Artículos

 

Desarrollo de nuevas variedades de uva (Vitis vinifera L.) sin semilla mediante rescate de embriones*

 

Development of new seedless grape varieties (Vitis vinifera L.) by embryo rescue

 

Martín Ernesto Tiznado Hernández^1§, Alejandro Miranda Jiménez¹, Ángel J. Ojeda Contreras¹, Alberto Sánchez Estrada¹, Héctor J. Arreola Ortiz² y Gerardo Martínez Díaz²

 

¹ Coordinación de Tecnología de Alimentos de Origen Vegetal-Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. Carretera a La Victoria km 0.6. C.P 83000. Hermosillo, Sonora México. (alejandro@excelsusinc.com; ajoc@ciad.mx; aestrada@ciad.mx).

² Campo Experimental Costa de Hermosillo-INIFAP. Carretera a Bahía de Kino km 12.6 Colonia la Manga. C. P. 83000. Hermosillo, Sonora México. (tubutamachivas8@hotmail.com; germadz@hotmail.com). ^§Autor para correspondencia: tiznado@ciad.mx.

 

* Recibido: enero de 2015
Aceptado: mayo de 2015

 

Resumen

Uno de los objetivos principales de un programa de mejoramiento genético de uva es el desarrollo de variedades sin semilla. Sin embargo, para lograr esto se requiere combinar la técnica de rescate de embriones con la genética tradicional. El objetivo de este trabajo fue desarrollar híbridos de cruzas con las siguientes variedades de uva sin semilla: Perlette, Black Seedless, Crimson Seedless, Crispy, Flame, Superior, Princesa, Red Globe, Fiesta, Fresno y Thompson, utilizadas como padre y como madre. El experimento se realizó en el campo agrícola experimental Costa de Hermosillo del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias en el año 2009. Se realizaron 23 hibridaciones mediante la polinización de las flores manualmente dos veces al día durante tres días consecutivos. Las bayas fueron cosechadas al inicio del envero y trasladadas al laboratorio donde se esterilizaron superficialmente antes del aislamiento de los rudimentos seminales. Los rudimentos fueron transferidos a un medio de cultivo donde permanecieron entre 75 y 90 días y los embriones rescatados de los rudimentos transferidos a medio para incubación de embriones. Se cosecharon en total 3 163 bayas de las cuales se aislaron 3836 rudimentos seminales. En 8.76% de los rudimentos, fue posible rescatar embriones. De los embriones rescatados, 32.14% desarrollaron plántulas de las cuales fue posible transferir dos al invernadero. Se concluye que la utilización de la genética tradicional con apoyo del protocolo de rescate de embriones del presente trabajo permite la obtención de progenie de hibridaciones con diferentes variedades de uva sin semilla.

Palabras clave: hibridaciones, rescate de embriones, uva, variedades sin semilla.

 

Abstract

One of the main objectives of a grape breeding program is the development of seedless varieties. However, to achieve this it is necessary to combine the embryo rescue technique with classical genetics. The aim ofthis work was to develop hybrids from crosses with the following varieties of seedless grape: Perlette, Black Seedless, Crimson Seedless, Crispy, Flame, Superior, Princesa, Red Globe, Fiesta, Fresno and Thompson, used as father and mother. The experiment was conducted at the experimental field Costa ofHermosillo from the National Institute ofForestry, Agriculture and Livestock in 2009. 23 hybridizations were performed by pollinating flowers manually twice a day for three consecutive days. The berries were harvested at the beginning of veraison and taken to the laboratory where the surface was sterilized before isolating the seminal rudiment. The seminal rudiments were transferred to a culture medium where they were kept between 75 to 90 days; the rescued embryos from the seminal rudiments were transferred to an incubation medium for embryos. 3 163 berries were harvested from which 3 836 seminal rudiments were isolated. In 8.76% of rudiments, was possible to rescue embryos. From the rescued embryos, 32.14% developed seedlings, from which two were able to be transferred to a greenhouse. It is concluded that the use of classical genetics along with embryo rescue technique allows obtaining progeny ofhybrids with different varieties of seedless grapes.

Keywords: embryo rescue, grape, hybridizations, seedless varieties.

 

Introducción

La producción de uva de mesa sin semilla en el estado de Sonora tiene gran importancia social y económica debido tanto a los jornales que genera como a los ingresos provenientes de la exportación. De acuerdo a esto, en 2008 fueron exportadas 16 178 877 cajas solo a los Estados Unidos de América (http://www.aalpum.com.mx). El mercado Norteamericano cada día es más exigente y diverso, lo cual demanda la disponibilidad de una amplia gama de variedades que satisfagan al mercado en precio y calidad.

Considerando que la exportación de uva de mesa en Sonora, se realiza en base a cuatro variedades principalmente, a saber: Perlette, Flame, Sugraone y Red Globe, una de las estrategias que pueden permitir aumentar la capacidad competitiva por parte de los productores es incrementar el número de variedades de uva de mesa. La creación de variedades a partir de un programa de mejoramiento genético propio, evitaría la necesidad de pagar derechos por el uso de variedades para la comercialización y haría posible patentar nuevas variedades. Un programa de mejoramiento genético en uva de mesa, requiere el apoyo de la técnica de rescate de embriones debido a que uno de sus objetivos principales debe ser el desarrollo de variedades de uva sin semilla. Asimismo, este programa permitiría la creación de variedades con características agronómicas óptimas para las regiones productoras de uva en el estado de Sonora y para satisfacer las demandas del mercado de exportación.

La técnica de rescate de embriones es necesaria para obtener progenie de hibridaciones con variedades de uva sin semilla ya que el embrión es incapaz de desarrollarse completamente debido a diversas mutaciones. Debido a esto, es necesario rescatarlo e inducir su desarrollo hasta lograr la planta completa mediante métodos de laboratorio in vitro. A las diversas técnicas de laboratorio que se utilizan para inducir el desarrollo de un embrión aislado del ovario en desarrollo se le conoce como rescate de embriones (Sharma et al., 1996; Ramming et al, 2000). La embriogénesis in vitro posibilita el establecimiento de dicho proceso en condiciones asépticas y controladas en cualquier época del año, permitiendo obtener plántulas completas (Hernández y González, 2010).

Sin embargo, para el establecimiento exitoso, se hace necesario prevenir y controlar la contaminación microbiana y oxidación fenólica, ya que es uno de los problemas más graves durante la micropropagación de frutales (Baydar, 2006; Azofeifa, 2009; Hernández y González 2010).

Debido a que Vitis vinifera es ampliamente cultivada en diversas regiones, se han realizado estudios en diversas partes del mundo para mejorar las variedades ya existentes y generar nuevas variedades apoyándose en el rescate de embriones en combinación con la embriogénesis somática (Salunke y Mharte, 1997; Gray, 1989; Emershad y Ramming, 1994; Morgana et al., 2004; Nicole Hewstone et al., 2007; Yancheva y Roichev, 2007; Gambino et al., 2007; Labrada et al., 2008). En la técnica de rescate de embriones se evalúa la eficiencia en base al número de plántulas obtenidas a partir del número de embriones inmaduros aislados (Tsolova, 1990).

Esta eficiencia puede alterarse como resultado del tiempo de espera después de antesis (García et al., 2000); reguladores de crecimiento (Agüero et al., 2000; Nookaraju et al., 2007); variedad de uva utilizada (Hewstone et al., 2006); intensidad y tipo de poda (Dalal et al., 1992; Ponce et al., 2009); genotipo, época de cosecha y tamaño del embrión (Ramming y Emershad, 1990; Pommer et al., 1995) así como el medio de cultivo utilizado y tiempo de cultivo in vitro (Valdez, 2005). Con base en lo anterior mencionado, el presente trabajo tiene como objetivo evaluar la eficiencia de la técnica de rescate de embriones en individuos f1 provenientes de hibridaciones realizadas mediante técnicas de genética tradicional utilizando diferentes variedades de uva sin semilla.

 

Materiales y métodos

Material vegetal

Se utilizaron las variedades Perlette, Black Seedless, Crimson Seedless, Crispy, Flame, Superior, Princesa, Red Globe, Fiesta, Fresno y Thompson, como donador de polen o como receptor.

 

Hibridaciones

Se realizaron 23 hibridaciones utilizando las variedades mencionadas en la sección anterior como padre o madre, para lo cual se tomaron 5 inflorescencias de cada planta de entre 3 a 8 años de edad y se emascularon justo antes de la antesis. Para poder realizar esto, se observó cada variedad hasta que en sus racimos mostraran de uno a cinco flores abiertas.

La emasculación consistió en remover las anteras del brote de la flor para prevenir su autofecundación. Se realizó la polinización de las flores manualmente con el polen de las plantas de interés dos veces al día durante tres días consecutivos. Una vez realizada la polinización las flores fueron cubiertas con una bolsa de papel para evitar una posible contaminación por polen proveniente de las plantas cercanas. Cada bolsa se etiquetó con la cruza realizada y la fecha de polinización. Al cuarto día, la bolsa de papel fue removida para permitir el desarrollo normal del fruto.

 

Cosecha de las bayas

Las bayas se cosecharon entre 30 y 45 días después de la polinización, antes del envero, estado de desarrollo que se identificó mediante la observación visual del inicio del cambio de color en la epidermis de la baya.

Los racimos cosechados fueron empacados en bolsas de plástico, etiquetados y colocados en hielo para ser trasladados al laboratorio donde se almacenaron a 4 °C hasta su análisis.

 

Aislamiento de los rudimentos seminales

Bajo condiciones asépticas en una campana de flujo laminar, las bayas fueron sanitizadas superficialmente con alcohol al 70% durante 5 min y después en una solución de hipoclorito de sodio (1.5%) durante 15 min. Posteriormente, se realizaron tres lavados con agua destilada estéril para eliminar los residuos de cloro. Una vez que se realizó la esterilización superficial de las bayas, estas se diseccionaron para la extracción de los rudimentos seminales, bajo un microscopio estereoscópico. Se realizaron cortes transversales a cada baya de manera superficial para no dañar el rudimento. Una vez realizado el corte, se abrió cuidadosamente cada baya para localizar y extraer los rudimentos seminales colocándolos sobre una caja Petri estéril para después limpiarlos de residuos de tejido proveniente del pericarpo.

 

Incubación de rudimentos seminales en medio de cultivo

Los rudimentos seminales fueron sembrados en cajas de Petri estériles con un medio de cultivo conteniendo los macronutrientes del medio Nitsch (Nitsch and Nitsch, 1969) y los micronutrientes y vitaminas del medio MS (Murashige and Skoog, 1962), suplementado con 20 g- L^-1 de sacarosa, 0.34 mg L^-1 de ácido giberélico (GA3), 0.1 g L^-1 de mio-inositol y 0.1 mg L^-1 de biotina. En cada placa se sembraron 10 rudimentos seminales, los cuales fueron incubados en una cámara de crecimiento con temperatura controlada de 25 °C y fotoperiodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad durante un período comprendido entre 75 y 90 días.

 

Aislamiento del embrión y desarrollo de la vitroplanta

Posteriormente al periodo de incubación, los rudimentos seminales fueron extraídos del medio de cultivo y se diseccionaron utilizando un microscopio estereoscópico para extraer el embrión. El embrión extraído fue incubado en tubos de 15 cm de largo y 2 cm de diámetro con un medio de cultivo incluyendo los macronutrientes del medio MS, descrito a continuación:

12 g-L^-1 de Ca (NO₃)₂*4₂O, 3.2 g-L^-1 de KNO₃, 3.2 g-L^-1 de KCl, 7.2 g-L^-1 de NH₄NO₃, 4 g-L^-1 de Na₂SO₄, 15 g-L^-1 de MgSO₄*7H₂O, 0.38 g-L^-1 de NaH₂PO₄*H₂O y los micronutrientes del medio MS: 600 mg-L^-1 de MnSO₄*H₂O, 100 mg-L^-1 de H₃BO₃, 100 mg-L^-1de ZnSO₄*7H₂O, 5 mg-L^-1 de CoCl₂*6H₂O, 5 mg-L^-1 de CuSO₄*5H₂ y 5 mg-L^-1 de Na₂MoO₄*2H₂O. El medio descrito fue suplementado con 30 g-L^-1 de sacarosa, 0.035 mg-L^-1 de ácido giberélico, 0.1 mg-L^-1 de la solución de citrato de fierro, 50 mg-L^-1 de caseína hidrolizada, 50 mg-L^-1 de mio-inositol, 3 g-L^-1 de carbón activado y 5 ml-L^-1 de una solución de vitaminas que contiene, la siguiente composición: 50 mg-L^-1 de tiamina, 5 mg-L^-1 de piridoxina, 5 mg-L^-1 de pantetonato de calcio y 600 mg-L^-1 de glicina.

Después de la siembra de los embriones, estos se incubaron en una cámara de crecimiento bajo las mismas condiciones antes mencionadas para los rudimentos seminales. Cada tubo fue etiquetado con los datos de las variedades utilizadas en la hibridación y la fecha de inicio de la incubación. Los embriones fueron incubados aproximadamente de 8 a 12 semanas, hasta el desarrollo de hojas, raíces y tallo.

 

Transferencia de las vitroplántulas a sustrato

Las plantas mostrando el desarrollo de la raíz e incluyendo de 5 a 6 hojas verdaderas, fueron removidas cuidadosamente utilizando guantes de látex esterilizados con alcohol al 70%. Posteriormente se lavaron con agua destilada para eliminar el medio de cultivo y se transfirieron a macetas de plástico incluyendo perlita y una mezcla de turba musgo (1:1) esterilizada. Las macetas se cubrieron con bolsas de polietileno para controlar la pérdida de agua y se colocaron en una cámara con control de humedad relativa y un fotoperiodo de 16:8 luz oscuridad a una temperatura de 26 °C durante 10 días.

Al término de ese tiempo, se realizaron perforaciones en las bolsas para permitir el intercambio de humedad con el ambiente con el fin de inducir la aclimatación lenta de las plantas. Después de un período de aproximadamente dos semanas, las bolsas se removieron completamente para inducir la aclimatación de la planta al medio ambiente. Una vez que las plantas se adaptaron al crecimiento en la cámara, fueron transportadas a un sombreadero para permitir la adaptación de la planta al ambiente externo.

 

Resultados y discusión

En el Cuadro 1, se muestran los resultados de los 23 cruzamientos realizados entre las 11 variedades de uva de mesa evaluadas. Como se puede observar, se obtuvieron un total de 3 163 bayas cosechadas. De estas bayas, se lograron recuperar 3 836 rudimentos seminales, los cuales fueron sembrados en el medio de cultivo e incubados de acuerdo a lo descrito en líneas anteriores. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, 336 embriones que representa 8.76% de los rudimentos sembrados, fueron rescatados y sembrados en su medio de cultivo. De todos los embriones rescatados, 108 germinaron para convertirse en plántulas, lo que constituye 2.82% de los rudimentos sembrados y 32.14% de los embriones rescatados.

El porcentaje de recuperación de rudimentos, embriones y plantas obtenido en el presente trabajo es menor al reportado en otros trabajos, ya que se han reportado porcentajes de recuperación de rudimentos, embriones y plantas de 92, 48 y 21.1% respectivamente (Hewstone et al., 2006). Es importante destacar que los autores(as) mencionan haber obtenido 32 801 bayas de las distintas cruzas realizadas entre siete variedades utilizadas como madres y sus cruzamientos recíprocos durante 5 temporadas, y en este trabajo solo se obtuvieron 3 163 bayas de los cruzamientos realizados en una sola temporada. Además de lo anterior, en este trabajo solo se logró transferir dos plantas al sombreadero ya que la mayoría de las vitro plantas no soportaron el traslado al sustrato en maceta.

Durante la incubación de los rudimentos seminales, se observó que algunos se tornaban verdes y grandes mientras que otros se tornaban de color café con textura rugosa. No fue posible relacionar estas características con los progenitores ya que se observaron en casi todos los grupos de rudimentos. Gray (1992), reportó que el color café en los rudimentos seminales se debe a la producción de taninos por heridas en los tejidos el cual se dispersa en el medio alrededor de cada rudimento.

Aunado a esto, Se ha reportado que compuestos fenólicos, producto del metabolismo de los tejidos vegetales afectan su propagación durante su cultivo in vitro induciendo oscurecimiento y necrosis de los tejidos (Marks y Simpson 1990; Sharma et al., 1992). En este sentido, Hernández y González (2010), reportan que este fenómeno ocurre por la acción de las enzimas polifenoloxidasas y tirosinasas, que se inducen cuando los tejidos sufren heridas. Estas enzimas ejercen su acción sobre los polifenoles y la tirosina, oxidándolos a quinonas que son substancias fitotóxicas que pueden interaccionar con las proteínas inhibiendo el crecimiento y la viabilidad de los explantes.

Además, Gray (1992), publicó que la acumulación de taninos, fenoles u otras sustancias tóxicas en el medio, inducen al aborto del embrión durante la incubación del rudimento seminal. Debido a esto, cuando el estrés oxidativo no se puede evitar, se sugieren diferentes estrategias, descritas a continuación: utilización de otro medio de cultivo, cambiar los reguladores de crecimiento, utilización de pH bajo, cambio del potencial osmótico del medio de cultivo y utilización de explantes en estado juvenil o de material en crecimiento activo (Azofeifa, 2009). Este último autor afirma que generalmente es necesario utilizar más de un medio de cultivo para evitar los problemas mencionados.

En la Figura 1, se muestran las etapas para la obtención de una planta completa adaptada al exterior a partir de un rudimento seminal. En Figura 1a, se muestra la incubación de los rudimentos seminales en el medio de cultivo descrito. Es importante comentar, que en ocasiones ocurre el desarrollo de colores verde o café en el rudimento. En la Figura 1b, se aprecia un embrión dentro de un rudimento seminal seccionado, después de nueve semanas de incubación. En la Figura 1c, es posible observar vitro plantas completamente desarrolladas que pueden ser trasladadas al sustrato. En la misma figura, se observan la etiqueta correspondiente donde se detalla el tipo de hibridación realizada, la fecha de siembra del rudimento seminal y la fecha de siembra del embrión. En la Figura 1d, se muestran dos plantas creciendo en sustrato producto de la hibridación de Perlette con Flame con aproximadamente 12 semanas de desarrollo.

En (a), se muestran los rudimentos seminales, en (b) detalle de un embrión de uva en un rudimento, en (c) las vitroplantas completamente desarrolladas y en (d) plantas completamente adaptadas al exterior creciendo en sustrato en la cámara.

De acuerdo al Cuadro 1, la comparación del número de rudimentos seminales obtenidos en base al número de bayas cosechadas muestra que la cruza de Perlette (como madre) con Flame (como padre) obtuvo el mayor número de rudimentos seminales. Por otro lado, Perlette fue la variedad que mostró mayor cantidad de rudimentos seminales por bayas cosechadas independientemente de ser utilizada tanto como madre y como padre. Sin embargo, la cantidad de rudimentos obtenida fue diferente dependiendo de las variedades utilizadas en la hibridación. De acuerdo a esto, con las variedades Black Seedless, Flame, y Superior, Perlette mostró mayor producción de rudimentos cuando fue utilizada como madre. En contraste, cuando fue utilizada como padre con las variedades Superior y Flame, el porcentaje de producción de rudimentos fue menor. Por otro lado, la variedad Flame mostró un comportamiento similar a la variedad Perlette. Resultados similares al presente trabajo fueron reportados por Hewstone et al. (2006) utilizando las variedades Black Seedless y Superior.

Estos investigadores compararon los resultados de embriones rescatados de hibridaciones realizadas durante cinco temporadas consecutivas en las que se observa claramente que existen mayores variaciones debido a las variedades utilizadas como madre con respecto a los efectos debidos a la variedad utilizada como material polinizante. También al comparar entre los resultados considerando las variedades utilizadas como padre, se encontró menor variación en cuanto al número de embriones rescatados por semilla y el número de plántulas obtenidas

De acuerdo a estos resultados, Ponce et al. (2000) reportan que el cultivar usado como madre, es el factor más importante que determina el éxito de la técnica. Además de este hecho, señalan los autores, que es importante conocer la mejor fecha de cosecha de cada cultivar debido a que el momento en que se da el aborto de la semilla varía de un cultivar a otro debido a la interacción genotipo y ambiente. Asimismo, mencionan que se obtienen diferencias significativas entre los porcentajes de plantas obtenidas in vitro usando el mismo cultivar es polinizado con diferente padre, lo cual es un aspecto importante a considerar durante las cruzas. Se sugiere que este comportamiento se debe a incompatibilidad genética o al control de la expresión de la apirenia por el polinizador. Debido a lo anterior, Ponce et al. (2000) recomiendan utilizar solamente aquellos cultivares que como madre muestren rendimientos mayores al 5% en las plantas obtenidas, así como también como polinizadores aquellos cultivares cuyos porcentajes estén por debajo de este valor.

Estos resultados indican que es importante no sólo considerar las características de los padres que se quieren incorporar en los descendientes, sino que también es importante elegir las variedades que serán usadas como madre para obtener un buen rendimiento en el rescate de embriones, y por lo tanto, mayor cantidad de progenie para ser evaluados en el campo de cultivo.

Valdez (2005) encontró que existe una mayor germinación cuando los embriones son extraídos de los rudimentos seminales e inoculados directamente en el medio de cultivo como se realizó en este trabajo, donde se logró obtener un porcentaje de 8.76 de rudimentos obtenidos. En el caso de hibridaciones donde Perlette fue utilizada como madre y padre, se obtuvieron 209 y 100 embriones en total, respectivamente. Por otro lado, las hibridaciones recíprocas de Flame con Perlette fueron las que lograron mayor número de embriones rescatados por rudimentos disponibles, esto es 37 y 101 embriones cuando Flame fue utilizada como madre y padre, respectivamente. Por otro lado, en las hibridaciones de Crimson seedless como madre con Superior como padre; Princesa como madre y Superior como padre; Crimson sedless como madre con Perlette como padre; Flame como madre con Red Globe como padre; Fresno como madre con Superior como padre y Crimson Seedless como madre con Flame como padre no se logró la obtención de un solo embrión.

En cuanto al número de plántulas obtenidas a partir de los embriones extraídos, se observó de nuevo que las variedades Perlette y Flame son las que muestran los mejores resultados.

De acuerdo a los resultados obtenidos, destaca la variedad Perlette como la más productiva entre las variedades evaluadas. Perlette es una de las variedades más importantes en la producción sonorense y mexicana. Del número de plántulas totales obtenidas (108 plántulas), 102 involucran a la variedad Perlette y 64 a la variedad Flame. Esto indica que ambas variedades de alta importancia productiva, tienen un gran potencial para ser utilizadas como progenitores en un programa de mejoramiento genético. Resultados similares fueron reportados por Qi Guimei (2002), quien comparó cuatro medios de cultivo distintos para la incubación de rudimentos seminales, encontrando que las hibridaciones entre las variedades Perlette y Flame fueron las más productivas. Por otro lado, el medio a base de macronutrientes del medio Nitsch mostró los mejores resultados, el cual fue utilizado en el presente trabajo. Resultados similares fueron obtenidos por Barticevic et. al. (2004) en un proyecto que involucró muchas más variedades y análisis en las plántulas generadas.

En la Figura 2, se muestran varias plántulas obtenidas en este trabajo. Se pueden observar algunas diferencias entre las plántulas provenientes de distinta cruza considerando las características de color del tallo, tamaño de raíz, así como, tamaño y número de hojas. En la Figura 2a, se observa una muestra de la progenie proveniente de Flame con Perlette, donde las plántulas mostraron mucho vigor desde el inicio del desarrollo y un tallo delgado y verde.

En la Figura 2b, se observa una muestra de la progenie proveniente de la hibridación entre las variedades Princesa y Perlette, donde se observa bajo vigor y un tallo grueso. En la Figura 2c, se observa una muestra de la progenie proveniente de Perlette con Flame, las cuales muestran bajo vigor, hojas grandes y tallo grueso con un color rojo pálido. En la Figura 2d, se observa una muestra de la progenie de Perlette con Superior, donde se observa alto vigor, tallo mediano y ramificado de color rojo pálido y largas raíces.

 

Conclusiones

La técnica de rescate de embriones del presente trabajo puede ser utilizada para la obtención de progenies a partir de cruzas con progenitores sin semilla utilizando muchas variedades de uva.

Los resultados de esta técnica varían dependiendo del tipo de variedades utilizadas en la hibridación, principalmente de la variedad utilizada como madre.

 

Literatura citada

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