Introducción

El uso de los plaguicidas de origen sintético han originado problemas por su uso irracional, tales como: la resistencia de las plagas a los plaguicidas, la presencia de residuos en las cadenas alimenticias y el ambiente físico (aire, agua, suelo), la destrucción de la fauna benéfica que es responsable de control natural de las plagas potenciales, el resurgimiento de las plagas después del tratamiento por los plaguicidas. Por tanto, el uso no inteligente de los plaguicidas, ha provocado la reducción de la interrelación trófica entre los organismos, la pérdida de biodiversidad, el desequilibrio ecológico y el decremento de la estabilidad ambiental (^{López et al. 2006}).

La necesidad de reducir el uso de químicos sintéticos en la agricultura ha incrementado el interés por la posible aplicación de extractos vegetales y sus aceites esenciales para el control de fitopatógenos. Los extractos vegetales y aceites esenciales de cada planta pueden tener hasta más de sesenta componentes y de ellos puede haber varios con propiedades antifúngicas; generalmente están presentes como mezclas de compuestos y los patógenos pueden ser afectados diferencialmente por los compuestos individuales o por las mezclas en determinadas concentraciones y proporciones (Montes, 2009).

Diversos autores alrededor del mundo han reportado la actividad antifúngica de los extractos vegetales, aceites esenciales y sus compuestos realizado pruebas in vitro, en invernadero y en campo; utilizando diversos métodos de extracción de los metabolitos y mostrando variación de respuestas dependiendo de la especie, la parte utilizada, la concentración, la cepas de fitopatógenos y de la técnica de evaluación utilizada (^{Wilson, et al.,1997}; ^{Gogoi et al., 1997}; ^{Pitarokili et al., 1999}; Montes et al., 2000; ^{Meepagala et al., 2002}; ^{Hernández et al. 2007}; ^{Ramírez, 2013}).

Sin embargo los métodos tradicionales de extracción para la obtención de extractos tienen una limitada aplicabilidad, debido a que requieren altos tiempos de proceso, solventes de características toxicas, emplean altas temperaturas que afecta la calidad del extracto final y económicamente son poco competitivos con otras alternativas de control (^{Ramírez, 2006}).

Como alternativa se han desarrollado nuevas técnicas de extracción amigables con el medio, el producto y el ambiente, bajo nivel de riesgo para la salud humana y una calidad superior en los productos bioactivos. Entre estas alternativas se encuentran: el empleo de fluidos supercríticos que extrae de manera selectiva cierta familias de compuestos con altos rendimientos y temperaturas inferiores a 50 °C (^{Martínez et al., 2011}); la extracción asistida por microondas (EAM) la cual requiere menor tiempo, menos uso de solventes con mayor tasa de extracción, ahorrando energía y obteniendo mejores productos con un menor costo y la asistida por ultrasonido (EAU) que reduce significativamente los tiempos de proceso gracias a la acción de ultrasonidos mayores a 16 KHz en el interior del extractor (^{Hayat et al., 2009}).

Cultivos como el tomate y la papaya son de gran importancia económica para muchos países, y de manera concreta para el estado de Chiapas se consideran como una alternativa para muchos productores, según datos de Servicio de información agroalimentaria y pesquera para 2014 el estado ocupo el cuarto lugar nacional en área de cultivo de papaya con un rendimiento de 80 t ha^-1, mientras que para el tomate rojo ocupo el doceavo y con un rendimiento de 35.72 t ha^-1 considerado bajo en comparación con otros estados productores. Un factor común en la producción de estos dos cultivos es el alto consumo de pesticidas que les permitan controlar los problemas fitosanitarios, los cuales dejan residuos en las frutas, elevan los costos de producción y contribuyen a la contaminación del medio ambiente. Por lo que los sistemas producto tomate y papaya han plasmado en sus planes rectores la necesidad de implementar alternativas de manejo para las principales enfermedades que son factor limitante para su producción (^{SAGARPA, 2012}).

Es así como enfermedades en tomate tales como alternaría (Alternaria solani) y fusarium (Fusarium oxysporum) y antracnosis (Colletotrichum gloesporioides) en papaya son tratadas fundamentalmente con el uso de plaguicidas de síntesis química, además algunos productores por mantener una mayor vida de anaquel de sus productos sin presencia de patógenos aplican productos unos pocos días antes de llevarlos a la venta, por lo que los plaguicidas no logran degradarse, reduciendo con ello la calidad biológica de los productos a comercializar.

En este trabajo se estudió la efectividad in vitro de extractos vegetales de Pimienta dioica, Cinnamomum zeylanicum Nees, Syzygium aromaticum L., obtenidos mediante destilación y microondas, sobre Colletotrichum gloesporioides aislado de Carica papaya, así como para los patógenos Alternaria solani y Fusarium oxysporum aislados de Lycopersicum esculentum con el propósito de generar alternativas viables para el manejo de éstos patógenos.

Metodología

En el Laboratorio de Agrotecnologías de la Universidad Autónoma de Chiapas fueron aislados y caracterizados los hongos Alternaria solani y Fusarium oxysporum de tomate y Colletotrichum gloesporioides de papaya procedentes de plantas infectadas de la región Frailesca, del estado de Chiapas, México; los cuales fueron incubados en medio PDA a 23° +/- 2 °C. Las plantas de las cuales se obtuvieron los extractos para determinar su efectividad en el control de hongos fueron frutos secos de Pimienta dioica, corteza seca de Cinnamomum zeylanicum Nees y botones florales secos de Syzygium aromaticum L., con los cuales se elaboraron los extractos empleando dos métodos de extracción:

Hidrolato por destilación: se empleó un destilador adaptado para obtención de extractos. El material vegetal seco (250 g L^-1) se colocó dentro de la marmita del destilador junto con el agua, se tapó herméticamente para hacer el proceso de extracción continuo mediante la aplicación de calor y presión constante, el vapor fue conducido a un condensador y, mediante enfriamiento con agua corriente se obtuvo el hidrodestilado.

Extracción por hidrodestilación asistida por microondas: se utilizó la radiofrecuencia de un microondas adaptado para la extracción de los metabolitos, bajo las siguientes condiciones: 220 Kw de potencia, un periodo de 1 800 s y 2.450 MHz. Para realizar la extracción se colocó en la salida del equipo un condensador de reflujo con agua fría. La muestra se colocó en una gasa retenida por una malla de algodón, se generó el vapor en la parte inferior del matraz, para tal efecto se pusieron 300 ml de agua purificada y el vapor generado atravesó las muestras arrastrándose el aceite esencial con el vapor. La ebullición del agua comenzó transcurridos 590 s alcanzando una temperatura de 89 °C. Se obtuvo una temperatura final de 91 °C. Se trabajó con una muestra de 250 g. Finalmente se separó el aceite esencial del hidrodestilado, para tal efecto se utilizó un embudo de separación.

Ensayo 1. Screening para determinar efectividad de los extractos: se utilizó la técnica de medio envenenado con el extracto. Inicialmente se realizó un ensayo exploratorio en la que cada extracto se añadió de manera individual al medio de cultivo papa-dextrosa-agra (PDA), a una concentración del 30% (volumen/volumen) para los hidrodestilados, para el caso de aceites fue 0.1%; una vez preparado el medio con el extracto se procedió a servirlo en cajas petri estériles y se realizó la inoculación del respectivo hongo. Los cultivos fueron mantenidos en sala de cultivo bajo condiciones controladas de 23 ^oC +/- 2 ^oC y se incluyó un testigo absoluto en el cual el hongo fue cultivado en el medio original (PDA) sin ningún control. Se estudiaron un total de 10 tratamientos por patógeno y un total de 30 para éste ensayo.

El efecto inhibitorio se cuantificó mediante el crecimiento cada 24 h del diámetro del micelio del patógeno durante 12 días. También se cuantificó la producción de esporas, mediante la cámara de neubauer. La unidad experimental estuvo constituida por una caja de petri y los tratamientos fueron distribuidos en un diseño completamente al azar con cinco repeticiones. Para determinar los efectos de los tratamientos estudiados, a los datos obtenidos se les practicó un análisis de varianza y la prueba de comparación de Tukey al 0.05%.

Ensayo 2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

Los extractos que presentaron inhibición total del crecimiento y desarrollo del patógeno, se les determinó la CMI; evaluando concentraciones de 20, 10 y 5% (V/V) y para el caso del aceite se evaluaron 0.05 y 0.01% (V/V). Igualmente se empleó la técnica de difusión en agar y se evaluó crecimiento y formación de conidias con el mismo procedimiento descrito para el anterior ensayo.

Resultados

Ensayo 1. Los resultados para las dos variables evaluadas para cada hongo se presentan en el Cuadro 1. Para el caso de Alternaria solani se aprecia como el clavo en hidrolato (obtenido por destilación y microondas) y el aceite, no permitieron el crecimiento y desarrollo de patógeno, mientas que para el caso de la canela este efecto inhibitorio lo presentó el hidrolato obtenido por microondas y el aceite, tratamientos que registraron diferencias estadísticas con respecto al testigo absoluto. El análisis de varianza practicado para los tres patógenos registró diferencias entre los tratamientos.

Para el caso de pimienta, tanto los hidrolatos como el aceite permitieron el crecimiento y formación de conidias del patógeno; sin embargo, se aprecia que los tratamientos que permitieron crecimiento micelial inhibieron entre 58.61% a 28.31% la formación de conidias con respecto al testigo absoluto, mostrando diferencias estadísticas con éste.

Estos resultados muestran mayores porcentajes de inhibición en crecimiento y formación de conidias a lo reportado por otros autores; tal es el caso de ^{Pupo et al. (2011)} quienes evaluaron 11 plantas naturalizadas cubanas sobre Alternaria solani y encontraron que los extractos de flores de T. erecta y de hojas de L. peltata estimularon el crecimiento de A. solani. Mientras que con los extractos de flores de L. camara y planta completa de C. viscosa, con 2 mg mL^-1 inhibieron más de 50% de la germinación de los conidios y con 3 mg mL^-1 superaron 80%. El extracto de flores de L. dulcis, a esta misma dosis, alcanzó 93.5% de inhibición que estadísticamente resultó similar a la actividad mostrada por el Zineb (91.2%). ^{Santander y Aquino (2009)}, reportan el efecto regulador del extracto acuoso de Allium sativum a concentraciones superiores al 50%, sin embargo reportan efecto fungistático ya que presentó crecimiento pasados 7 días de incubación.

Para el caso de F. oxysporum, el hidrolato de clavo (obtenido tanto por destilación como por microondas) ejerció un efecto inhibitorio total, así como el hidrolato de canela obtenido por microondas, sin embargo en los aceites de canela y clavo y el hidrolato de pimienta obtenidos por microondas, a pesar que registraron crecimiento, no se presentó formación de conidias, y presentaron diferencias estadísticas con respecto al testigo, el cual registró los mayores valores de crecimiento y formación de conidias. Estos resultados que confirman lo reportado por López-Benítez et al. (2005), quienes demostraron que extractos acuosos de canela y clavo inhibieron el crecimiento de F. oxysporum, sin embargo evidenciaron como el extracto de clavo presentó menor actividad sobre éste patógeno que sobre Rhizoctonia solani y Verticullium danliae a las 144 h de incubación.

Investigaciones realizadas por ^{Barrera y García (2008)}, indican que los aceites de canela y clavo no inhibieron completamente el crecimiento de Fusarium sp. aislado de papaya, siendo el aceite de clavo el que presentó la mayor inhibición (84 al 29%), mientras que la canela registró una inhibición 68 a 30% utilizando 100 µg mL^-1 -300 µg mL^-1, resultados que coinciden con la presente investigación ya que ninguno de los dos aceites inhibió el crecimiento de F. oxysporum; sin embargo, el mayor porcentaje de inhibición se registró para el aceite de canela con 78%, mientras que el aceite de clavo fue de 69%, diferencia que puede ser debida a la procedencia del material o del proceso de extracción.

Los resultados del efecto de los tratamientos sobre C. gloesporioides, se aprecia que tan solo en el aceite de pimienta permitió el crecimiento y formación de conidias superando incluso al testigo absoluto, mientas que el hidrolato de canela obtenido por destilación, solo presentó crecimiento del patógeno, registrando diferencia con los demás tratamientos, los cuales inhibieron tanto crecimiento como formación de conidias, apreciándose que el proceso de extracción utilizando microondas permite extraer mayor cantidad de metabolitos activos, ya que a la misma concentración inhibió completamente el crecimiento y formación de conidias.

Los resultados obtenidos con los aceites de clavo y canela no coinciden con los reportados por ^{Martínez et al. (2012)}, quienes evaluaron diferentes concentraciones de estos aceites integrándolos en películas comestibles para recubrir papayas encontrando que a concentraciones del 0.08 a 0.06% reducían la infección de patógenos siendo más efectivo el aceite del clavo con una inhibición 88.9%, mientras el de canela fue 78%.

Sin embargo, ^{Guillen- Sánchez et al. 2014}, utilizando igualmente películas de quitosano, cera de abeja/ácido oleico mezclados con aceites de tomillo, canela y clavo reportan efecto regulador de los tres aceites pero a concentraciones superiores de 0.5 y 1%, siendo el hongo más sensible C. gloesporioides al efecto de los aceites en la inhibición de su crecimiento micelial, mientras que Penicillium digitatum, Rhizopus stolonifer, Fusarium oxysporum y Alternaria alternata solo presentaron inhibición a la mayor contracción.

Ensayo 2. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

Se determinó la CMI para cada uno de los extractos que inhibieron completamente el crecimiento y desarrollo del patógeno en el ensayo anterior. Para el caso de A. solani los resultados se presentan en el Cuadro 2, el análisis de varianza practicado registró diferencias entre los tratamientos; para el caso de los hidrolatos de clavo obtenidos tanto por destilación como por microondas a concentración de 20% registraron crecimiento pero no permitieron formación de conidias, efecto que también presentó el hidrolato de clavo obtenido por microondas a concentración de 10%, mientras que el de destilación a esa misma concentración presentó mayor crecimiento y formación de conidias, así como todos los hidrolatos a concentración de 5%, aunque todos presentaron inhibición en la formación de conidias con respecto al testigo con quien el análisis estadístico detecto diferencias pero no registraron diferencias estadísticas entre ellos para ésta variable, efecto similar a lo reportado por ^{Ramírez, 2013}, quien reportó que hidrolatos de canela y clavo obtenidos por destilación a concentraciones del 10 y 20% (v/v), a pesar que permitieron crecimiento de Moniliophthora roreri, inhibieron la formación de conidias.

Con respecto a los aceites el de canela, inhibió totalmente el crecimiento y formación de conidias a concentración de 0.05%, mientras que al 0.01% redujo en 50.23% la cantidad de conidias y 16.5% el crecimiento micelial y registró diferencias estadísticas con el testigo absoluto; mientras que el aceite de clavo presentó inhibición de crecimiento y formación de conidias a concentración 0.05%, y a 0.01% inhibió al 100% la formación de conidias y 27% el crecimiento micelial.

Estos resultados indican un mayor efecto de los extractos obtenidos de canela ya sea por destilación o asistido por microonda sobre A. solani, toda vez que sus CMI fueron inferiores que las presentadas por los extractos obtenidos de clavo y de pimienta; y se evidencia que el hidrodestilado obtenido con microondas resulta ser más efectivo, ya que tanto para los extraidos a partir de clavo como de canela a la misma concentración resulto con mayor actividad reguladora que los obtenidos por destilación. El hidrodestilado de canela obtenido por microondas a 10%, y los aceites de canela y clavo a 0.05%, fueron los tratamientos que presentaron el mejor efecto regulador para éste patógeno del tomate, incluso con mejores resultados que lo reportado por otros autores como ^{Cortina (2014)}, quien evaluó aceites de canela y clavo sobre Alternaria alternata aislado de arroz, ya que a 300 µg/ mL, no registró inhibición total de crecimiento, y de ^{Ramírez (2013)} que registró CMI para M. roreri de hidrodestilado de canela en 30% (v/v) y para clavo de 20% (v/v).

Para el caso de C. gloesporioides se evaluó inicialmente concentraciones del 20 y 10% de los hidrolatos de pimienta, clavo y canela y de 0.05% para los aceites de clavo y canela, el análisis de varianza indicó diferencias estadísticas. Los resultados se presentan en el Cuadro 3, mostrando inhibición total de crecimiento y esporulación para los hidrolatos de clavo tanto los obtenidos por destilación como microondas, y los hidrolatos obtenidos por microonda de canela a 20 y 10% y pimienta a 20%, así como los aceites de clavo y canela al 0.05%, los cuales registraron diferencia con el testigo absoluto.

Por lo que fue necesario para el caso de éste patógeno, realizar un segundo ensayo y poder determinar la CMI, donde se evaluaron a concentraciones inferiores, a 5% para el caso de los hidrodestilados de canela, clavo y pimienta obtenidos por microondas y de canela y clavo por destilación y 0.01% para los aceites, (Cuadro 4), todos los tratamientos inhibieron en diferentes porcentajes el crecimiento y formación de conidias, registrando diferencias estadísticas con el testigo absoluto, siendo los aceites de canela y clavo y el hidrodestilado de clavo obtenido por microondas los que inhibieron en mayor grado (79- 55%), por lo que su CMI sería de 10% y 0.05% para el caso de los hidrolatos y aceites respectivamente.

Los anteriores resultados permiten apreciar el efecto regulador de los hidrolatos y aceites de canela, clavo y pimienta para los tres hongos evaluados tanto en crecimiento de los patógenos, como en la formación de conidias en diferentes porcentajes de inhibición, sin embargo los resultados indican diferencias en actividad de estos extractos y aceites sobre los tres hongos, siendo C. gloesporioides el patógeno que fue más sensible a los hidrodestilados de las tres plantas y a los aceites de canela y clavo, mientras que para F. oxysporum los hidrodestilado de pimienta en las dos formas de obtención y el de canela por destilación, a concentración de 30% no inhibieron complemente al patógeno así como los aceites de canela, clavo y pimienta a la concentración evaluada, los cuales si bien presentaron porcentajes de inhibición en crecimiento de 73.2 a 6.5% y en la formación de conidias de 100 a 22.4%, no lo inhibieron completamente.

La alta capacidad antifúngica encontrada en los aceites esenciales de C. zeylanicum y S. aromaticum coincide con los resultados reportados por ^{Montes y Carvajal (1998)} quienes observaron que Aspergillus flavus fue totalmente inhibido por los aceites esenciales de estas plantas. ^{Wilson et al. (1997)} evaluaron 49 aceites esenciales y encontraron que C. zeylanicum mostró la mayor actividad antifúngica contra Botrytis cinerea. Bravo et al. (1998) observaron que los aceites esenciales de M. piperita, E. globulus, T. ambrosioides, C. zeylanicum, S. aromaticum y T. vulgaris a dosis de 10 000 y 7 500 ppm inhibieron el crecimiento micelial de Fusarium moniliforme. Estos mismos autores también reportan el efecto inhibitorio sobre la esporulación del mismo hongo a dosis de 150 a 300 ppm de los aceites de C. zeylanicum, S. aromaticum y T. vulgaris.

La actividad fungicida de aceites de C. zeylanicum, S. aromaticum contra patógenos que causan antracnosis en plátano ha sido reportada por ^{Ranasinghe et al. (2002)}. Las propiedades fungitóxicas de aceites esenciales de seis poblaciones de Thymus zygis contra Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum y Colletotrichum acutatum fueron reportadas por ^{Pérez et al. (2007)}. Estos autores también publican la composición química de los aceites esenciales y la correlación entre la concentración de los compuestos y la actividad antifúngica reportados por ^{Barrera y García (2008)}.

Los resultados de esta investigación indican que tanto el método tradicional de hidrodestilación y el asistido por microondas utilizando clavo, canela y pimienta permiten extraer metabolitos capaces de inhibir en diferentes porcentajes tanto el crecimiento como la formación de conidias, sin embargo se aprecia que el asistido por microondas permite obtener una mayor concentración de ellos, lo que logro reducir la CMI en la que afectan a los patógenos en comparación al método de destilación tradicional. Corroborando el reporte de Zharia (2011) citado por ^{Aguilar y López (2013)}, quienes usaron hidrodestilación de clavo acoplado a microondas y fue comparada con la hidrodestilación tradicional donde no hubo grandes diferencias en cuanto a componentes obtenidos de los aceites esenciales recuperados por ambos métodos; sin embargo el tiempo de extracción y el tamaño de muestra fueron menores para el microondas. Los resultados de esta investigación dan alternativas mediante el uso de hidrodestilados y aceites vegetales, los cuales deberán ser ajustados a planes de manejo para cada cultivo y establecer su efectividad en campo.

Conclusiones

Los hidrodestilados y aceites de C. zeylanicum, Z. aromaticum y P. dioica obtenidos por destilación tradicional y asistido por microondas, poseen metabolitos capaces de reducir el crecimiento y formación de conidias de A. solani, F. oxysporum y C. gloesporioides, los cuales pueden ser una alternativa para el manejo de éstos patógenos del tomate y la papaya.

Los hidrodestilados de C. zeylanicum, Z. aromaticum y P. dioica obtenidos con ayuda de microondas parecen tener una mayor cantidad de compuestos activos que los obtenidos con destilación ya que las CMI fueron menores o la actividad inhibitoria sobre los hongos a la misma concentración fue superior.

Los patógenos C. gloesporioides y A. solani parecen ser más sensibles al efecto de los hidrodestilados y aceite de C. zeylanicum, Z. aromaticum y P. dioica, que F. oxysporum.

El hidrolato de clavo obtenido por destilación inhibió totalmente el desarrollo de A. solani y F. oxysporum a concentración del 30% (v/v) y al 10% a C. gloesporioides, mientras que los asistidos por microondas de canela inhibieron a A. solani y C. gloesporioides a concentración de 10% (v/v), y 30% a F. oxysporum; y el de clavo a 30% inhibe a F. oxysporum y A. solani y al 10% C. gloesporioides y los aceites de canela y clavo al 0.05% inhibieron a A. solani y C. gloesporioides.