Introducción

Dentro de las plantas dioicas con importancia comercial encontramos a las del género Dasylirion, el cual recientemente ha sido ubicado dentro de la familia Asparagaceae (^{APG III, 2009}) y cuya distribución comprende la región del desierto Chihuahuense y la Región Árida del Norte de América (^{Martorell y Ezcurra, 2002}). La importancia de las plantas de este género radica en que algunas de sus especies como lo son: D. duranguense, D. wheeleri y D. cedrosanum son empleadas para la elaboración de una bebida alcohólica conocida con el nombre de “sotol” (^{NOM-159-SCFI-2004}; ^{De La Garza et al., 2008};). La elaboración artesanal de esta bebida y la escasa información sobre la biología, bioquímica y características de reproducción de este género han contribuido a un mal manejo de las poblaciones naturales, por lo cual, es de gran importancia aportar información básica para mejorar el manipulación de la especie.

En el caso del género Dasylirion no existen reportes sobre las características bioquímicas o fisiológicas de las plantas, es decir, se carece de información básica que en cierto momento pudiera adquirir importancia práctica para la implementación y el manejo de viveros que contribuyan a la conservación de las especies de este género. La evaluación de la composición hormonal es fundamental debido a las funciones que cumplen en la planta, como la formación, desarrollo y especificación de órganos, aportación de resistencia frente a cambios climatológicos o infecciones patológicas, entre otras (^{Santner et al., 2009}).

Dentro de las fitohormonas más estudiadas se encuentran las giberelinas y citocininas. Las giberelinas es un grupo amplio de moléculas que pertenecen a la familia de los diterpenoides tetracíclicos, dentro de las giberelinas con mayor actividad biológica se encuentran la GA1, GA3, GA4 y GA7, las cuales juegan un papel en diversos procesos del crecimiento de las plantas que incluyen, desarrollo de la semilla, elongación de los órganos, y control del tiempo de la floración (^{Yamaguchi, 2008}; ^{Santner et al., 2009}). Por otro lado, las citocininas son fitohormonas móviles que desempeñan un papel crítico en el crecimiento y desarrollo de las plantas mediante la regulación de la senescencia de la hoja (^{Kim et al., 2006}), la dominancia apical (^{Tanaka et al., 2006}), la proliferación de la raíz (^{Werner et al., 2001}), filotaxis (^{Giulini et al., 2004}), la competencia reproductiva (^{Ashikari et al., 2005}) y la señalización nutricional (^{Takei et al., 2002}). Dentro de las citocininas bioactivas se encuentran la trans zeatina (Z) y la trans zeatina ribósido (tZR) (^{Neuberg et al., 2011}).

La determinación del contenido de giberelina A4 (GA4) y trans zeatina ribósido (tZR) en diferentes órganos de plantas pistiladas y estaminadas de D. cedrosanum puede contribuir al conocimiento de la composición bioquímica y fisiología hormonal de la especie, considerando la gran importancia que tienen las giberelinas y citocininas en la diferenciación, desarrollo y formación de las estructuras vegetales.

La evaluación de los niveles de giberelina A4 (GA4) y trans zeatina ribósido (tZR) se realizó en los meses de abril y mayo del 2013 en hojas, corona e inflorescencia de plantas adultas con flores pistiladas y estaminadas de D. cedrosanum, las cuales fueron colectadas en la región de General Cepeda, Coahuila, México en las coordenadas 25° 18’ 43.5” latitud norte, 101° 45’ 26.5” longitud oeste, a una altura de 1986 ± 15.63 msnm. La región cuenta una precipitación promedio anual 300 a 400 mm, una temperatura media anual de 18 a 20 °C y un clima semiárido (BSh) según la clasificación de Köppen. El muestreo de las hojas, corona e inflorescencia se realizó bajo un esquema de muestreo sistemático en donde las plantas seleccionadas cumplieron con la característica de poseer una inflorescencia que iniciaba la emergencia. El muestreo de estos órganos se realizó en cuatro plantas pistiladas y cuatro plantas estaminadas, mismas que fueron muestreadas repetidamente una vez por semana desde el inicio de la aparición de la inflorescencia hasta que éste se secó completamente, transcurridas cinco semanas después de la emergencia de la inflorescencia.

Para minimizar el daño en la planta, las muestras de tejido fueron obtenidas con ayuda de un sacabocados que colectaba de 2 a 5 gramos de tejido fresco de la corona e inflorescencia, teniendo cuidado de que la muestra no sobrepasara más de una tercera parte del diámetro de la inflorescencia. En el caso de las hojas, con ayuda de una navaja fueron cortadas desde la base dos de las hojas más jóvenes con desarrollo completo que estuvieran cercanas al sitio de la emergencia de la inflorescencia, las cuales fueron cortadas en trozos de 2 cm para posteriormente ser almacenadas. Cada muestra obtenida fue colocada en su respectivo recipiente de plástico previamente etiquetado e inmediatamente fue sumergida en nitrógeno líquido, donde permaneció hasta ser almacenada en un ultracongelador (SANYO modelo MDF-U53VA) a -80 °C.

Posteriormente a cada una de las muestras se les eliminó por completo el agua mediante un liofilizador (LABCONCO Modelo 2.5 L) con un vacío de 0.25 mBar y una temperatura de -40 °C. Finalmente, las muestras fueron pulverizadas en un mortero y almacenadas a temperatura ambiente en recipientes que contenían silica gel y con sellado hermético.

Para la extracción de GA4 y tZR se pesaron 50 mg de cada muestra dentro de un tubo para microcentrífuga y se añadió 1 mL de la solución de extracción (metanol al 20% (v/v) diluido en ácido fórmico al 0.1% (v/v)). La mezcla se sometió al vortex (GENIE 1 Tocuh Mixer Modelo SI-0136) por 30 segundos y a sonicación (BRANSON Modelo 1510R-DTH) por 10 min. Después las muestras fueron centrifugadas a 12 000 rpm durante 10 min a 4°C y trasladadas a un congelador de -20 °C para dejarse incubando durante 12 h. Trascurrido este tiempo las muestras volvieron a sonicarse por 10 min, y fueron centrifugadas por segunda vez a 12 000 rpm durante 10 min a 4 °C. Finalmente, el sobrenadante obtenido fue filtrado mediante membranas de 0.45 µm de diámetro de poro y transferidas a viales para su inyección en el cromatógrafo de líquidos.

La identificación y cuantificación de GA4 y tZR se realizó en un cromatógrafo de líquidos (Marca VARIAN Modelo 920LC), utilizando como fases móviles ácido acético a una concentración de 100 mM (Fase A) y acetonitrilo al 100% (Fase B). La determinación de GA4 se realizó con una columna C18 (POLARIS 5 C18-A, 250 mm x 4.5 mm, 5 µm), utilizando proporciones de fase 50:50 (v/v) (fase A: B) y un flujo isocrático de 0.8 mL min^-1. Para la cuantificación de tZR se utilizó una columna C18 (AQUASIL C18, 250 mm x 4.6 mm, 5 µm), con proporciones de fase de 80:20 (v/v) (Fase A: B) y un flujo isocrático de 0.3 mL min^-1. El volumen de inyección del extracto vegetal para ambas determinaciones fue de 50 µL.

La detección de la molécula de GA4 se realizó a 205 nm, mientras que tZR se detectó a 268 nm. El tiempo de retención de la GA4 fue de 7.8±0.2 min y el de tZR fue de 15.4±0.25 min. Para la conversión de unidades de absorbancia a ppm se realizan curvas patrón con soluciones estándar de GA4 y tZR (Marca SIGMA). Los resultados de los cromatogramas obtenidos fueron evaluados mediante el software Galaxie Versión 1.9.302.530 (Marca VARIAN).

Para el análisis estadístico se utilizó un ANOVA con mediciones repetidas para el análisis estadístico de los datos de la cuantificación de GA4 y tZR. La prueba de diferencia mínima significativa (DMS) fue utilizada para la comparación de medias de las variables que mostraron una significancia en la prueba de F del Anova con un nivel de significancia estadística de α≤ 0.05. Los paquetes estadísticos usados fueron el INFOSTAT Versión 2014 y el IBM SPSS Statistics Versión 22.

Los resultados de la prueba de DMS (Cuadro 1) mostraron una diferencia estadística (p≤ 0.05) solo entre los órganos de plantas del mismo sexo, destacando el valor más alto de GA4 en las muestras obtenidas a partir de hojas, mientras los valores más altos de tZR se encontraron en la corona de plantas de ambos sexos y en las hojas de plantas estaminadas. No se observó diferencia significativa (p≤ 0.05) en las concentraciones de GA4 y tZR al comparar entre un mismo órgano de una planta pistilada y una estaminada.

La prueba de DMS evidenció una diferencia estadística (p≤ 0.05) entre plantas de diferente sexo al analizar el promedio global de GA4, denotándose la mayor concentración de esta fitohormona en plantas estaminadas (Cuadro 2). Para los valores globales de tZR no se observaron diferencias entre sexo. Por tal razón, las diferencias globales de GA4 encontradas entre las plantas pistiladas y estaminadas de D. cedrosanum se consideran relevantes ya que pueden constituir un punto de partida para posteriores estudios que permitan distinguir el sexo de la plantas en etapas tempranas de su crecimiento.

Los resultados obtenidos son diferentes a los reportados por ^{Zanewich (1993)}, quién encontró que los mayores niveles de giberelina A1 (GA1), giberelina A19 (GA19) y giberelina A20 (GA20) en los brotes de Brassica napus con una edad de 28 días (valores entre 10 y 20 ng g^-1 de peso seco). Una menor concentración de las tres giberelinas se encontró en los tallos medios, el hipocotiledón, y finalmente, las raíces, estas últimas con los niveles más bajos de GA1, GA19 y GA20 (valores por debajo de los 2.5 ng g^-1 de peso seco). El mismo autor en un muestreo realizado a los 64 días analizó otros órganos, tales como, los tallos de las inflorescencias, el tallo, las hojas, las raíces y las flores; encontrando los niveles más altos en las flores (valores entre 3 y 6 ng g^-1 de pesos seco), seguido de las hojas, los tallos y los tallos de las inflorescencias, mientras los contenidos más bajos se cuantificaron en las raíces (valores por debajo de 1 ng g^-1 de peso seco). Los valores de giberelina encontrados en los diferentes órganos de Dasylirion cedrosanum son mayores a los reportados para Brassica napus, ya que podemos encontrar valores desde 20 000 ng g^-1 ps (0.02 mg g^-1 ps en inflorescencias de plantas pistiladas) hasta los 150 000 ng g^-1 ps (0.15 mg g^-1 ps hojas de plantas estaminadas).

Por otro lado, ^{Battal y Tileklioğlu, (2001)} evaluaron el contenido de citocininas en plantas de Zea mays L. sometidas a diferentes medios de crecimiento, se observó que la mayor concentración de zeatina ribósido estaba en tallos (5.72 µg g^-1 pf a 7.67 µg g^-1 pf), seguida de hojas (3.3 µg g^-1 pf a 4.98 µg g^-1 pf) y finalmente, en flores femeninas (1.55 µg g^-1 pf a 2.2 µg g^-1 pf), comportamiento que fue similar en todos los tratamientos. Los valores de trans zeatina ribósido cuantificados en la corona 0.09 mg g^-1 ps y 0.1 mg g^-1 ps (equivalentes a 90 µg g^-1 ps y 100 µg g^-1 ps), hojas 0.1 mg g^-1 ps (equivalentes a 100 µg g^-1 ps y 150 µg g^-1 ps) e inflorescencias pistiladas y estaminadas 60 mg g^-1 ps (equivalentes a 60 µg g^-1 ps, en ambos casos) de D. cedrosanum fueron mayores a los reportados para Zea mays L. en órganos similares; aunque las concentraciones de GA4 y tZR en los diferentes órganos de D. cedrosanum son mayores a las encontradas en órganos similares de otras especies hay una tendencia similar entre especies en la acumulación de fitohormonas en los diferentes órganos.

Conclusiones

La mayor concentración de GA4 y tZR en Dasylirion cedrosanum se encontró en las hojas y la corona, respectivamente, sin observarse alguna diferencia entre plantas estaminadas y pistiladas. Los promedios globales de estas hormonas mostraron que solamente los niveles de GA4 fueron diferentes entre sexos. Las diferencias en la concentración de GA4 encontradas en un mismo órgano de plantas de diferente sexo constituyen un punto de partida para estudios posteriores enfocados a detectar el sexo de las plantas de Dasylirion cedrosanum en etapas tempranas de su crecimiento. Así mismo, las diferencias hormonales entre los distintos órganos analizados son aportaciones básicas para determinar el órgano de muestreo al realizar un monitoreo hormonal de algunas de las dos especies hormonales estudiadas en el presente trabajo (GA4 y tZR).