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Introducción
Desde hace muchos años el guayabo se cultiva comercialmente y es una especie que se distribuye en los trópicos y subtrópicos de más de 50 países en el mundo. Los principales países donde se cultiva guayaba son: India, China, Tailandia, Paquistán, México, Filipinas, Egipto y Estados Unidos de América. En México, Michoacán y Aguascalientes son los principales estados productores de guayaba con calidad de exportación (SAGARPA, 2012). El material genético de guayaba en Calvillo, Aguascalientes, es de origen criollo, seleccionado por los productores, conocido como “China y Media china”. La variabilidad observada en los frutos de guayaba es amplia, en cuanto forma, tamaño de fruto, color de pulpa, espesor de casco, número de semillas por fruto (Padilla et al., 2007).
Las huertas en Calvillo, Aguascalientes, fueron establecidas inicialmente por semilla, el principal problema que se observa en la guayaba propagada por esta vía es que no garantiza la calidad del producto que se va a cosechar, por la variabilidad de la progenie (Mendoza et al., 2004). Las huertas presentan una alta variabilidad genética, lo que dificulta satisfacer las exigencias de uniformidad y calidad de la fruta para el mercado exterior. El control de plagas y enfermedades es deficiente, lo que repercute negativamente en el desarrollo del árbol (SAGARPA, Anexo B, 2011).
Mediante la propagación asexual se asegura que las plantas que se obtengan, presenten las mismas características de las plantas originales. En guayaba se utiliza el injerto, estacas, hijuelos de raíz y el acodo aéreo, siendo éste último el que más se practica. El problema con el acodo aéreo es que se necesita mucho material vegetativo para la propagación masiva (García, 2009). Otro tipo de propagación asexual es la propagación in vitro, que es la multiplicación de una especie a partir de un tejido u órgano bajo condiciones de asepsia, esta garantiza que las plantas regeneradas sean clones de la planta madre (Perales et al., 2005).
Se han llevado a cabo diversos estudios de micropropagación de guayabo basados en organogénesis directa o indirecta que fueron desarrollados a partir de explantes de meristemos y hojas jóvenes. Los resultados obtenidos de estos estudios mostraron altos índices de contaminación, oxidación y dependencia entre el genotipo y la respuesta organogenética, sin llegar a poder establecer in vitro el guayabo (Portal et al., 2003).
Para el establecimiento, multiplicación y enraizamiento de plantas leñosas como el guayabo se emplean diversos medios de cultivo, donde se puede destacar el medio Murashige y Skoog (MS) (1962). Es en esta etapa donde se realiza verdaderamente la micropropagación, obteniéndose un gran número de nuevos brotes a partir de cantidades mínimas de tejido (Pérez et al., 1999).
Las auxinas estimulan la elongación celular, las más utilizadas en cultivo in vitro son: ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido naftaleno acético (ANA), ácido indol acético (AIA) y el ácido indol 3 butírico (IBA). Las citocininas promueven la división celular en tejidos no meristemáticos y una de las más usadas es la Bencilaminopurina (BAP) (Trigiano y Gray, 2000). La etapa de regeneración in vitro no podría llevarse a cabo sin la adición de reguladores de crecimiento al medio de cultivo. Las auxinas estimulan la elongación celular y las citocininas promueven la división celular en tejidos no meristemáticos (Gutiérrez et al. 1998). Pallavi y Pravesh, (2012), obtuvieron un 80% de brotación con la aplicación de 3 mg L-1 de BAP y 0.1 mg L-1 de ANA. Los mejores resultados de regeneración in vitro fueron con 1 mg L-1 BAP y 160 mg L-1 adenina que obtuvieron hasta 3.2 brotes por explante. Roshan et al. (2007) en su investigación acerca de la regeneración in vitro del guayabo, establecieron explantes en medio de cultivo MS y obtuvieron mayor número de plántulas enraizadas con 2.5 mg L-1 IBA y 2.5 mg L-1IAA. Tariq et al. (2008) en su trabajo sobre regeneración in vitro de guayaba utilizaron para enraizar la combinación de 1.5 mg L-1 IBA y 0.5 mg L-1ANA, obteniendo hasta 85% de plántulas enraizadas.
Otros problemas importantes en la micropropagación del guayabo son la oxidación de los tejidos y la contaminación. Los antioxidantes más empleados en la propagación in vitro del guayabo son L-cisteína, polivinilpirrolidona (PVP), ácido ascórbico y ácido cítrico, existe una estrecha relación entre el origen del explante, su concentración de fenoles y el éxito del establecimiento in vitro (Concepción et al., 2005). Tagelsir et al. (2006) superaron la oxidación de los explantes en la etapa de establecimiento in vitro con el uso de carbón activado 1.5%, combinado con 1 mg L-1 de nitrato de plata, suplementado en el medio de cultivo MS. El establecimiento in vitro de especies leñosas está en gran medida limitado por el oscurecimiento de los explantes en el medio de cultivo, causado por la contaminación.
Es recomendable el uso de PVP y Carbón activado adicionados al medio de cultivo ya que remueven sustancias tóxicas (Azofeifa, 2009). Algunos autores evitaron la contaminación y la oxidación con explantes provenientes de plantas de semillas propagadas in vitro, debido a que las semillas son fáciles de desinfectar para su establecimiento in vitro (Tariq et al., 2008, Muhammad et al., 2012). Una alternativa previa a la micropropagación es que las plantas crezcan en condiciones de invernadero, con ello se reducen sustancialmente las tasas de contaminación (Levitus et al., 2010). En propagación in vitro de guayaba, los segmentos nodales deben medir hasta de 2 cm para facilitar su desinfección. Para remover compuestos fenólicos es suficiente el uso de 100 mg L-1 de PVP en combinación con 100 mg L-1 de ácido ascórbico.
El objetivo fue desarrollar y evaluar un protocolo óptimo para el establecimiento in vitro de la guayaba (Psidium guajava L.), mediante segmentos nodales de árboles en producción, para la reproducción masiva de genotipos de interés para los productores.
Materiales y métodos
Esta investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Aplicada en el Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes (ITEL), ubicado en el km 18 de la carretera Aguascalientes-San Luis Potosí, el Llano, Aguascalientes, México. Para la manipulación del material vegetativo se utilizaron pinzas y bisturís; la asepsia del material quirúrgico se realizó mediante inmersión en etanol 100% y flameo con mechero (Trigiano y Gray 2000).
Obtención y manejo del material vegetativo
La colecta de explantes de guayaba se realizó cada mes, de junio de 2012 a junio de 2013. Como plantas madre se utilizaron guayabos en etapa de producción de una huerta ubicada a los 22° 08´ 56´´ latitud norte y 102° 25´ 20´´ longitud oeste, en La Mezquitera, San Tadeo, Calvillo, Aguascalientes.
Asepsia y medio de cultivo inicial
En esta parte del trabajo experimental se utilizaron explantes completos, sin dividirlos en segmentos. Para tener un establecimiento aséptico, primero se evaluaron tres tratamientos con cuatro fungicidas, dos sistémicos: Benomyl y Carbendazim, uno de contacto, oxicloruro de cobre y uno natural, fractal (extracto de semillas de cítricos) en diferentes concentraciones y combinaciones, en un diseño completamente al azar con tres tratamientos y siete repeticiones, se registró el porcentaje de asepsia, los explantes se mantuvieron en agitación durante dos horas, la unidad experimental fue un frasco de boca ancha de 250 ml, con la solución de cada tratamiento, en el que se introdujeron diez explantes (Cuadro 1).
Cuadro 1 Tratamientos con fungicidas para el establecimiento in vitro de los explantes de guayabo.
| Tratamiento | Descripción |
| 1 | Benomyl 2 g L-1, carbendazim 2 g L-1 y oxicloruro de cobre 1 g L-1 |
| 2 | Benomyl 2 g L-1 y fractal 12 ml L-1 |
| 3 | Benomyl 1 g L-1, oxicloruro de cobre 1 g L-1y y fractal 12 ml L-1 |
Para evitar la oxidación y mantener vivos los explantes, propiciando su desarrollo y establecimiento durante el lavado, se evaluaron también cuatro tratamientos con diferentes antioxidantes y desinfectantes como: PVP, cloro, etanol, tween, ácido cítrico y ácido ascórbico en un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos y cuatro repeticiones, la unidad experimental fue un frasco de boca ancha de 250 ml, con la solución de cada tratamiento, en el que se introdujeron diez explantes (Cuadro 2). Se registró el porcentaje de sobrevivencia.
Cuadro 2 Tratamientos con antioxidantes y desinfectantes en la solución de lavado de los explantes.
| Tratamiento | Descripción |
| 1 | PVP 0.5 g L-1 , cloro 5% y etanol 70% |
| 2 | Ácido cítrico 0.2%, ácido ascórbico 0.6% y cloro 15% |
| 3 | PVP0.5%, cloro 5% y 3 gotas de tween20 |
| 4 | Ácido ascórbico 0.15 g L-1, ácido cítrico 0.2 g L-1 y cloro 5% |
Los explantes fueron colocados en una solución que contenía agua destilada estéril con los antioxidantes y desinfectantes; dependiendo de cada tratamiento, para evitar la oxidación durante el traslado al laboratorio.
Para definir el medio de cultivo inicial para el establecimiento in vitro del guayabo, se evaluaron cuatro tratamientos con siete repeticiones (Cuadro 3), utilizando un diseño completamente al azar, donde la unidad experimental fue un frasco “Gerber” con cinco explantes. En este experimento no se incluyó un testigo, porque sin el uso de fungicidas se contaminan todos los explantes debido a que provienen de campo.
Cuadro 3 Tratamientos evaluados para definir el medio de cultivo inicial.
| Tratamiento | Descripción |
| 1 | MS+PVP0.75gL y carbón activa 2gL-1 |
| 2 | MS + ácido cítrico 0.1 g L-1+ ácido ascórbico 0.1 g L-1 y carbón activado 2 g L-1 |
| 3 | MS + nitrato de plata lx 10-3g L-1 y carbón activado 1.5% |
El medio de cultivo MS se suplementó con 1 mg L-1 de Benomyl y 0.50 g L-1 del antibiótico Cefotaxima para mantener a los explantes sin contaminar, lo cuales se retiraron del medio en un lapso de 15 días, disminuyendo gradualmente la concentración. Cefotaxima es reportado como un antibiótico que no daña a los cultivos vegetales (Licea-Moreno et al., 2007).
Multiplicación in vitro
Para esta parte del estudio se dividieron los explantes en segmentos nodales uno y dos, cada uno de 0.5 cm de largo, los cuales fueron colocados en medio MS suplementado con 30 g L-1 azúcar y 7.5 g L-1 agar. Para la inducción de brotes se evaluaron seis tratamientos (Cuadro 4), de los cuales cuatro fueron adicionados con reguladores de crecimiento y los últimos dos tratamientos fueron testigos sin reguladores de crecimiento, utilizándose un diseño completamente al azar con seis tratamientos y siete repeticiones, tomando como unidad experimental un frasco Gerber con un explante. Las variables evaluadas fueron longitud de brotes y número de hojas por brote y se registraron a los 40 días. Las condiciones ambientales del cuarto de incubación fueron una temperatura de 25 ± 2 °C, fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad y una intensidad lumínica de 2000 lux. Para procesar los datos de todos los experimentos se utilizó el paquete estadístico SAS versión 8, en donde se realizó el análisis de varianza (ANOVA) y las pruebas de comparación de medias (Duncan 5%).
Cuadro 4 Tratamientos evaluados para la multiplicación in vitro del guayabo.
| Tratamiento | Descripción |
| 1 | Segmento nodal uno y 1 mg L -1 ВАР |
| 2 | Segmento nodal dos y 1 mg L -1 ВАР |
| 3 | Segmento nodal uno y 0.5 mg L-1 ВАР + 0.1 mg L-1 IBA |
| 4 | Segmento nodal dos y 0.5 mg L-1 ВАР +0.1 mg L-1 IBA |
| 5 | Segmento nodal uno, testigo |
| 6 | Segmento nodal dos, testigo |
Los brotes regenerados in vitro fueron enraizados con 1 mg L-1 IBA, tratamiento ya probado durante varios años en experimentos realizados en nuestro Instituto. La aclimatación de las plantas se realizó de manera gradual con el usó del Fractal, fungicida/bactericida de origen natural y no se presentaron problemas de contaminación.
Identificación de microorganismos contaminantes del medio de cultivo
Se tomaron muestras de colonias o crecimientos de microorganismos de los medios de cultivo contaminados, se aislaron y se cultivaron en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA). Una vez desarrolladas las colonias, se realizó la identificación de los microorganismos contaminantes con base en claves, fotografías y con el microscopio compuesto.
Resultados y discusión
Asepsia y medio de cultivo inicial
Es importante resaltar que se trabajó con explantes obtenidos de árboles en producción y de acuerdo con las colectas realizadas durante todo un año y a diferentes horas del día, se concluye que la mejor época para obtener material vegetativo de plantas de guayaba en campo, es de abril a junio lo más temprano posible. Lo cual coincide con lo reportado por Amin y Jaiswal´s (1987) quienes encontraron menor contaminación de los explantes en los meses de abril a junio.
De acuerdo con los resultados obtenidos con los fungicidas, el tratamiento uno, Benomyl 2 g L-1, Carbendazim 2 g L-1 y oxicloruro de cobre 1 g L-1 presentó el mayor porcentaje de desinfección, un 60%, de acuerdo con la prueba de comparación de medias (Cuadro 5). De acuerdo con la literatura revisada, los mejores resultados se obtienen con una mayor la concentración de los fungicidas sistémicos y menor del de contacto, con mayor razón al trabajar con material vegetativo de campo, por ejemplo, Ramírez et al. (2000) utilizaron una concentración más alta del fungicida sistémico para una mayor penetración en el tejido. Aunque al utilizar solo fungicidas sistémicos los resultados no son satisfactorios, como lo mencionan Flores-Mora et al. (2009) quienes utilizaron hasta 6 g L-1 de benomyl en el establecimiento in vitro, y solo obtuvieron un 31.67% de explantes limpios. El efecto de la posición de segmentos nodales de guayaba también es importante, como lo reportan Shekafandeh y Khosh-khui (2008), que usaron Benomyl 4 g L-1 durante el periodo de 30 a 45 min en combinación con Hg2Cl 0.2 g L-1 por 2 min y superaron la parte de asepsia.
Cuadro 5 Respuesta al tratamiento con fungicidas en la asepsia de los explantes de guayaba.
| Tratamiento | Medias (% de asepsia) |
| 1. Benomyl 2 g L-1, carbendazim 2 g L-1 y oxicloruro de cobre 1 g L-1 | 60.0 b |
| 2. Benomyl 2 g L-1 y fractal 12 ml L-1 | 42.9 b |
| 3. Benomyl 1 g L-1, oxicloruro de cobre l gL-1 y Fractal 12ml L-1 | 8.6 a |
*Medias con la misma literal son estadísticamente iguales (Duncan, p≤ 0.05).
Los mejores resultados obtenidos con los antioxidantes y desinfectantes, se presentaron con el tratamiento tres, PVP 0.5%, cloro 5% y 3 gotas de tween 20 (Cuadro 6). Los explantes se mantuvieron sin oxidar hasta por 24 h. El tratamiento uno obtuvo solo 10% de sobrevivencia posiblemente debido al etanol 70%, que en otros tejidos presenta buenos resultados, pero no en especies leñosas como el guayabo.
Cuadro 6 Efectos agentes antioxidantes en la solución de lavado de los explantes.
| Tratamiento | Medias (% de sobrevivencia) |
| 1.РVР0.5 g L-1, с1ога5% у еtаnоl70% | 10.0 a |
| 2. Ácido cítrico 0.2%, ácido ascórbico 0.6% y cloro 5% | 30.0 ab |
| 3. PVP 0.5%, cloro 5% y 3 gotas de tween 20 | 90.0 c |
| 4. Ácido ascórbico 0.15 g L-1, ácido cítrico 0.2 g 1-1 y cloro 5% | 50.0 b |
*Medias con la misma literal son estadísticamente iguales (Duncan, p≤ 0.05).
El mejor tratamiento obtuvo 90% de sobrevivencia de los explantes; similar a lo reportado por Ocampo y Núñez (2007), quienes probaron como desinfectante, cloro al 5% con 3 gotas de Tween en agitación durante 10 min y bicloruro de mercurio al 0.05%, durante 2 min, los dos tratamientos presentaron buenos resultados, pero optaron por el primero, debido a que es de fácil manejo y no es tóxico; es importante señalar, que trabajaron con plantas jóvenes en invernadero. Liu y Yang (2011) en su trabajo de propagación in vitro de guayaba a partir de segmentos nodales de árboles maduros, lavaron los explantes para evitar la oxidación con PVP 0.5% durante 40 min, suplementaron el medio de cultivo MS con 250 mg L-1 de PVP y obtuvieron un 53.3% de sobrevivencia, menor a lo obtenido en este estudio.
Los tres tratamientos para evaluación del medio de cultivo inicial mostraron buenos resultados, manteniendo a los explantes libres de oxidación y contaminación. Se eligió el tratamiento uno con PVP 0.75 g L-1 y Carbón activado 2 g L-1, debido a que fue el tratamiento modificado por los autores de este trabajo y que numéricamente obtuvo los mejores resultados (Cuadro 7).
Cuadro 7 Resultados de los tratamientos evaluados para el medio de cultivo inicial.
| Tratamiento | Descripción | Medias (% de sobrevivencia) | Referencia |
| 1 | PVP 0.75 g L-1 y carbón activado 2 g L-1 | 94.82 a | Modificado (2013). |
| 2 | Ácido cítrico 0.1 g L-1, ácido ascórbico 0.1 g L-1 y carbón activado 2 g L-1 | 94 82 a | Shekafandeh y Khosh Khui (2008). |
| 3 | Nitrato de plata 1 x 10-3 g L-1 y Carbón activado 1.5% | 85.71a | Tagelsir et al. (2006). |
*Medias con la misma literal son estadísticamente iguales (Duncan, p≤ 0.05).
Los tres tratamientos evaluados para la elección del medio de cultivo inicial, presentaron buenos resultados por los altos porcentajes de sobrevivencia de 85.71 a 94.82%, aunque no hubo diferencias estadísticas significativas, de acuerdo con el análisis de varianza. Saelew y Yang (2009) obtuvieron resultados diferentes en su estudio sobre la propagación in vitro de Psidium guajava L. con el uso de ápices en medio MS y para evitar la oxidación suplementaron el medio de cultivo con ácido ascórbico 100 mg L-1 y ácido cítrico 150 mg L-1, la mayor brotación, 78.8%, la tuvieron con 2 mg L-1 BAP y 0.1 mg L-1 de IBA.
Multiplicación in vitro
De acuerdo con los resultados obtenidos en la regeneración in vitro a partir de los segmentos nodales de guayaba los tratamientos con reguladores del crecimiento fueron iguales, solo los dos testigos presentaron diferencias estadísticamente significativas (Cuadro 9).
Cuadro 9 Resultados de los tratamientos para regeneración in vitro.
| Tratamiento | Medias (Longitud de brotes en cm ) | Medias (Núm. De hojas/brote) |
| 1. Segmento nodal uno, 1 mg L-1 ВАР | 1.0429 ab | 2.143 ab |
| 2. Segmento nodal dos, 1 mg L-1 ВАР | 0.8857 ab | 2.857 ab |
| 3. Segmento nodal uno, 0.5 mg L-1 BAP + 0.1mg L-1 IBA | 1.4857 a | 3.000 a |
| 4. Segmento nodal dos, 0.5 mg L-1 BAP + 0.1 mg L-1 IBA | 0.9857 ab | 2.571 ab |
| 5. Segmento nodal uno, testigo | 0.0714 b | 0.286 b |
| 6. Segmento nodal dos, testigo | 0.100 b | 0.286 b |
*Medias con la misma literal son estadísticamente iguales (Duncan, p≤ 0.05).
El tratamiento tres obtuvo brotes de 1.4 cm de longitud y tres hojas por brote. Kumar et al. (2009) en su trabajo sobre regeneración in vitro del guayabo, utilizaron segmentos nodales que establecieron en medio MS, la mayor brotación fue con 1 mg L-1 de BAP y desarrollaron 2.45 brotes por explante y el tratamiento óptimo para inducir raíz fue 1 mg L-1 de IBA. Ali et al. (2003) en su trabajo sobre micropropagación in vitro de guayaba, utilizaron segmentos nodales establecidos en medio MS, obtuvieron hasta 3.72 brotes por explantes con una longitud de hasta 3 cm con 2 mg L-1 BAP, reportaron haber tenido mejores resultados en la formación de raíces al utilizar 1 mg L-1 de IBA, con raíces de hasta 5.4 cm de longitud. Tagelsir et al. (2006) reportaron el tratamiento de 1 mg L-1 IBA como el más efectivo para el enraizamiento de Psidium guajava L. Muhammad et al. (2012) después de superar la etapa de multiplicación in vitro e inducir la formación de raíces de las plántulas, las aclimataron gradualmente al colocarlas en macetas con composta.
El protocolo completo estandarizado, obtenido de este estudio, para el establecimiento in vitro de guayaba mediante segmentos nodales se muestra en el Cuadro 10.
Cuadro 10 Protocolo estandarizado para la multiplicación in vitro del guayabo a partir de segmentos nodales.
Identificación de microorganismos contaminantes del medio de cultivo
Se identificaron dos tipos de hongos: Aspergillus sp. y Alternaria sp. En Aspergillus, los conidios constituyen cadenas que se originan en la célula conidiógena o fiálide. En Aspergillus se observaron células adyacentes a las fiálides denominadas métulas o células de soporte. El segundo hongo identificado fue Alternaria sp. que posee conidióforos primarios largos con conidios en cadenas ramificadas. La ramificación ocurre predominantemente desde el ápice conidial y el conidio primario puede alcanzar hasta dos veces el tamaño del conidio siguiente llevando un corto conidióforo secundario (Barnet y Hunter, 1972). Los resultados concuerdan con los reportados por Acosta et al. (2002) quienes en su trabajo sobre la micobiota epifítica y contaminantes fungosos durante el establecimiento in vitro de la guayaba (Psidium guajava L.) identificaron nueve géneros de hongos filamentosos entre los que destacan Aspergillus sp. y Alternaria sp., concluyeron que los explantes se pueden establecer in vitro mediante el uso de antibióticos, fungicidas y antioxidantes en el medio de cultivo. Los hongos contaminantes en el establecimiento in vitro de Psidium guajava L. están localizados dentro de la superficie de los segmentos nodales, lo que impide la acción de los desinfectantes superficiales usados. Entre los hongos patógenos identificados en cultivo in vitro de guayaba se encuentran Aspergillus sp. y Alternaria sp. (Ramírez et al., 2000).
Conclusiones
Se desarrolló, se probó y se propone un protocolo para la propagación in vitro de guayaba a partir de segmentos nodales obtenidos de árboles en campo (Cuadro 10). En la etapa de asepsia el mejor tratamiento fue la combinación de los fungicidas Benomyl 2 g L-1, Carbendazim 2 g L-1 y oxicloruro de cobre 1 g L-1. La oxidación del material vegetal se superó, al colectar los explantes lo más temprano posible, en los meses de abril a junio y utilizando PVP al 0.5% con cloro 5% y 3 gotas de tween 20; logrando así su establecimiento aséptico. En la evaluación del medio de cultivo inicial no hubo diferencias estadísticas, pero se eligió el tratamiento uno, PVP 0.75 g L-1 y Carbón activado 2 g L-1. En la etapa de multiplicación todos los tratamientos con reguladores del crecimiento fueron estadísticamente iguales. Se realizó la identificación microscópica de los dos hongos contaminantes durante la propagación in vitro del guayabo, Aspergillus sp. y Alternaria sp.
