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Introducción
La variedad Durum de Triticum turgidum L., conocida como trigo duro o cristalino, es resultado de cruzas naturales de dos especies diploides originarias del mediterráneo (Huerta y Skovmand, 2000). El 90% del trigo de temporal que se produce en México se siembra durante la primavera o al inicio del verano; meses que coinciden con la época de lluvias y la humedad es el factor que más contribuye al proceso infectivo enfermedades del trigo causadas por hongos. La roya de la hoja o roya café es la más común del trigo y es causada por el hongo Puccinia triticina E., principalmente afecta las láminas foliares y la severidad depende de las densidades del inóculo y la susceptibilidad del genotipo (Huerta y Singh, 2000).
La presencia de una nueva raza de la roya de la hoja (BBG/ BN), detectada en el Noroeste de México en el año 2001, se caracteriza por infectar trigos duros. Por ello, es de suma importancia desarrollar variedades de trigos duros que muestren resistencia a todas las razas de roya de la hoja (Huerta y Skovmand, 2000). El mejoramiento genético convencional ha sido la mejor vía para la obtención de líneas resistentes a la roya; producto de ello se han liberado en México las variedades "Jupare C2001", "Banamichi" y "Samayoa" (Huerta y Skovmand., 2000). Las cruzas de trigo susceptible de primavera con progenitores resistentes de hábito invernal han permitido identificar genotipos resistentes con hábito de primavera, los cuales poseen un buen tipo agronómico. Estas líneas pueden usarse como fuentes de resistencia a roya en un programa de mejoramiento y emplear el gen dominante, que permanece efectivo en contra de la raza de roya más común ahora en México (BBG/BPC), en combinación con otros genes.
Una estrategia importante en el mejoramiento genético en trigo ha sido cruzar una variedad susceptible con una resistente y así determinar tanto el tipo de acción génica, como el número de genes que confieren la resistencia. Es posible que entre genes dominantes y recesivos, o combinaciones, se confiera resistencia en estado de plántula en donde se presentan dos genes recesivos duplicados que pueden ser heredados de forma independiente (Zhang y Knott, 1990). Así se generaron los genotipos "Mirlo 26" y "Elinia 48", identificados como resistentes, cruzados con el genotipo "Atred", susceptible a la roya.
El cultivo de tejidos vegetales in vitro es una opción para optimizar la evaluación de plantas resistentes y susceptibles a roya de la hoja. Con sus diversas técnicas es posible evaluar la respuesta de variedades de trigo a la roya en condiciones in vitro en un espacio reducido y de manera eficaz comparada con las evaluaciones en campo e invernadero. A partir de un segmento de tejido se puede obtener gran cantidad de plantas genéticamente uniformes y libres de enfermedades (Shaom et al, 2008). En campo, una semilla genera una planta; sin embargo, con las técnicas in vitro se obtienen lotes de plantas sanas útiles para diversos estudios. Con base en estos antecedentes, la presente investigación tuvo como objetivo caracterizar la respuesta de los genotipos de trigo "Atred" (susceptible, S), "Mirlo 26" (resistente, R) y "Elinia 48" (resistente, R) a la roya de la hoja Puccina triticina E., inoculada en plantas aclimatadas obtenidas vía organogénesis y en plántulas mantenidas en condiciones in vitro.
Materiales y métodos
Material vegetal
Se utilizaron semillas de los genotipos "Atred (S)", "Elinia 48 (R)" y "Mirlo 26 (R)". El primero con características de susceptibilidad a la roya de la hoja y los dos restantes considerados resistentes. Las semillas fueron proporcionadas por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) Campo Experimental Valle de México (CEVAMEX).
Medio de cultivo y condiciones de incubación
El medio de cultivo básico empleado estuvo constituido por sales minerales del medio Murashige y Skoog (1962) (Sigma Aldrich® M5519, 4.4 g L-1), adicionado con sacarosa (30 g L-1). El pH fue de 5.7 ± 0.1 ajustado con NaOH o HCl 1N, mediante un potenciómetro (Thermo Scientific® Orion 3 Star meter). Se agregó phytagel (Sigma®, 2.5 g L-1) como agente gelificante. La esterilización del medio de cultivo se hizo en autoclave vertical (AESA®, modelo 300) a 121 oC y 1.5 kg cm-2 de presión durante 20 min.
Los cultivos se incubaron con fotoperiodo de 16/8 h luz/ oscuridad proporcionado por lámparas de luz blanca fluorescente de 75 W, con irradiación fotosintética de 45 (μmol m-2 s-1, temperatura de 26 ± 2 oC y humedad relativa de 30%.
Establecimiento del cultivo aséptico
De los tres genotipos de trigo se seleccionaron semillas de tamaño uniforme y sin daño biológico o mecánico. Se lavaron con detergente en polvo durante 15 min con agua de la llave y al final un lavado con agua destilada esterilizada. Después se establecieron tratamientos de desinfección con peróxido de hidrógeno® (H2O2), plata coloidal, hipoclorito de sodio comercial (NaOCl), Tween® 20 y los fungicidas: Benlate®, Captán® y Vitavax 300® (Cuadro 1).
Cuadro 1 Tratamientos probados en la desinfección de semillas de los genotipos de trigo "Atred"(S), "Elinia 48" (R) y "Mirlo 26" (R).
Las semillas se enjugaron con agua destilada esterilizada para eliminar el exceso de desinfectantes. El proceso de desinfección de las semillas se hizo en una campana de flujo laminar horizontal (VECO®). La siembra se hizo en medio básico (Murashige y Skoog 1962) sin hormonas con 15 repeticiones por tratamiento. A las tres semanas de cultivo se evaluaron los porcentajes de contaminación y germinación.
Germinación e inducción de callos
Para inducir la germinación in vitro, las semillas de los tres genotipos de trigo se sembraron en medio básico Murashige y Skoog (1962) adicionado con ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y cinetina (Kin) (Cuadro 2). La siembra se hizo con la región del meristemo radicular sumergido 3 mm en el medio de cultivo. Después de tres semanas de cultivo se evaluó el porcentaje de germinación. Los tratamientos se integraron por 15 repeticiones y cada repetición estuvo constituida por una semilla sembrada en un frasco de cultivo.
Cuadro 2 Dosis de 2,4-D y cinetina adicionadas al medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) en la germinación de los genotipos de trigo "Atred" (S), "Elinia 48" (R) y "Mirlo 26"(R).
Regeneración de plantas vía organogénesis directa
A partir de plántulas germinadas in vitro de un mes de edad, se disecaron secciones transversales basales de tallo [thin cell layer (capas finas de células)], de 6-9 mm de diámetro y de 1-2 mm de grosor. Los explantes se sembraron en medio cultivo básico Murashige y Skoog (1962))suplementado con benciladenina (BA) y Ácido 3-Indolacético (AIA) (Cuadro 3). A los 30 días se evaluaron: brotación (%), número de brotes por explante, longitud de brotes (cm) y número de hojas.
Regeneración de plantas vía organogénesis indirecta
Se usaron explantes de callos de 60 días de edad obtenidos de la germinación de semillas de los tres genotipos. Se sembraron en medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) suplementado con BA y AIA (Cuadro 3). El tiempo de medición y las variables medidas fueron las mismas que en la organogénesis directa.
Enraizamiento in vitro
Durante la regeneración de plantas vía oiganogénesis directa e indirecta se evaluó la inducción de raíces en las concentraciones hormonales probadas (Cuadro 3). Las variables evaluadas, 30 días después de la siembra, fueron el porcentaje de enraizamiento y el número y longitud de raíces (cm).
Aclimatación de plántulas
Se seleccionaron tres lotes de plantas enraizadas de los tres genotipos de trigo de acuerdo a la altura: cinco plantas de 5 cm, cinco de 10 cm y cinco de 15 cm. Las plantas se extrajeron de los frascos y las raíces se lavaron con agua destilada estéril. Se trasplantaron en vasos de unicel de 237 mL de capacidad con mezcla de agrolita y peat-moss (proporción 1:1). Las plantas se mantuvieron en invernadero con temperatura de 24 ± 2 oC por dos semanas (Mujeeb, 2000) y cada tercer día se regaron con la solución Murashige y Skoog (1962).
Inoculación de la roya
Para evaluar de la resistencia de los tres genotipos, se usaron las raza de roya BBG/BPC donde la fórmula de avirulencia/ virulencia fue: Lrl, Lr2a, Lr2b, Lr2c, Lr3, Lr3bg, Lr3ka, Lr9, Lr13, Lr14a, Lr15, Lr16, Lr17, Lr18, Lr19, Lr21, Lr24, Lr25, Lr26, Lr28, Lr29, Lr30, Lr32, Lr35, Lr36, Lr61 /Lr10, Lr11, Lr12, Lr14b, Lr20, Lr23, Lr27, Lr31, Lr33, Lr72.
Inoculación en plantas aclimatadas
A los 16 días después de la aclimatación las plantas de los tres genotipos fueron inoculadas con una suspensión de urediniosporas de roya de la raza BBG/BPC. Se aplicó una concentración de 2-3 mg mL-1 de esporas en aceite mineral (Soltrol® 170) (Herrera-Foessel et al, 2003). La inoculación se hizo cuando las plántulas presentaron la primera hoja extendida. Con un atomizador (FELISA®, Modelo FE-1500L) se asperjaron uniformemente; se dejaron secar 20 minutos y se colocaron en una cámara (Hydrofogger®) por 16 h con humedad relativa de 100%. Después se trasladaron al invernadero con temperatura de 24 ± 2 oC. A los 10 días se trasplantaron a macetas plantas con características de interés para obtener semilla. A los 12 días de la inoculación se hicieron las evaluaciones con la escala de Roelfs et al. (1992).
Inoculación en plantas in vitro
De los tres genotipos se seleccionaron plantas in vitro de 5, 10 y 15 cm de altura y se inocularon con la roya de la hoja. Las esporas fueron suspendidas en 200 mL de agua destilada y se aplicaron en tres concentraciones (0.01, 0.03 y 0.05 mg mL-1). También se agregaron cuatro concentraciones de sacarosa (10, 15, 20 y 30 g L-1) al medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) para evaluar el crecimiento de las esporas que eventualmente cayeran al medio. Las plantas inoculadas se mantuvieron en el cuarto de incubación y a los 20 días se evaluó la presencia o ausencia de pústulas de roya de la hoja.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se condujeron en un diseño completamente al azar. Para cada variable se aplicó un análisis de varianza con el Sistema de Análisis Estadístico SAS (SAS Institute, 2003) y para la comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey (p≤ 0.05).
Resultados y discusión
Establecimiento del cultivo aséptico
La supervivencia de las semillas en los tres genotipos de trigo estuvo asociada con el tratamiento de desinfección (p≤ 0.05). El H2O2 (2% v/v) por 22.5 h, plata coloidal estable (10% v/v) + NaClO (50% v/v) + Tween 20 (4% v/v) durante 50 minutos y la mezcla de Benlate (8 g L-1) + Captán (8 g L-1) por 50 min fue el tratamiento que produjo los mejores resultados. La tasa de supervivencia promedio fue de 85% en los tres genotipos; la contaminación por bacterias fue de 5% y 10% por hongos. En el tratamiento donde se incluyó el fungicida Vitavax®300 sólo germinó 10% de las semillas. Si bien el control de hongos y bacterias fue eficiente; es probable que haya resultado tóxico para las semillas y afectó negativamente la germinación. La contaminación causada por hongos y bacterias es común en el establecimiento in vitro de semillas que están presentes de manera habitual en condiciones naturales y se debe definir un método de desinfección eficiente (Das y Pal, 2005; Rodríguez et al., 2008; Folguera et al, 2009).
Germinación e inducción de callos
Las diferencias estadísticas detectadas en los cinco tratamientos probados en los tres genotipos de trigo evaluados resultaron no significativas; sin embargo, la mayor tasa de germinación en los tres genotipos se alcanzó con 20.35 (μM de 2,4-D y 5.8 (μM de cinetina y en promedio fue de 79%. Respecto a la formación de callos a partir de las semillas, hubo diferencias en los tratamientos para cada genotipo (p≤ 0.05). La mayor formación de callos fue promovida por el 2,4-D combinado con la cinetina. Para el genotipo "Elinia 48" (R) la mayor tasa (73%) se obtuvo con 20.35 (μ M de 2,4-D y 12.5 (μM de cinetina. Para "Mirlo 26" (R) fue de 60% y se logró sólo con 20.35 μM de 2,4-D sin cinetina; mientras que en "Atred" (S) el mayor porcentaje (53%) se alcanzó con 20.35 de 2,4-D y 5.8 (μM de cinetina.
En gramíneas, la formación de callos se ha reportado a partir de diferentes explantes, como embriones maduros e inmaduros, segmentos de inflorescencias, hojas jóvenes y segmentos de tallo (Armstrong y Green, 1985). Es por ello que la respuesta observada en las semillas de los tres genotipos de trigo es producto del estímulo del 2,4-D y la cinetina (George y Debergh, 2008).
El cultivo de callos es una herramienta valiosa para la propagación de plantas de trigo y para estudios de selección in vitro en programas de mejoramiento genético (Pérez et al., 2010). El cultivo de callos ha permitido el aislamiento de células y protoplastos, la producción de metabolitos secundarios de interés biológico, la conservación de germoplasma y la introducción de nueva variabilidad genética. Por tal motivo, la regeneración de plantas de
trigo puede tener aplicaciones comerciales, tal como se ha establecido en otras gramíneas como arroz, trigo y maíz (Huang y Shaolin, 2002).
Regeneración de plantas vía organogénesis directa
Plántulas de tres semanas de germinadas de los genotipos "Atred" (S), "Mirlo 26" (R) y "Elinia 48" (R) se usaron como fuente de explantes para evaluar la inducción de organogénesis directa mediante segmentos de hojas y secciones transversales de tallos. Las variables de brotación fueron afectadas por el tipo de explante en los tres genotipos de trigo evaluados (p≤ 0.05). Las secciones transversales de tallo fueron los únicos explantes que mostraron respuesta morfogénica mientras que en las hojas no hubo respuesta. En las secciones transversales de tallo la brotación se presentó a los diez días de la siembra, y la mayor producción de brotes, y mayor longitud de los mismos, se obtuvo con 11.1 μM de BA y 1.0 μM de AIA en los tres genotipos. En "Mirlo 26" (R) y "Atred" (S) se obtuvieron ocho brotes en promedio, mientras en "Elinia 48" (R) fueron siete. La longitud promedio de los brotes fue de 7 cm (Figura 1, Cuadro 4).
Figura 1 Organogénesis de trigo "Atred", "Elinia 48" y "Mirlo 26" y respuesta de plantas aclimatadas e in vitro a la roya. (a) plantas regeneradas vía organogénesis directa genotipo "Atred"; (b) plántulas inoculadas del genotipo "Atred"; (c y d) aparición de pecas de color blanco en las hojas; (e) pústulas de roya en el genotipo "Mirlo 26"; (f) muerte de hoja en el genotipo "Atred"; y (g) pústula en ápice de hoja del genotipo "Elinia 48". p= pústula de roya.
Cuadro 4 Organogénesis en trigo "Atred" (S), "Mirlo 26" (R) y "Elinia 48" (R).
B= brotes; LB= longitud de brotes; H= hojas; * = p≤ 0.05; NS= no significativo.
La BA es ampliamente usada para la multiplicación de cereales in vitro, ya que estimula la formación y longitud de brotes, así como el número de hojas (Patiño, 2010); en cereales como arroz y cebada estimula la proliferación de brotes (Patiño et al., 2007). La respuesta de los tres genotipos de trigo a la citocinina fue diferente; con 11.1 (μM de BA el número de brotes, longitud de hojas y número de hojas aumentó considerablemente. La adición de AIA afectó el número de brotes, ya que la combinación con BA produjo una mayor respuesta en las variables de organogénesis. El efecto de citocininas y auxinas en la morfogénesis in vitro es diferente entre especies y variedades, se ha sugerido que sus niveles endógenos en la planta también influyen en las repuestas morfogénicas in vitro (Britto et al., 2003).
Regeneración de plantas vía organogénesis indirecta
En esta etapa, los callos obtenidos de semillas de los tres genotipos de trigo se establecieron en medio de cultivo MS (1962) con diferentes concentraciones de BAyAIA. Después de 60 días de cultivo se obtuvo la regeneración de plántulas con diferencias entre los genotipos (p≤ 0.05). La máxima respuesta de número y longitud de brotes se alcanzó con 11.1 (μM de BA y 1.0 (μM de AIA en los tres genotipos. Para "Elinia 48" (R) se obtuvieron 4 brotes de 3 cm de longitud; para "Atred" (S) 3 brotes de 3.5 cm y para "Mirlo 26" (R) 5 brotes de 4.5 cm. El porcentaje promedio de brotación fue de 45% en los tres genotipos (Cuadro 4). La mayor cantidad de brotes y plántulas regeneradas con la organogénesis directa resultó la mejor ruta morfogénica en los tres genotipos.
Enraizamiento in vitro
El enraizamiento in vitro se logró en los mismos tratamientos usados para inducir la regeneración de plántulas vía organogénesis directa e indirecta en los tres genotipos. Sin embargo, el número y longitud de raíces para cada tratamiento utilizado así como para cada genotipo fue diferente (p≤ 0.05). Los mayores valores de número y longitud de raíces se obtuvieron en el tratamiento compuesto por 11.1 μM de BA y 1.0 μM de AIA en los tres genotipos; el enraizamiento fue de 60%.
Aclimatación de plántulas
La tasa de supervivencia en la aclimatación de plantas de los tres genotipos de trigo fue 90% en condiciones de invernadero. Aunque no hubo diferencias significativas entre la altura de planta y el porcentaje de supervivencia (p≤ 0.05), el alto porcentaje de plantas aclimatadas indica que el procedimiento de aclimatación empleado (Mujeeb, 2000) resultó óptimo. La mezcla de peat moss + agrolita, en proporción 1:1 fue eficiente; su alto contenido de materia orgánica favorece la adaptación de las plantas; además, brinda buena retención de agua y excelente aireación, propiedades que beneficiaron la supervivencia a los 10 días del trasplante (Pospisilova et al, 1999).
Inoculación de la roya en plántulas in vitro
Las diferencias detectadas fueron significativas en la dosis de inoculación de roya sobre las plántulas, pero no en las concentraciones de sacarosa adicionadas al medio de cultivo sobre el crecimiento de las esporas (p≤ 0.05). En genotipos de trigo susceptibles las esporas inician la germinación a los 30 min después del contacto con la hoja y una gota de rocío. El periodo entre la germinación de las esporas, penetración, establecimiento de la colonia y momento de esporulación en el campo puede abarcar de 8 a 10 días bajo temperaturas constantes de 20 a 24 oC (Singh y Dubin 1997). Por ello, en este estudio se hicieron evaluaciones en tiempos diferentes para observar el comportamiento del patógeno en los tres genotipos de trigo in vitro.
En las plántulas in vitro de los tres genotipos de trigo cultivadas con 30 g L-1 de sacarosa, se observó la presencia de pústulas en las hojas cuando se inocularon con 0.03 mg L-1 de esporas de roya. Los primeros síntomas de la roya de la hoja son la aparición de pequeñas pecas o diminutas manchas de color blanco entre los 7-10 días (McIntosh et al., 1995; Singh et al, 2004) después de la infección. En los genotipos inoculados in vitro, los signos aparecieron 20 días después de su inoculación, por lo tanto la enfermedad tuvo un desarrollo más lento comparado con las plantas de campo o invernadero (Figura 1). El máximo porcentaje de pústulas en los tres genotipos, en la dosis de 0.01 mg mL-1, de esporas fue de 10%, mientras con la dosis de 0.03 mg mL-1 fue de 70% para "Atred", 40% para "Mirlo 26" y 30% en "Elinia 48". En la dosis de 0.05 mg mL-1 el porcentaje de pústulas fue de 25% en los tres genotipos.
La formación de pústulas en condiciones de invernadero es favorecida por temperaturas de 20 a 24 °C; se retrasa si es inferior a 16 °C. Estos aspectos coinciden con la respuesta obtenida en la inoculación in vitro donde la temperatura de 26 ± 2 °C fue constante las 24 h del día; humedad relativa de 30% y fotoperiodo de 16/8 h luz/oscuridad. Estas condiciones facilitaron la aparición de la roya (Figura 1).
En la literatura no existen reportes de procedimientos de inoculación de la roya de la hoja del trigo bajo condiciones in vitro. La metodología aquí desarrollada es el primer estudio que se hace al respecto, la cual puede ser útil en la caracterización de los genotipos evaluados para que puedan ser seleccionados y utilizados en programas de mejoramiento genético y la consecuente obtención de variedades resistentes a este patógeno. Por tal motivo, la evaluación de roya de la hoja bajo condiciones in vitro genera alternativas importantes para el mejoramiento genético siendo Puccinia triticina E. el agente selectivo, lo que hace factible hacer la selección in vitro sin necesidad de la regeneración de plantas en invernadero o campo.
Bajo la premisa que el comportamiento de las plantas de trigo in vitro al patógeno es similar al de las plantas madre de donde se extrajeron los explantes, se facilitaría considerablemente el proceso de selección en resistencia a la roya de la hoja. Dicha selección in vitro se llevó a cabo mediante diferentes concentraciones del agente selectivo Puccinia triticina E. Esto coincide con Cubero (2003) quien menciona que este método puede ser simple y eficiente, ya que las células sensibles al agente mueren, permitiendo el crecimiento de los genotipos tolerantes y tal vez con un mayor nivel de diferenciación, hubiese sido posible regenerar plantas tolerantes.
A los cinco días de la aparición de las pústulas las plantas comenzaron a mostrar síntomas que iniciaron con la necrosis de las hojas. Esta respuesta se debió a que Puccinia triticina estresó las plantas in vitro, suponiendo que aquellas que sobrevivieron y no presentaron pústulas son resistentes, respuesta que coincide con lo obtenido en los materiales evaluados in vivo. La información obtenida podría aplicarse al mejoramiento genético de genotipos con tolerancia a esta enfermedad.
Algunas de las ventajas de la inoculación de roya in vitro, comparada con la efectuada en campo, son que se pueden aplicar en cualquier época del año, permite mantener un control de las condiciones ambientales de experimentación, se requiere de espacio relativamente pequeño, es factible evaluar muchos genotipos a la vez y se pueden llevar a cabo múltiples evaluaciones de forma paralela (Gunn y Day, 1986).
Inoculación de la roya en plantas aclimatadas
Plantas aclimatadas de los tres genotipos de trigo "Atred" (S), "Mirlo 26" (R) y "Elinia 48" (R) se mantuvieron en invernadero a 26 ± 2 oC e inoculadas con la roya de la hoja. Después de cuatro días de la inoculación los síntomas de la enfermedad comenzaron a ser visibles; iniciaron con pequeñas manchas cloróticas en las hojas inoculadas, generando una respuesta ostensible de resistencia (Huerta y Singh, 2000). A los siete días de la inoculación, tuvo lugar la germinación y esporulación del hongo; mostrando las mismas características de reproducción del patógeno que con el material evaluado in vivo.
A los 12 días después de la inoculación se observó una variación inesperada en la respuesta comparada con las plántulas in vivo y con las regeneradas vía organogénesis indirecta. En los genotipos considerados resistentes, "Elinia 48" y "Mirlo 26", se observó que 10% de las plantas perdió la resistencia mostrando características de susceptibilidad. En el genotipo "Atred", susceptible, 21% de las plantas mostraron algún grado de resistencia a la roya de la hoja; este genotipo se usa como un progenitor de primavera en los cruzamientos de nuevas líneas de resistencia a Puccinia triticina en el mejoramiento convencional.
El porcentaje de genotipos cristalinos resistentes a roya de la hoja en un grupo de hábito invernal solo representan alrededor de 4% (Cubero, 2003). La respuesta obtenida en el genotipo "Atred" (S) es una opción para generar resistencia e incrementar líneas con características importantes para la roya de la hoja en trigos harineros de invierno. Esta respuesta constituye un nuevo aporte para los fitomejoradores ya que puede ser una variante cuyas características esenciales conviene conservar.
La resistencia observada en "Mirlo 26" fue conferida por un gen recesivo en respuesta a la raza BBG/BPC; mientras que la resistencia en "Elinia 48" (R) fue por un gen dominante y otro recesivo, en materiales obtenidos bajo condiciones de invernadero. Se requieren más estudios que corroboren la presencia o ausencia de estos genes, característicos de las líneas evaluadas in vivo en materiales obtenidos en condiciones in vitro. Las plantas obtenidas in vitro pueden presentar diferencias fenotípicas, morfológicas o bioquímicas en comparación con las plantas madre. Larkin y Scowcroft (1981) distinguieron a la variación epigenética transitoria y las variaciones genéticas "verdaderas", como las causas probables; ambas conocidas como variaciones somaclonales.
Es probable que los resultados obtenidos en los tres genotipos sean atribuidos a variaciones epigenéticas. Sin embargo, se necesitan mayores estudios moleculares que confirmen o descarten las respuestas. Las variaciones somaclonales en algunas ocasiones pueden ser una limitante, pero en otras, como lo obtenido en este estudio, pueden ser benéficas. Es una herramienta eficiente cuando se obtienen plantas que muestran ventajas adaptativas y puede aplicarse en el mejoramiento genético (Bairu et al., 2011).
La respuesta de susceptibilidad y resistencia en los genotipos "Atred" (S), "Elinia 48"(R) y "Mirlo 26" (R) sería inestable y se revertiría con alta frecuencia si fuera un cambio epigenético (Sánchez y Jiménez, 2009), por lo que es necesaria la evaluación de la progenie de estos materiales mediante la inoculación del patógeno in vivo de Puccinia triticina E. Por el contrario, si la progenie muestra respuestas similares sería una respuesta somaclonal heredable; variabilidad genética útil para el mejoramiento de plantas con características agronómicas superiores.
Los resultados obtenidos en la presente investigación constituyen el primer reporte donde se aplican las técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro para evaluar la susceptibilidad y resistencia de genotipos de trigo a la roya de la hoja. Puede constituir una valiosa herramienta factible de incorporarse en programas de mejoramiento genético de trigo y otros cereales.
Conclusiones
A partir de segmentos basales de tallo se regeneraron plantas vía organogénesis directa e indirecta en los genotipos de trigo "Atred" (S), "Mirlo 26"(R) y "Elinia 48"(R) cultivados en medio de cultivo MS (1962) suplementado con BA (11.1 μM) y AIA (1.0 μM). La mejor ruta morfogénica para la propagación fue la organogénesis directa con 45% de brotación en los tres genotipos. La aclimatación de plántulas fue viable en invernadero con 90% de supervivencia en sustrato de peat-moss y agrolita (1:1) en los tres genotipos. La evaluación de roya de la hoja mediante plantas aclimatadas tuvo porcentajes de infección de 21% en el genotipo "Atred" (S), 10% en "Mirlo 26" (R) y 10% en "Elinia 48" (R). En plántulas in vitro los porcentajes fueron de 70% para "Atred", 40% para "Mirlo 26" y 30% para "Elinia 48" con la dosis de 0.03 mg mL-1 .de esporas. Estas respuestas fueron diferentes a las evaluaciones efectuadas en campo, lo que indica una posible variación somaclonal o epigenética que debe ser corroborada en la progenie de cada genotipo mediante inoculación del patógeno y con pruebas genéticas.
