polifenoles condensados + polifenoles hidrolizables) presente en cada extracto y se agregó a un matraz con el volumen de agua y PDA exacto a la concentración deseada (Cuadro 1). Discos con micelio fúngico (0.4 cm) se colocaron en el centro de la caja petri quien contenía medio de cultivo PDA envenenado por extracto a diferentes concentraciones. Las cajas inoculadas se incubaron a 25±2 °C, la eficacia de los tratamientos se evaluó midiendo el crecimiento radial del hongo cuando el testigo cubrió totalmente la caja.

El valor de crecimiento (cm) se transformó a porcentaje de inhibición (P) usando como referencia al tratamiento control (sin extracto) bajo la siguiente expresión matemática: p= (C-T)/C×100, donde, C es el diámetro de la colonia sin tratamiento y T es la colonia bajo tratamiento con extracto. El experimento fue establecido bajo un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones. Se realizó un análisis Probit para determinar la concentración inhibitoria al 50% de cada extracto. Los datos se analizaron usando software SAS V8.1.

 

Resultados y discusión

Efecto de bacterias antagonistas

Distribución de cepas bacterianas en la rizosfera de plantas del semidesierto. De un total de 80 colonias aisladas se seleccionaron 14 cepas con efecto en la inhibición del crecimiento del micelio de R. solani (Cuadro 1). En la caracterización morfológica, todas las cepas presentaron forma de bacilo, tinción de Gram positiva y formación de endospora en la parte central.

Efecto de Bacillus sp en la inhibición del crecimiento del micelio de R. solani. El análisis de varianza detecto diferencias significativas (p= 0.05) en el desarrollo del micelio por efecto de las cepas bacterianas (Cuadro 2). El mayor efecto se observó con 67% y el menor con 40% sobre la inhibición de R. solani. Estos resultados contrastan con los obtenidos con Hernández et al. (2008), quienes encontraron un efecto máximo en la inhibición de R. solani de 40.4% con cepas de Bacillus spp, aisladas de la rizosfera de plantas de los cultivos de papa y chile. Así mismo son similares con los de Mojica-Marin et al. (2009), quienes encontraron un rango de inhibición de 34.4 a 66.6 por ciento en la inhibición micelial de R. solani por B. thuringiensis. En relación a el comportamiento del fitopatógeno, parece ser que las cepas de Bacillus aislados de la rizosfera de especies de plantas diferentes al cultivo son más eficaces para inhibir a R. solani in vitro.

La prueba de cultivo duales es extensamente usada como una de las pruebas preliminares in vitro para seleccionar agentes de control biológico (Hoyos et al., 2008; Calvo-Araya et al., 2012). En el presente estudio, este método mostro que las 14 cepas de bacterias evaluadas presentaron diferentes capacidades para inhibir a R. solani, por ejemplo la cepa 53F6 produjo la mayor inhibición de crecimiento (67.2%) de R. solani, mientras que la cepa 5.1 inhibió 40%. Esta ampliamente documentado que cepas de una misma especie, pueden exhibir diferentes capacidades para producir toxinas e inhibir el crecimiento de diferentes microorganismos (Choi et al., 1999). La antibiosis es generalmente el modo de antagonismo observado en Bacillus spp.

Generalmente producen clases de antibióticos como bacilomicina, fungimicina, micosubtilina y zwittermicina, compuestos que han demostrado ser efectivos en suprimir el crecimiento de patógenos in vitro o in situ (Pal y Gardener, 2006; Cazorla y romero, 2007). Además pueden atacar por competencia por nutrientes, sitios de exclusión e infección, parasitismo y inducción de resistencia (Strobel y Rodríguez, 2005; Chatterjee et al., 2007; Carreras et al., 2008), disminuyendo el efecto dañino de los fitopatógenos. Este efecto inhibidor de las especies de Bacillus sobre hongos que causan enfermedades en las plantas puede estar asociado a la producción de enzimas que actúan en la degradación de la pared celular como las quitinasas (Aktuganov et al., 2007; Rodas et al., 2009). Asimismo, Basha y Ulaganathan (2002) reportan el mismo efecto al encontrar que Bacillus sp. produjo en Curvularia lunata, la presencia anormal de hifas, condensación, deformación y ocurrencia de malformaciones extensivas y daños al micelio.

Emmert y Handelsman, (1999) reportan que la especie Bacillus cereus modificó la composición ionica del medio de cultivo en el que fue cultivado, aumentó el pH, secuestro calcio y la secreción de amonio, concluyendo que esta combinación es altamente toxica a las zoosporas de Oomycetes patógenos, causando un rápido ensanchamiento y expulsión de la vacuola, seguido de lisis de las zoosporas.

Caracterización de Bacillus spp., por secuenciación de genes 16's ribosomales. El gen ribosomal 16S es frecuentemente empleado para estudios filogenéticos debido a que es una secuencia altamente conservada entre las diferentes especies de bacterias; el gen se encuentra ubicado en la subunidad pequeña del ribosoma (30S), aunado a esto, el gen ribosomal 16S es una región hiper variable lo que prevé especificidad de especie, lo que resulta muy útil para la identificación de especies bacterianas. La región amplificada por los iniciadores FGPS y FGPL de siete cepas en estudio fue de 350 bp aproximadamente.

En el Cuadro 3 se enlistan las especies identificadas de bacterias aisladas de la rizosfera de plantas del desierto con efecto antagónico sobre la especie del fitopatógeno R. solani, pertenecientes al género Bacillus mediante la amplificación del gen 16S ribosomal. Cada especie bacteriana (cepa) confirma su identidad en su mayoría en 100% con las secuencias contenidas en el Genbank, con coberturas que van desde 99-100% de la secuencia total con la que se comparó. El género Bacillus es un grupo heterogéneo y puede ser re-clasificado en varios grupos en base a características bioquímicas, metabólicas, y en homología fenotípica y genotípica de secuencias de ADNr 16S.

De acuerdo a la clasificación especifica por análisis de ADN B. pumilus está reportado como un biofungicida con efecto en una variedad de fitopatógenos, en aplicaciones preventivas y curativas especialmente en manchas foliares, tizónes, mildiu, oídio, Rhizoctonia y Fusarium (EPA, 2011; Anith et al., 2004; Schisler et al., 2004). B. atrophaeus está reportado como agente de control sobre Erwinia amylovora con un índice de antagonismo de 0.53 (Pusey et al., 2009).

B. subtilis es de los microorganismos más estudiados y reportado como promotor de crecimiento y antagónico a una gran variedad de fitopatógenos como Phytophthora cactorum, Sclerotium cepivorum, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Alternaria carthami, Phytophthora capsici, Fusarium solani, entre otros, en distintos cultivos y evaluados in vitro, en invernadero y campo (Chowdhury, 1997; Yuen et al., 1985; Guillen et al., 2006; Suárez et al., 2011). La expresión de estos resultados indican que es posible considerar que las cepas estudiadas en este ensayo pueden ser utilizados como una alternativa en el control biológico de R. solani con resistencia a fungicidas, mediante la aplicación individual o en mezcla de cepas para eficientar su control.

 

Efecto de polifenoles

Efecto del solvente en la extracción de polifenoles. La cantidad total de polifenoles obtenida con el solvente empleado entre especies vegetales fue altamente variable (Cuadro 4). La especie con mayor contenido de polifenoles totales fue la Y. filifera, seguida de la Larrea tridentata con 5.27 x 10⁴ ppm y 1.76 x 10⁴ ppm ppm, la especie menos productiva es Opuntia ficus-indica y Agave lechuguilla con 2.14 x 10³ ppm y 2.84 x 10³ ppm respectivamente. Cabe mencionar, que ya se han evaluado extractos etanolicos tanto de L. tridentata y F. cernua (Jasso de Rodríguez et al., 2006) pero en forma de resina, y no se cuenta con una unidad de medida de referencia, que en nuestro caso es el equivalente a ppm de polifenoles totales equivalentes de ácido gálico y catequina.

Efecto de los poli fenoles en la inhibición micelial. El efecto de los diferentes extractos etanolicos sobre R. solani fue altamente significativo (p= 0.05) a las 72 h. En la Figura 1 se observa que conforme se aumenta la concentración de polifenoles totales, se reduce significativamente el crecimiento micelial de R. solani, Los extractos de las especies en estudio mostraron un alto efecto en el desarrollo del hongo al inhibir el crecimiento del micelio, en su mayoría todos los extractos inhibieron el crecimiento del micelio de R. solani al 100% excepto el extracto de Y. filifera que solo tuvo 46% con la dosis más alta evaluada (3 000 ppm). Los efectos de inhibición con L. tridentata se observaron en 93.13% a la mayor dosis evaluada (1 000 ppm) (Figura 1a).

Estos resultados contrastan con los obtenidos por Almanza (2004), al encontrar una inhibición del 59.60%, a una concentración de 10% de extracto a las 96 h de crecimiento, y con los reportados por Gamboa-Alvarado et al. (2003b), con extractos metanólicos hidrosolubles de gobernadora obtenida de los desiertos Sonorense (DS) y Chihuahuense (DCh); a 500 ppm el extracto obtenido de DS inhibió a R. solani por 53.86%, mientras que el extracto obtenido de DCh redujo el crecimiento del mismo hongo por 35.52%; y a 1 000 ppm, el extracto obtenido de DS inhibió a R. solani por 75.73%, el extracto obtenido de ChD lo afectó 51.81%.

Asimismo, estos resultados presentan un efecto similar y superiores a los obtenidos con otros solventes que pudieran ser aptos para su uso en un sistema de producción orgánica al encontrarse en promedio de inhibición 94.7 con lanolina, 69% con manteca de cacao y con menor efecto la extracción en agua con 35.4% de inhibición del crecimiento del hongo. La mayor inhibición observada con gobernadora en agua fue de 72,76% a una concentración de 8 000 ppm (Castillo et al., 2010).

Los resultados obtenidos F. cernua en etanol (Figura 1b) muestran que a 160 ppm de polifenoles totales se inhibe completamente a R. solani. Estos resultados difieren con los obtenidos por Jasso de Rodríguez et al. (2007) quienes muestran que los extractos etanólicos de Flourensia spp., a 1 000 µl 1^-1 inhiben 100% el crecimiento del hongo. Asimismo, nuestros resultados son mejores a los reportados por Gamboa-Alvarado et al. (2003a), dado que dichos autores encontraron una inhibición de 84.7 % a las 96 h usando extractos metanólicos a una concentración de 20 000 ppm. Lo anterior hace suponer que el etanol tiene un mejor efecto para extraer los fitoquímicos que inhiben el crecimiento de R. solani. Los efectos obtenidos con O. ficus-indica sobre la inhibición total de R. solani se alcanzaron a la concentración de 200 ppm (Figura 1c).

No se cuenta con mucha información del uso de extractos de esta especie. Castillo et al. (2010) reporta un pobre efecto en la inhibición micelial con extractos obtenidos con los solventes agua, manteca de cacao y lanolina con 20.79, 16.8, 11.7% en promedio, respectivamente. A. lechuguilla mostró un efecto de 100% sobre la inhibición del micelio de R. solani a 200 ppm de polifenoles totales (Figura 1d). Estos resultados difieren de los obtenidos por Almanza (2004), quien obtuvo una inhibición de 75.76% de R. solani al trabajar con extracto de A. lechuguilla utilizando como solvente agua a una concentración de 10%, y de los reportados por Castillo et al. (2010) con 31.8 y 10.7% en promedio con lanolina y manteca de cacao y ningún efecto con extractos en agua sobre la inhibición micelial del hongo respectivamente.

Y. filiferera tuvo poco efecto en la inhibición del crecimiento micelial de R. solani (Figura 1e) ya que los valores no superaron 50% de inhibición a una concentración máxima de 3 000 ppm. No se encontró información de su uso al respecto, sin embargo Castillo et al. (2010) reporta también bajo efecto de extractos de Yuca obtenidos con los solventes agua, lanolina y manteca de cacao que mostraron 26.5, 32.3 y 28.6% de inhibición, respectivamente.

Concentraciones inhibitorias al 50% (CI₅₀) en R. solani con Polifenoles totales en ppm. De acuerdo al análisis Probit realizado, la CI₅₀ de los extractos evaluados fue muy variable. La CI₅₀ más baja se obtuvo con F. cernua a 16.3 ppm y la más alta con Y. filiferaa 54.46 x 10² ppm (Cuadro 5). Las CI₅₀ en Polifenoles totales (ppm) obtenidas con extractos etanolicos difieren y son menores de las obtenidas con agua, manteca de cacao y lanolina (Castillo et al., 2010; Hernández et al., 2010).

 

Conclusiones

Los aislamientos de Bacillus obtenidos de la rizosfera de plantas del desierto chihuahuense presentan un efecto antagonista sobre el hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani. Las especie más común encontrada es Bacillus subtilis, y en menor presencia las especies B. pumilus y B. atrophaeus. Rhizoctonia solani fue altamente sensible a los extractos evaluados, que mostraron actividad fungicida a bajas concentraciones. Los extractos mas significativos para el control in vitro de R. solani fue Opuntia ficus-indica, Flourensia cernua y Agave lechuguilla.

 

Literatura citada

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