Introducción

Dasylirion cedrosanum Trel., conocida comúnmente como "Sotol" es una planta perenne, dioica, policárpica y semicilíndrica que pertenece a la familia Asparagaceae (Trópicos.org). Es una especie con mayor presencia en la región noreste del país, principalmente en los estados de Chihuahua, Durango, Zacatecas y Coahuila. En Coahuila crece en matorral rosetófilo, el cual representó 6% de toda la vegetación del estado (^{Rzedowski y Rzedowski, 1990}). Presenta una gran importancia comercial, destacándose en la elaboración de bebidas en la región noreste del país. Actualmente a los estados anteriormente mencionados se les ha otorgado la denominación de origen (^{Rodríguez-Gómez, 2007}). Esto demanda un aseguramiento de la calidad del producto para los consumidores pero a la vez apunta hacia un aprovechamiento racional.

En los sistemas tradicionales de clasificación, el género Dasylirion se ha colocado en familias diferentes, como las Agavaceae, Liliaceae y Dracaenaceae (^{Dahlgren et al., 1985}). Esto ha dependido del carácter taxonómico del estudio que se haya empleado, encontrándose similitud morfológica con varias especies de estas familias. Recientemente se le ubica en la familia Asparagaceae y subfamilia Nolinoideae (^{USDA, ARS, National Genetic Resources Program GRIN, 2013}). El género Dasylirion se compone de 16 especies, todas ellas con rasgos distintivos (^{Melgoza y Sierra, 2003}). Uno de ellos es la forma de las hojas. Sobre esto, ^{Bogler (1994}) menciona que las hojas de las plantas de este género presentan algunas variaciones como la longitud y amplitud, la orientación de las espinas en el margen, la presencia o ausencia de cera epicuticular, así como la forma de su superficie foliar. La presencia de diferentes tipos de cristales en el mesófilo de las monocotiledóneas han demostrado ser de importancia taxonómica para distinguir entre algunas familias (^{Prychid y Rudall, 2000}).

El objetivo del presente trabajo es estudiar la morfología y la anatomía de las hojas de la especie D. cedrosanum en diferentes etapas de desarrollo con el propósito de identificar posibles cambios en el desarrollo morfo-anatómicos de la especie.

Materiales y métodos

Anatomía de la superficie foliar. El experimento se llevó a cabo en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. El material vegetal utilizado consistió en plantas de sotol de (6, 30, 60 y 84 meses de edad), ejemplares que fueron colectados del vivero botánico de la misma Universidad. Las variables estudiadas fueron; densidad estomática abaxial y adaxial, índice estomático abaxial y adaxial. Para el estudio de la anatomía foliar, se colectaron dos hojas erectas de la porción media del caudex de cuatro plantas de cada edad (6, 30, 60 y 84 meses), con el propósito de diferenciar el grado de desarrollo de los tejidos. De cada hoja se obtuvo una impresión de las superficies abaxial y adaxial, para ello se aplicó una película de esmalte transparente para uñas, sobre la superficie foliar con un pincel, después de que se secó la película, esta fue removida con un trozo de cinta adhesiva transparente, la cual se montó sobre un portaobjetos.

En cada impresión se observaron al azar cinco campos por hoja en un microscopio marca VistaVision con el objetivo 40 X, de cada observación se contó el número de estomas y de células epidérmicas. Con los datos obtenidos se estimó la densidad estomática y el índice estomático de la siguiente forma: DE= número de estomas / 0.1589 mm² (área del campo visual)= estomas por mm². Para determinar el índice estomático (IE) se utilizó la siguiente fórmula:

IE= DES / DEP + DES x 100.

Donde: IE= índice estomático, DES= densidad estomática (estomas por mm²), DEP= densidad de células epidérmicas ordinarias (células por mm²) en la misma unidad de área.

La descripción morfológica se hizo de acuerdo con la terminología de ^{Carpenter (2005)}.

Histología de tejidos epidérmicos, fundamentales y vasculares. Para el análisis de los tejidos se extrajeron secciones transversales y paradermales de la parte media de las hojas, en este apartado se estudiaron las siguientes variables: Grosor de cutícula (μm), tamaño de células epidérmicas (μm²), estratos de parénquima- en empalizada, tamaño de parénquima en empalizada (μm²), estratos de parénquima esponjoso, tamaño de parénquima esponjoso (μm²), tamaño de esclereidas (μm²), axis derecho-izquierdo del mesófilo (μm), axis abaxial-adaxial del mesófilo (μm), número de haces vasculares, elementos de vasos del xilema (μm²), elementos de tubo del floema (μm²).

El manejo de los tejidos se realizó siguiendo la metodología propuesta por ^{Hernández (1990)}, primero se fijaron en FAA (formaldehído (36-40 %) 5 cc, Alcohol etílico al (70%) 90 cc y ácido acético glacial 5 cc). con el cual se consigue detener el metabolismo celular de los tejidos. Después de siete días, se deshidrataron a intervalos de una hora en alcohol al 60%, 70%, 85%, y 96% y en mezclas de alcohol absoluto-xilol en proporciones 3:1, 1:1 y 1:3 y se incluyeron en parafina.

Se obtuvieron cortes de 20 μm de grosor empleando un micrótomo de rotación y se adhirieron a un portaobjetos con el adhesivo de Haupt. Los tejidos se tiñeron con safranina y verde rápido de acuerdo a la metodología del mismo autor arriba mencionado. Para su observación al microscopio se tomaron 5 campos al azar en diferentes objetivos (5 X, 40 X y 100 X). Se utilizó un microscopio marca VistaVision con cámara digital integrada Pixera Wiender Pro. Las mediciones de las imágenes de los tejidos se realizaron con el software Axion Vision 4.6. La descripción de los caracteres anatómicos se hizo de acuerdo con la terminología de ^{Evert (2006)}.

Resultados y discusión

Anatomía de la superficie foliar. De acuerdo con los tipos estomáticos de ^{Prabhakar (2004)}, las estomas son anfiestomaticas de tipo paracítico. En las monocotiledóneas el tipo de estoma paracítico solo ha sido observada en especies de la familia Poaceae y Cyperaceae (^{Zarinkamar, 2006)}. ^{Stebbins y Khush (1961)} estudiaron los complejos estomáticos de 192 especies de monocotiledóneas, encontrando una correlación entre el número de células subsidiarias de las estomas con otras características de las plantas como el hábito de crecimiento de las plantas maduras y la distribución geográfica.

La densidad estomática de las superficies adaxial y abaxial oscila entre 46.8-65.0 estomas mm^-2 y la densidad de células tabloides entre 163 y 339 mm^-2. El índice estomático muestra valores entre 14.0-23.3 (Cuadro 1). En la evaluación de las cuatro edades reveló que la densidad estomática es mayor en plantas de sotol de 7 años tanto en la superficie adaxial con 63.22 estomas mm^-2 como abaxial con 60.22 estomas mm^-2 y en menor cantidad las plantas de 2,5 años en la superficie adaxial con 41.44 estomas mm^-2 y en abaxial con 39.2 estomas/mm². Para las superficies, la densidad estomática es ligeramente mayor en la superficie adaxial con un promedio de 55.015 estomas mm^-2 por 51.705 estomas mm^-2 en la superficie abaxial. En ningún caso se observaron diferencias significativas entre ambas superficies

Cuadro 1 Valores medios de la superficie foliar, tejidos epidérmicos, fundamental y vascular en hojas de sotol Dasylirion cedrosanum Trel. 

†Medias. *desviación estándar. Ad= adaxial; Ab= abaxial.

Al evaluar el índice estomático resulta ser bajo, aspecto observado en otras especies de monocotiledóneas que crecen en zonas áridas, como es el caso de la especie Urginea indica que presenta un índice estomático de 14-25, por lo que es similar a D. cedrosanum (Liliaceae) (^{Kameshwari, 2011}). La dominancia estomática abaxial es una característica común en varias especies de dicotiledóeneas y monocotiledóneas con estomas ambiestomáticos (^{Croxdale, 2000}); sin embargo, en

D. cedrosanum no se observa esta diferencia. La diferencia numérica de las estomas en ambas superficies, más bien ha sido relacionada con factores ambientales como la concentración de CO₂, intensidad lumínica o la disponibilidad de agua (^{Radoglou y Jarvis, 1990}; ^{Kouwenberg et al, 2003}).Además, hay evidencia que sugiere que dependiendo de la composición de la cera epidérmica, el índice estomático puede aumentar en alguna de las dos superficies (^{Holroyd et al, 2002}).

Por otra parte, los estomas ocurren de manera diversa en los diferentes ambientes (^{Qiang et al., 2003}). Una modificación recurrente de las plantas es en la distribución y frecuencia estomática, los cuales han sido usadas como caracteres taxonómicos por debajo del nivel de familia en angiospermas, así como en su filogenia (^{Mukherjee et al., 2000}). Dentro de la familia Asparagaceae, la subfamilia Nolinoideae ha sido poco estudiada en su anatomía, y menos aún en el género Dasylirion (^{Bogler, 1994}). Como resultado de algunos estudios filogenéticos publicados y con base en evidencias morfológicas y moleculares, Dasylirion ha sido ubicado como subfamilia Nolinoideae dentro de Asparagaceae (^{APG III, 2009}).

Las células subsidiarias, se disponen en forma de placas columnares, se encuentran dispuestas en los extremos del axis y costados de la apertura estomática, dando un aspecto de cuadro. Las estomas se encuentran dispuestos en filas paralelas al eje longitudinal de la hoja en conjuntos de tres a seis estomas en la parte media de la hoja. Las células tabloides son alargadas poligonales orientadas de la misma manera que los estomas (Figura 1A). La epidermis es glauca. Este color es producido por la presencia de cera epicuticular, la cual se orienta en forma paralela, disposición denominada "tipo convalaria" (^{Barthlot et al, 1998}). Presenta papilas sobresalientes, agrupadas y alineadas junto con las estomas que la ubican a un nivel inferior.

Figura 1 Anatomía foliar de Dasylirion cedrosanum. A. Superficie adaxial a 10 X en plantas de 6 meses. B. Sección transversal a 40 X de la epidermis abaxial de plantas de 6 meses. C. Mesófilo a 5 X de plantas de 6 meses. D. Mesófilo a 5 X de plantas de 84 meses: E. Haz vascular de primer orden en mesófilo de plantas de 84 meses. F. Haz vascular de tercer orden en el mesófilo de plantas de 84 meses. C= cera; Cr= cristales; Pp= papilas; Ce= células epidérmicas; co= células oclusivas; Ce= células subsidiarias; Cs= cámara subestomática; Ct= Cutícula; P= parénquima; Pe= parénquima en empalizada; Ps= parénquima esponjoso; Hv= haz vascular; Mx= metaxilema; Mf= metafloema; Pf= protofloema obliterado; Px= protoxilema obliterado 

Las células epidérmicas abaxial y adaxial, vistas en sección transversal, son unistratas e isodiamétricas con paredes primarias lisas tanto en la epidermis adaxial como abaxial. Presentan en promedio una cutícula de mayor grosor en el lado adaxial (Cuadro 1). Solo las células epidérmicas de la superficie adaxial en plantas de 84 meses de edad, son significativamente más grandes, mientras que en la superficie abaxial se muestra lo contrario. Las células guarda de las estomas se muestran hundidas abajo del nivel de las células epidérmicas (Figura 1B).

El mesófilo es isolateral (Figura 1C, D). Las células del parénquima en empalizada son de forma prismática, se observa multiestratificada y están desarrolladas hacia ambas superficies. El parénquima esponjoso muestra células de forma isodiamétrica. El número de estratos del parénquima esponjoso aumenta conforme la planta tiene mayor edad; el lado adaxial mostró mayor número de estratos (Cuadro 1). En las plantas de 30, 60 y 84 meses el mesófilo presenta tejido fibroso de un tamaño entre 71-103 μm, similar en todas las edades. Estas fibras se asocian con las bandas vasculares, tomando la forma de "Y" o Y invertida en las filas abaxial y adaxial respectivamente (Figura 1 E, F), las cuales se prolongan hacia la epidermis en forma de vigas. Además, en el mesófilo es posible observar la presencia de cristales del tipo estiloides o prismáticos de forma cuboidal, los cuales se encuentran solitarios en las células parenquimáticas y esclerenquimáticas cercanas a los haces vasculares (Figura 1F).

De varios rasgos que presentan las hojas de las plantas, los de la superficie foliar son quizá los más significativos desde el punto de vista sistemático y de la filogenia. La estructura de las ceras epicuticulares caracteriza a grandes grupos de monocotiledóneas. En éstos se ha observado en abundancia dos tipos de ceras, las que tienen forma de varillas agregadas en forma longitudinal y aquellas orientadas en forma de placas paralelas, estas últimas encontradas en la familia Nolinaceae (^{Chase et al, 1995}).

El mesófilo en D. cedrosanum presenta atribuciones que le permiten a la planta adaptarse en ambientes áridos. Por ejemplo, la disposición isolateral de las hojas permite a la especie ser capaz de grandes tasas fotosintéticas por unidad de biomasa en ambientes de alta luminosidad aún en ambientes semiáridos (^{Knight y Robert, 1994}). La presencia de fibras también es auxiliar en el transporte de agua a través de los tejidos en empalizada (^{Rotondi et al, 2003}). Otra característica importante es la presencia cristales prismáticos de forma cuboidal el cual ha sido observado en otras especies pertenecientes a diferentes órdenes de monocotiledóneas como las Asparagales, Liliales y Pandanales. No se sabe con certeza la función que estos presentan en los tejidos, a menudo se menciona que su función es la de servir como depósito de desechos metabólicos los cuales podrían ser tóxicos para las células o tejidos (^{Prychid y Rudall, 1999}); sin embargo, se ha reconocido que el tipo de cristal presente puede tomarse como un carácter taxonómico (^{Prychid y Rudall, 2000}).

Los haces vasculares, se encuentran organizados en bandas, posicionadas en tres filas arqueadas paralelas a la curvatura del mesófilo, reconocidas como fila adaxial, central y abaxial. En particular el arreglo de cada banda en estas plantas puede ser categorizada de manera similar a las de las plantas crasas. Esto debido a la disposición diferente del xilema y floema en cada una de ellas dependiendo de su tamaño (Cutler et al., 2007). Así por ejemplo, las más grandes representan las de primer orden (Hv1), con la diferencia de que el conjunto de vasos del metaxilema es separado en la parte media por protoxilemas obliterados. El conjunto floemático en estas bandas se dispone hacia el polo abaxial (haz colateral) separada por una viga de células esclerenquimáticas, los cuáles a la vez junto con el xilema encierran al conjunto floemático (Figura 1E).

Se encuentra también las de segundo orden (Hv2), en el que no existe protoxilema obliterado y el conjunto floemático sigue dividido por esclerénquimas. Y las de tercer orden (Hv3), en la que además de no existir protoxilema, se observa que el conjunto floemático no se encuentra dividido por tejido esclerenquimatoso (Figura 1F). La cantidad de haces vasculares es mayor por el lado adaxial y aumenta conforme la planta crece (Cuadro 1). El tamaño es similar en todas las edades. Los elementos de vaso presentan perforación simple, con paredes engrosadas.

Por otra parte, el arreglo del tejido vascular observada en esta especie ha sido interpretado como una adaptación a la rápida toma de agua durante breves períodos de disponibilidad hídrica (^{Carlquist y Schneider, 2006}).

Conclusión

Dasylirion cedrosanum es una especie que en su anatomía foliar presenta varias características similares a otras especies del mismo género. Las variables densidad estomática, índice estomático y densidad de células epidérmicas no exhiben diferencias entre edades. El parénquima en empalizada se incrementa con la edad. En este estudio resaltan algunas características morfológicas de las hojas en la que el arreglo de los tejidos del mesófilo podría ser característico de la especie.