Artículos

 

Identificación de fuentes de resistencia a pudriciones de la raíz en germoplasma de chile serrano (Capsicum annuum L.)*

 

Identification of sources of resistance to root rots in germplasm of serrano pepper (Capsicum annuum L.)

 

Reinaldo Méndez Aguilar^1§, Raúl Rodríguez Guerra², Moisés Ramírez Meraz¹, María Genoveva Álvarez Ojeda³, Enrique Vázquez García¹, Arcos Cavazos Gerardo¹, Valeriano Tenorio Pérez⁴, Sanjuana Hernández Delgado⁵ y Netzahualcóyotl Mayek Pérez⁵

 

¹ Campo Experimental Las Huastecas-INIFAP. Carretera Tampico-Mante. 89601, km 55. Villa Cuauhtémoc, Tamaulipas, México. (ramirez.moises@inifap.gob.mx; vazquez.enrique@inifap.gob.mx; arcos.gerardo@inifap.gob.mx).

² Campo Experimental General Terán-INIFAP. Carretera Montemorelos-China. 67400, km 31. General Terán, Nuevo León, México. (rodriguez.raul@inifap.gob.mx).

³ Campo Experimental Río Bravo-INIFAP. Carretera Matamoros-Reynosa. 88900, km 61. Río Bravo, Tamaulipas, México. (alvarez.genoveva@inifap.gob.mx).

⁴ Instituto Tecnológico Superior de Tantoyuca. Lindero Tametate s/n, Col. La Morita. 92116. Tantoyuca, Veracruz, México. (vale_alma4@hotmail.com).

⁵ Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional. Blvd. del Maestro esq. Elias Piña s/n, Col. Narciso Mendoza. 88710. Reynosa, Tamaulipas, México. (shernand@ipn.mx; nmayek@ipn.mx). §Autor para correspondencia: mendez.reinaldo@inifap.gob.mx.

 

* Recibido: marzo de 2015
Aceptado: julio de 2015

 

Resumen

En México las pérdidas en la producción de chile (Capsicum spp.) ocasionadas por infección con Phytophthora capsici Leo; han llegado a ser de hasta 100% en áreas específicas del Bajío y Puebla, por lo que se ha planteado enfrentar el problema fitosanitario mediante la búsqueda de resistencia genética en accesiones de chile serrano obtenidas a partir de colectas en diferentes regiones del país. En el presente trabajo de investigación se utilizó el marcador SCAR OpD04.717 para identificar fuentes de resistencia a dicho patógeno a nivel molecular, se consideraron las accesiones con resistencia a P. capsici cuando amplificaron una banda de 717 pb. Así también se realizaron pruebas de reacción a P. capsici bajo condiciones in vitro, con la cepa PCT-17 previamente aislada, y se obtuvo el porcentaje de supervivencia de 142 accesiones de chile más los dos testigos (SCM334, resistente y MIRASOL, susceptible al hongo). La accesión que mostró mayor resistencia a la cepa fue BGS41 en comparación con SCM334. Únicamente se identificaron accesiones de chile serrano con resistencia a P. capsici mediante pruebas de reacción in vitro. La no identificación de fuentes de resistencia al hongo a nivel molecular en accesiones de chile serrano se pudo deber a que la presencia de un alelo marcador asociado con un locus de resistencia en una accesión/población determinada no implica necesariamente la misma asociación en diferentes accesiones. Se identificaron accesiones de chile serrano con utilidad potencial como nuevas fuentes de resistencia a pudriciones de la raíz (P. capsici) para programas de mejoramiento genético tradicional pero no para selección asistida por marcadores (MAS) mediante OpD04.717.

Palabras clave: Phytophthora capsici Leo., accesiones, marcador SCAR OpD04.717.

 

Abstract

In Mexico production losses in pepper (Capsicum spp.) caused by infection of Phytophthora capsici Leo, has reached up to 100% in specific areas from the Bajio and Puebla, so it has been lay out to face the phytosanitary problem through the search of genetic resistance in serrano pepper accessions obtained from collections in different regions. In the present study the SCAR marker OpD04.717 was used to identify sources of resistance to the pathogen at molecular level, the accessions were considered resistant to P. capsici when amplified at band of 717 bp. Also reaction tests to P. capsici under in vitro conditions with strain PCT-17 previously isolated were carried out and the survival rate from 142 pepper accessions plus two checks (SCM334, resistant and MIRASOL susceptible to fungus) was obtained. The accession that showed greater resistance to strain was BGS41 compared to SCM334. Serrano pepper accessions with resistance to P. capsici were identified by in vitro test reactions. Not being able to identify sources of resistance to the fungus at molecular level in serrano pepper accessions could be due to the presence of an allele marker associated with resistance locus in a given accession / population does not necessarily imply the same association in different accessions. Serrano pepper accessions with potential use as new sources of resistance to root rot (P. capsici) were identified for traditional breeding programs but not for marker-assisted selection (MAS) through OpD04.717.

Keywords: Phytophthora capsici Leo., accessions, SCAR marker OpD04.717.

 

Introducción

El chile (Capsicum spp.) es una de las hortalizas más importantes alrededor del mundo. La pungencia y el color son los atributos más importantes de este cultivo utilizado ampliamente en los productos alimenticios y en diversas aplicaciones farmacológicas (Kumar et al., 2011). El género Capsicum incluye 30 especies, cinco de las cuales son domesticadas: C. annuum, C. frutescens, C. chinense, C. pubescensy C. baccatum. De estas, C. annuum es la más comúnmente cultivada a nivel mundial, seguido por C. frutescens (Bosland y Votava, 2003; Wang y Bosland, 2006). En México la superficie sembrada de chile es de 136 053.46 ha con un rendimiento promedio de 17.3 t ha^-1 (SIAP, 2013).

Las enfermedades causadas por hongos, bacterias y virus son el mayor problema en la producción del chile (Sandoval, 1993). Dentro de las enfermedades causadas por hongos se encuentra la pudrición de la raíz, también conocida como marchitez o secadera. Esta enfermedad se caracteriza por síntomas como marchitez de la planta, clorosis, defoliación, pérdida de estructuras reproductivas, necrosis de raíces, entre otras. Ha sido asociada a un complejo de fitopatógenos entre los cuales destaca el Oomycete Phytophthora capsici (Velásquez y Medina, 2003). Esta enfermedad ha sido reportada en todos los estados productores de nuestro país (Guijón y González, 2001). Las pérdidas ocasionadas por P. capsici a nivel nacional oscilan entre un 10 y un 60%, mientras que en áreas específicas del Bajío y Puebla pueden alcanzar el 100% (Pérez et al, 2003).

El método tradicional para el control de enfermedades consiste en frecuentes aplicaciones de agroquímicos; sin embargo, la resistencia genética es el método más deseable (Kim y Hartmann, 1985). En nuestro país se han descubierto 19 accesiones de chile criollo originarios del estado de Morelos resistentes a P. capsici que pueden ser utilizados para obtener variedades o híbridos resistentes a este patógeno (Gil-Ortega, 1991); sin embargo existe un gran número de accesiones de chile tipo serrano que no han sido caracterizadas para estos fines y que pueden ser fuente importante de resistencia a esta enfermedad. Las pruebas de reacción in vitro a fitopatógenos ahorran tiempo, costos y espacio en la caracterización de distintos y numerosos genotipos de chile respecto al grado de susceptibilidad o resistencia a hongos, bacterias, entre otros.

Otra herramienta que se está utilizando es la selección asistida por marcadores moleculares (MAS), la cual está incrementando su importancia en los programas modernos de mejoramiento genético. La selección indirecta utiliza métodos de genotipificado permitiendo la detección de los alelos y genotipos deseables en etapas tempranas de las plantas y puede reducir o eliminar la necesidad de ciclos de evaluación fenotípica (Dubcovsky, 2004), MAS es aún más valiosa cuando los caracteres muestran recesividad, herencia poligénica o son difíciles o imposibles de seleccionar directamente (Yeam et al, 2005). El objetivo de este estudio fue identificar fuentes de resistencia a pudriciones de la raíz (P. capsici) en accesiones de chile serrano que puedan ser utilizadas en programas de mejoramiento genético tradicional o mediante selección asistida por marcadores moleculares de ADN.

 

Materiales y métodos

El presente trabajo de investigación se realizó de 2012 a 2013, en las instalaciones del Campo Experimental Las Huastecas (CEHUAS), el cual forma parte del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Se encuentra ubicado en las coordenadas: 22° 33' 59" latitud norte y 98° 09'49" longitud oeste dentro de la región Huasteca en el oriente de la República Mexicana (Morales, 2012).

Germoplasma. En esta investigación se incluyeron 142 accesiones de chile serrano pertenecientes al Banco de Germoplasma de Chile del CEHUAS-INIFAP; las cuales son procedentes de colectas de diferentes estados del país, y representan los grupos raciales Rojo, Amarillo, Café y Anaranjado. Así también, se incluyeron dos genotipos como testigo (SCM334, resistente y Mirasol, susceptible al hongo) (Cuadro 1).

Aislamiento del ADN genómico. La extracción de ADN genómico se realizó de 2012 a 2013 en el Campo Experimental Las Huastecas-INIFAP mediante el estuche comercial Wizard® Genomic (Promega^®). Para ello se pesaron 80 mg de tejido de hojas jóvenes de 15 plantas de cada accesión mismas que se maceraron en un mortero con adición de nitrógeno líquido (-196 °C), hasta formar un polvo fino. El polvo se transfirió a un tubo Eppendorf de 1.5 mL que contenía 600 μLde buffer de lisis y se agitó en Vortex por 3 s. La mezcla se incubó en baño maría a 65 °C por 15 min. Transcurrido el tiempo se agregó 3 μL de RNasa y se mezcló por inversión suave (cinco veces).

Las muestras se incubaron a 37 °C por 15 min y se enfriaron por 5 min a una temperatura de 17 °C. Posteriormente, se agregaron 200 μL de la solución de precipitación de proteínas y se agitaron en Vortex a alta velocidad por 20 s. Enseguida, se centrifugaron por 5 min a 13 000 rpm en una microcentrífiiga y cuidadosamente se removió el sobrenadante que contenía el ADN y se colocaron en un tubo Eppendorf de 1.5 mL con 600 μL de isopropanol a temperatura ambiente, para precipitar el ADN. Inmediatamente se centrifugaron por 3 min a 13 000 rpm, se eliminó el sobrenadante, se lavaron con etanol al 70% y después se centrifugaron por 3 min a 13 000 rpm.

Finalmente, el ADN se re-suspendió en 80 μL de solución de rehidratación de DNA y se almacenaron a -20°C. Este proceso se realizó en 142 accesiones de chile serrano y los testigos. En 2013 en el Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional ubicado en Reynosa, Tamaulipas, se determinó las concentraciones de ADN genómico de las accesiones que se utilizaron en el presente estudio, se estimaron visualmente con tinción en geles de agarosa al 1%, con Sybr Green^® con exposición a luz ultravioleta en un Fotodocumentador Gel Doc XR^® marca Bio-Rad, mediante una comparación con un estándar de peso molecular con concentración conocida como fago λ digerido con la enzima de restricción Lambda DNA/HindIII Marker.

Análisis con el marcador SCAR. Se utilizó el marcador SCAR OpD04.717 asociado con la resistencia a pudriciones de la raíz (Quirin et al., 2005), para determinar su presencia en el germoplasma de chile. El volumen de reacción fue de 20 μl, el cual contenía una mezcla de 150 ng μL-¹ de ADN; 2 μL (10 μM) de cada iniciador (sentido y anti-sentido); 2 μL de buffer de PCR; 2 μL (10mM) de dNTPs y 1 U de Taq DNA polimerasa. Las condiciones óptimas de PCR fueron: 2 min de desnaturalización a 94 °C; 32 ciclos de 30 s a 94 °C, 30s a 45 °C y 1 min a 72 °C y una extensión final de 5 min a 72 °C. Se trabajó en un termociclador T100™ marca Bio-Rad.

La secuencia de los iniciadores es: (F) 5'-CCA TAA GGG TTG GTAAAT TTA CAAAG-3'/(R) 5'-TCGAGAGATAAT TCA GAT AGT ATA ATC-3'. Los fragmentos amplificados se separaron en geles de agarosa al 1% y se visualizaron por tinción del gel con Sybr Green^® con exposición a luz UV en un transiluminador BXT-F20.M (Uvitec Cambridge). Posteriormente, los geles se fotografiaron, y se procedió con la identificación de accesiones de chile con presencia de la banda de 717 pb esperada que indica la resistencia a P capsici.

Reacción in vitro a P. capsici. Las pruebas in vitro se realizaron en 2013 en el Laboratorio del Campo Experimental General Terán (CEGET) del INIFAP, el cual se localiza en el municipio de General Terán, Nuevo León, México. Como fuente de inóculo se utilizó la cepa PCT-17 de Phytophthora capsici, la cual es altamente virulenta, y se ha utilizado en investigaciones previas (Hernández-González, 2007; Robles-Yerena et al, 2010). El fitopatógeno se mantuvo por siete días en medio PDA(Papa Dextrosa Agar) antes de utilizarse en las pruebas de patogenicidad. El experimento se realizó de acuerdo a la metodología reportada por Robles-Yerena et al. (2010). Las semillas se trataron por tres minutos con hipoclorito de sodio al 1% y fueron lavadas con tres pasos de agua estéril. Las semillas se transfirieron a cajas Petri conteniendo agar agua al 2%, y se incubaron a 26 °C con ciclo diario de luz de 14 h. Se revisaron cada 24 h y por cuatro días para seleccionar semillas libres de crecimiento de cualquier microorganismo.

Al cuarto día se transfirieron grupos de tres a cinco semillas a nuevas cajas Petri y se incubaron por 24 días a 26 °C con ciclo diario de luz de 14 h. Las plántulas contenidas en las cajas Petri fueron inoculadas en el cuello a los 10 a 14 días con un fragmento de colonia de P. capsici de 0.3 cm² aproximadamente. Los tratamientos se evaluaron a los 16 días después de la inoculación registrando el número de plantas vivas y muertas, y obteniendo el porcentaje de supervivencia. Aquellas accesiones que mostraron igual o mayor porcentaje de supervivencia que el testigo SCM334 se consideraron resistentes a P. capsici.

Diseño experimental y análisis de los datos. Se utilizó un diseño completamente al azar con tres repeticiones por tratamiento; la unidad experimental fue de 5 plantas por repetición. Los datos de porcentaje de supervivencia al fitopatógeno se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) y a una comparación de medias de Tukey (p≤ 0.05) mediante el paquete estadístico SAS versión 9.1 (SAS, 2007).

 

Resultados y discusión

El SCAR OpD04.717 ligado el QTL Phyto 5.2 que confiere resistencia a P. capsici (Quirin et al., 2005) se encontró en el genotipo resistente a P. capsici SCM334 (testigo resistente), el cual es el chile que mayor resistencia presenta a este fitopatógeno (Guerrero-Moreno y Laborde, 1980; Bosland y Lindsey, 1991; Reifschneider et al., 1992; Quirin et al, 2005; Kim et al., 2008). Sin embargo, no se encontró en las 142 accesiones, por lo tanto no fue posible discriminar entre las accesiones con posibilidad de poseer resistencia o susceptibilidad (Figura 1). El marcador OpD04.717 ha sido reportado como eficaz en la discriminación entre genotipos resistentes y susceptibles a P. capsici, lo que ha permitido la identificación de materiales genéticos de C. annuum y C. chinense con resistencia al patógeno (Quirin et al., 2005). McGregor y Waters (2011), utilizaron este marcador el cual amplificó la banda de 717 pb en las accesiones PI 439273, PI 566811, PI 640641 y en el genotipo SCM334, sin embargo no amplificó la banda en PI 593573, la cual es una accesión resistente estrechamente relacionada a SCM334.

Lo reportado en el trabajo antes mencionado y en el presente estudio se puede deber, a que la presencia de un alelo marcador asociado con un locus de resistencia en una accesión/población determinada, no implica necesariamente la misma asociación en diferentes accesiones (McGregor y Waters, 2011). Lo anterior puede explicar la ausencia del marcador OpD04.717 en las accesiones analizadas, a pesar de haber usado 15 plantas por accesión. Gill (2009), con una mezcla de hojas jóvenes de 10 plantas de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) por accesión le fue suficiente para identificar los marcadores SY20, SAS13, SAB3, SZ04 y BAC6, SAP6, SU91 asociados con la resistencia a antracnosis y tizón común, respectivamente.

Ernest y Kelly (2004) enfatizan la necesidad de realizar inoculaciones en condiciones controladas durante el mejoramiento para corroborar la evaluación genotípica. Vences-Contreras y Vázquez-García (2008) y Zhang et al. (2013), mediante pruebas de inoculación in vitro a roya blanca (Puccinia horiana Hennings) y a pudriciones de la raíz (P. capsici) pudieron discriminar entre genotipos de crisantemo y chile susceptibles y resistentes a los fitopatógenos, respectivamente; estos estudios indican la confiabilidad de la técnica.

En las pruebas realizadas en el presente estudio de reacción in vitro a P. capsici en accesiones de chile serrano; 11 se identificaron con resistencia al fitopatógeno debido a que mostraron igual o mayor supervivencia estadística al hongo (p≤ 0.05) con respecto al testigo resistente SCM334, de estas accesiones la mayor frecuencia se encontró en el grupo racial Rojo (63.6%) y la menor frecuencia en el Anaranjado (9.1%). En los programas de mejoramiento genético el grupo racial que más se utiliza para la obtención de variedades/híbridos es el Rojo. La accesión BGS41 mostró mayor porcentaje de supervivencia (45.8%) a la cepa del hongo en comparación con SCM334 (testigo resistente); 97 accesiones presentaron la mayor mortandad la cual fue de 100% (Cuadro 2).

Mora y Vargas (1981) utilizaron la variable supervivencia para la identificación de genotipos de chile con resistencia a P. capsici bajo condiciones de cielo abierto, de un total de 69 genotipos identificaron cuatro por presentar mayor porcentaje de supervivencia al Oomycete: Malayo, Tabasco, línea 56 de Jalapeño y línea 59 de malayo con 40, 53, 36 y 60%, respectivamente. La presión a la que se sometieron las 142 accesiones y los dos testigos en esta investigación fue elevada debido a que se utilizó una cepa altamente virulenta (Hernández-González, 2007; Robles-Yerena et al, 2010), prueba de ello fue que SCM334 tuvo una supervivencia de 20% (Cuadro 2).

Pozo (1983), menciona a SCM334 con supervivencia a P. capsici de 100%. Esto se debe a que los patógenos pueden presentar variabilidad en agresividad y en las accesiones de chile puede haber reacción variable a la enfermedad (Kelly y Vallejo, 2004).Asimismo, las evaluaciones de la enfermedad en diferentes zonas agroecológicas y/o etapas específicas del desarrollo fisiológico de la planta modifican los resultados de reacción al patógeno (Marcia y João, 2001).

Las 11 accesiones identificadas como resistentes en el presente estudio tienen uso potencial como nuevas fuentes de resistencia al fitopatógeno en programas de mejoramiento genético para la obtención de variedades/híbridos que permitan disminuir las pérdidas de rendimiento causadas por P. capsici. A pesar que estos materiales genéticos no amplificaron el marcador SCAR OpD04.717, pueden ser utilizados para la búsqueda de otros marcadores asociados a genes que confieren resistencia al Oomycete como: CaRGA2, CABPR1, CABGLU, CAPO1, CASC1 (Silvar et al, 2008; Zhang et al, 2013), o a los QTLs Phyto.4.1, Phyto.5.1, Phyto.6.1, Phyto.11.1 y Phyto12.1, localizadas en los cromosomas 4, 5, 11 y 12, respectivamente (Thabuis et al, 2003). Debido a que la resistencia a este fitopatógeno es poligénica (Pochard y Daubèze, 1980; Ogundiwin et al, 2005; Minamiyama et al., 2007), es difícil explicar la resistencia a la enfermedad mediante únicamente el marcador OpD04.717.

La selección asistida por marcadores moleculares (MAS) ha sido propuesta para facilitar el manejo de caracteres complejos como la resistencia a P. capsici en combinación con análisis fenotípicos como una vía fácil para introgresar altos niveles de resistencia al fitopatógeno en chile (Thabuis et al., 2004) o para seleccionar genotipos resistentes. Es necesario evaluar nuevamente las 11 accesiones sobresalientes para verificar la resistencia al hongo pero ahora bajo condiciones de invernadero/cielo abierto y evaluar otros caracteres de interés como rendimiento, precocidad, características de fruto (largo, diámetro, peso, color en madurez comercial), entre otros, y obtener progenie de cada uno de los materiales genéticos para realizar futuras investigaciones. El problema que se ha tenido en los programas de mejoramiento genético de chile al introgresar la resistencia a P. capsici utilizando como donador a SCM334 son las características desfavorables de fruto que este genotipo tiene, y este problema puede ser resuelto con alguna(s) de las accesiones identificadas.

 

Conclusiones

El marcador SCAR OpD04.717 no permitió la discriminación entre accesiones resistentes y susceptibles a P. capsici. Se identificaron 11 accesiones de chile serrano con resistencia al hongo mediante pruebas de reacción in vitro; de éstas, la accesión BGS41 mostró mayor porcentaje de supervivencia (45.8%) a la cepa del patógeno en comparación al testigo resistente SCM334 (20%). Existen accesiones de chile serrano con utilidad potencial como nuevas fuentes de resistencia a pudriciones de la raíz causada por P. capsici para programas de mejoramiento genético tradicional, pero no para selección asistida por marcadores moleculares mediante OpD04.717.

 

Agradecimientos

Los autores(as) agradecen al INIFAP (Proyecto 2324621897) por el financiamiento de este estudio.

 

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