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Introducción
La nochebuena (Euphorbia pulcherrima, Willd. ex Klotzsch), también conocida como pascua, flor de navidad, estrella de navidad o Poinsettia, es originaria de la región que va desde el norte del estado de Morelos hasta el municipio de Taxco, Guerrero (Trejo et al., 2012). Aunque México es el centro de origen de esta planta, la producción de nochebuena depende de las variedades generadas en otros países. Las nuevas variedades que llegan a México han sido liberadas al menos dos años antes en el país donde fueron generadas. El pago de regalías por el uso de estos nuevos genotipos es de aproximadamente 10% del costo de cada planta, mismo que se incluye en el precio de venta del esqueje.
Las plantas del género Euphorbia se caracterizan por tener una flor femenina, sin pétalos y usualmente sin sépalos, rodeada por flores masculinas, todo en una estructura en forma de copa llamada ciato hermafrodita; también pueden tener ciatos femeninos y masculinos. En las inflorescencias hay hojas modificadas denominadas brácteas que pueden ser de color rojo, rosa y blanco (Recanses y Flores, 1983), en diferentes tonalidades o combinaciones de colores.
Los estudios relacionados con receptividad del estigma, calidad del polen y tipo de polinización de las especies son de gran importancia en investigaciones relacionadas con la reproducción sexual, pues permiten asegurar el éxito de las hibridaciones e incrementar la eficiencia del mejoramiento (Weller et al., 2007).
La receptividad estigmática es un parámetro floral que determina el tiempo en el que los estigmas mantienen la capacidad de generar un ambiente propicio para la germinación de los granos de polen, afectando directamente al éxito reproductivo y repercutiendo en la cosecha, cuando se trata de especies cultivadas; sin embargo, se desconocen los factores que la determinan (Lozada y Herrero, 2006). En la naturaleza, la receptividad del estigma generalmente está dada conjuntamente con la antesis (apertura) de la flor (Shivanna y Sawhney, 1997), pero en el caso de mejoramiento muchas veces prevalece la necesidad de realizar las polinizaciones dirigidas en estados fenológicos determinados. Actualmente las pruebas utilizadas principalmente en frutales para observar la receptividad estigmática, consiste en aplicar gotas de peróxido de hidrogeno en la pared estigmática, al observar burbujeo en ésta indica que hay receptividad (Osborn et al., 1988).
La viabilidad del polen es un factor que afecta el amarre de frutos; aunque existen métodos para determinar la germinación del polen in vivo, la viabilidad y el poder germinativo in vitro han sido ampliamente utilizados como métodos alternativos (Karapanos et al., 2010). Las pruebas in vitro pueden resultar sencillas y rápidas para determinar algunos aspectos relacionados con la fisiología del grano de polen. La viabilidad de polen en Euphorbias fue estudiada por Narbona et al. (2008) en E. nicaeensis, para comparar el nivel de viabilidad entre las flores hermafroditas y masculinas. Con respecto a la germinación de tubos polínicos, Cavalari (2010) evaluó el poder germinativo de las Euphorbiaceas en croto (Codiaeum variegatum) y pudo observar granos de polen germinados con un tubo polínico de 7 mm. De igual modo Lyra et al. (2011) determinaron 17 y 30% de germinación de granos de polen para dos especies de Jatropha.
Aunque el estudio de la biología reproductiva es de fundamental importancia en el mejoramiento genético, en la nochebuena es casi nulo. Huang y Chu (2008) reportan que evaluaron la fertilidad en nochebuena mediante la viabilidad de polen de plantas generadas in vitro con la finalidad de mejorar los resultados en sus cruzas. Con base en lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue evaluar las características reproductivas de tres variedades de nochebuena de sol y seis cultivares de sombra, como base para el mejoramiento genético.
Materiales y métodos
Las variedades de nochebuena de sol estudiadas fueron Belén, Juan Pablo, y Amanecer navideño; y los cultivares de sombra Freedom, Prestige, Nutcracker white, Ice punch, Sonora white glitter y Burgundy (Figura 1), las cuales fueron seleccionadas por presentar estructuras reproductivas masculinas y femeninas (indispensables para efectuar el estudio), por ser de alta importancia económica, y las más comercializadas en México. En las nueve variedades de nochebuena se estudió la viabilidad del polen mediante germinación del tubo polínico y tinción; también se determinó la receptividad del estigma, momento adecuado para la polinización, así como el tipo de polinización.
Figura 1 Nochebuenas de sombra. A) Freedom; B) Prestige;C) Nutcracker white; D) Ice punch; E) Sonora white glitter; F) Burgundy; nochebuenas de sol: G) Belén; H) Juan Pablo; I) Amanecer navideño.
Viabilidad del polen mediante germinación del tubo polínico
Cuando las anteras se desarrollaron se observaron con una lupa y se registró el día en que estas se abrieron, cuando el polen estaba fresco se tomó y fue cultivado en cajas Petrí que contenían medio a base de agar (4 g L-1) y sacarosa (0.06 mol L-1). Se cultivó en incubación a 36 °C; la cantidad de tubos polínicos germinados se observó a las 3, 6, 12, 24, 48 y 72 h. Se realizó el conteo de granos de polen germinados por caja para determinar el porcentaje de germinación y el tiempo requerido para alcanzar al menos 1% de germinación. También se midió la longitud de los tubos polínicos mediante el uso de un microscopio compuesto (Carl Zeiss®) observando a 10 y 40 dioptrías, con el fin de saber el tiempo requerido para la germinación, midiendo así la fertilidad del polen. Se utilizó un diseño completamente al azar, con tres repeticiones por variedad, cada repetición estuvo constituida por una caja Petri que contenía los granos de polen de tres anteras tomadas al azar.
Viabilidad del polen mediante tinción
La viabilidad del polen se evaluó también mediante tinción con una solución de ácido acetico-carmín. En cada planta se recolectaron dos anteras por flor (antes de la liberación del polen), estas se colocaron en un tubo por cada planta, y se fijaron en solución Farmer (3:1, alcohol etílico absoluto, ácido acético glacial), en esta solución se conservaron en refrigeración hasta su evaluación. Para el estudio, se colocó una antera sobre un portaobjetos, se cortó transversalmente, se agregó una gota de colorante aceto-carmín y con la hoja de un bisturí se aplastó suavemente la antera para que liberara el polen en la gota de colorante, se colocó el cubreobjetos y se dejaron trascurrir 5 a 10 s para observar al microscopio (40x) (Carl Zeiss®); para el conteo de granos de polen se realizaron siete preparaciones por cada planta, en cada preparación se observaron cuatro campos en los que se evaluó el número de granos teñidos y el número de granos de polen sin teñir. Con estos datos se determinó el porcentaje de viabilidad del polen en cada variedad. El estudio se realizó en un diseño experimental completamente al azar con siete repeticiones por variedad.
Receptividad del estigma
La receptividad del estigma se comprobó modificando el método de Osborn et al. (1988) lo cual consistió en colocar una gota de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 80% sobre los estigmas y tomar como resultado positivo la producción de burbujas, la adecuación del método se realizó debido a que con esta concentración hubo mayor reacción y se pudo observar con mayor eficiencia el burbujeo en el estigma. Este experimento se realizó en un diseño completamente al azar con cinco repeticiones (plantas) por variedades, en cada planta se tomaron cuatro inflorescencias.
Momento de polinización
Dado que no se dispone de antecedentes del momento de receptividad del estigma, se efectuaron polinizaciones en tres horarios del día (8:00, 14:00, 18:00) tomando como parámetro la cantidad de néctar presente en el nectario de las flores hermafroditas, mismo que se midió con una micro pipeta de 1 000 µL, realizándose en las nueve variedades, en cuatro inflorescencias de cinco plantas. Además, se realizó la prueba de Osborn et al. (1988), para conocer la receptividad estigmática. Se observó la sincronización entre la cantidad de néctar y la receptividad del estigma. Se usó un diseño completamente al azar con cinco repeticiones (plantas) por variedad, se evaluó la receptividad del estigma y volumen del néctar.
Tipo de polinización
Para determinar el tipo de polinización de las plantas de nochebuena, se evaluaron cuatro tratamientos: 1) emascular flores hermafroditas y cubrir completamente para evitar la llegada de polen externo; 2) cubrir las flores femeninas y cuando estuvieron receptivas polinizar con polen de otra planta de la misma variedad para después volver a cubrir, eliminar las flores machos conforme aparecieron; 3) cubrir las flores hembras y cuando estuvieron receptivas fueron polinizadas con polen de la misma planta y cubrir de nuevo; y 4) cubrir las flores hembras y cuando estuvieron receptivas fueron polinizarlas con polen de flores de plantas de otra variedad y cubrir de nuevo. El experimento fue desarrollado en un diseño completamente al azar, con cinco repeticiones (planta) por variedad, polinizando 15 flores por repetición. Se evaluó el porcentaje de amarre de fruto por planta.
Análisis de datos
En los cinco experimentos, los datos se estudiaron mediante análisis de varianza, prueba de comparación de medias con la prueba Tukey (p≤ 0.05) con el programa SAS 9.2 (SAS, 2002).
Resultados y discusión
Viabilidad del polen mediante germinación del tubo polínico
En las variedades de nochebuena el estilo del gineceo tuvo una longitud de 6 mm (Figura 2). El tubo polínico inicio su germinación in vitro a las 6 h, después de iniciado el cultivo pero fue hasta las 72 h cuando alcanzó los 6 mm necesarios para transportar los gametos masculinos desde el estigma hasta el ovario.
Figura 2 A) longitud del estilo de nochebuena, medido con regla y papel milimétrico; y B) corte anatómico de una flor femenina donde se observa la longitud del estilo.
El análisis de varianza mostró diferencias altamente significativas en la germinación del tubo polínico de las nueve variedades de nochebuena. Las nochebuenas de sol, presentaron la mayor germinación de tubo polínico (>90%), cuatro de los cultivares de sombra tuvieron de 80 a 84% de granos de polen viables; Nutcraker white presentó la menor viabilidad del polen (Cuadro 1). Lo anterior indicó que las variedades de sol podrían ser buenos machos, lo contrario ocurrió con Nutcracker white. Estos valores de germinación fueron mayores a 30 y 17% observado por Lyra et al. (2011) en el estudio efectuado con Jatropha molissima y J. ribifolia. Narbona et al. (2005) observaron un promedio de 31.8% de viabilidad del polen en E. boetica, que también fue menor a lo observado en la presente investigación.
Valores con la misma letra son estadísticamente iguales de acuerdo con la prueba de Tukey (p≤ 0.05).
Cuadro 1 Viabilidad del polen mediante germinación de tubo polínico a 36 °C y mediante tinción con ácido acético-carmín, en nueve variedades de nochebuena.
En cuanto al tiempo requerido para la germinación del tubo polínico, Cavalari (2010) realizó un estudio en Euphorbia con Codiaeum variegatum, y observó que los granos de polen de este género alcanzaron su madurez a las 65 h en el medio de germinación en comparación con las 72 h requeridas por las variedades de nochebuena de esta investigación. Lo anterior, indicó que se requirieron cerca de 72 h después de la polinización para que pudiera ocurrir la fecundación.
Viabilidad del polen mediante tinción
En las preparaciones realizadas para observar al microscopio se presentaron dos tipos de tinciones, los granos de polen que mostraron una coloración intensa fueron los granos viables, mientras que los granos de polen casi transparentes fueron los granos estériles (Figura 3). La viabilidad del polen mediante tinción fue mayor (91 a 93%) en las variedades de sol; cuatro variedades de sombra tuvieron de 80 a 85% de polen viable, en tanto que Prestige y Nutcraker white presentaron los valores menores (Cuadro 1).
Figura 3 A) grano de polen viable en nochebuena; y B) grano de polen no viable, observados a 10 dioptrías.
La viabilidad de polen mediante tinción con carmín fue muy similar a la obtenida con la germinación del tubo polínico por lo que, cualquiera de las dos metodologías fueron confiables para evaluar los gametos masculinos (Cuadro 1); dado lo anterior, se consideró que la evaluación de la viabilidad mediante tinción de granos de polen fue adecuada por ser una metodología más sencilla.
Receptividad del estigma
Las variedades de sol Juan Pablo, Belén, y Amanecer navideño tuvieron mayor porcentaje de flores (43, 43.7 y 46.3) que presentaron burbujeo, con lo cual se evidenció la receptividad del estigma (Figuras 4 y 5) sin diferencias entre ellas. En contraste, las variedades de sombra tuvieron menor porcentaje de flores receptivas, de éstas Sonora White glitter fue la que presentó la menor receptividad (24%), en tanto que Prestige y Nutcraker white no presentaron burbujeo en el estigma, lo que indicó ausencia de receptividad.
Figura 4 Receptividad del estigma en nochebuena. A y B) burbujeo en el estigma Método de Osborn (1988).
En cuanto a la hora en la que los estigmas estuvieron receptivos, se observó que con excepción de Nutcraker white y Prestige, todas las variedades tuvieron más flores receptivas a las 14:00 h, en la mayoría de las variedades la menor receptividad fue a las 8:00 de la mañana.
Los resultados sugieren que las nochebuenas se encontraron receptivas en el momento del día cuando el clima fue más cálido (14:00 h) (Figura 5), lo cual podría indicar que en lugares más calurosos, la receptividad estigmática podría ocurrir antes de la hora de mayor receptividad observada en esta investigación, donde la temperatura media anual es de 21.5 °C, acorde con lo anterior, Campos (2013) observó que la mejor hora para realizar la polinización de nochebuena en Zacatepec, Morelos (24 °C temperatura media anual) fueron las 11:00 am pues obtuvo mayor cantidad de frutos por planta (1.85) y semillas por fruto (2.56) en comparación con la polinización efectuada a las 12:00 del día, en la cual se cosecharon 1.1 frutos por planta y 0.83 semillas por fruto.
Considerando los resultados obtenidos por Lozada y Herrero (2006), quienes mencionaron que la receptividad estigmática afectó directamente el éxito reproductivo, las variedades Prestige y Nutcracker white que no presentaron receptividad del estigma no tuvieron posibilidad de formar frutos, por el contrario, las nochebuenas de sol al presentar mayor porcentaje de flores receptivas podrían formar mayor cantidad de cápsulas. Con base en los resultados, las variedades de sol son candidatas viables para ser las hembras en un programa de mejoramiento genético de nochebuena.
Momento de polinización
La receptividad del estigma fue menor a las 8:00 am en las siete variedades que presentaron receptividad del órgano femenino, en tanto que ésta fue mayor a las 14:00 h, indicando que esa hora correspondió al momento adecuado para realizar la polinización; las tres variedades de nochebuena de sol fueron las que tuvieron mayor porcentaje de flores receptivas (43 a 46 %) (Figura 5). Prestige y Nutcracker white no presentaron receptividad del estigma en ninguna de la hora en que se hizo la evaluación, lo que indico que estas dos variedades no podrían fungir como progenitores hembras o machos en un programa de mejoramiento genético, ya que además, tuvieron el menor porcentaje de viabilidad de polen.
En todas las variedades, con excepción de Nutcracker white y Prestige, se pudo observar que el néctar comenzó a fluir de los nectarios en las flores masculinas después de la dehiscencia del polen; en tanto que la prueba de receptividad estigmática fue positiva tres días después de la dehiscencia del polen (Figura 6); lo anterior indicó ausencia de sincronización en la madurez de estructuras masculinas y femeninas. Esta podrá ser la razón por la cual la nochebuena es de polinización cruzada, pues como menciona Augspurger (1983) el éxito reproductivo se ve influido por el grado de sincronía de los eventos de floración.
Figura 6 Asincronía floral en nochebuena. Flores masculinas con dehiscencia de polen y nectario, flor hermafrodita inmadura, aun no presenta receptividad estigmática.
La cantidad de néctar fue mayor en las variedades de nochebuena de sol > 38 µL, en tanto que, en las variedades de sombra fue 13.5-16.2 µL menor (Cuadro 2). Esta característica estuvo relacionada con la receptividad del estigma, la cual también fue mayor en las variedades de sol (Figura 6). El volumen del nectario podría ser el parámetro que indica el momento de polinización. Sin embargo, es más visible la dehiscencia de polen y se observó que la receptividad de las flores hermafroditas ocurrió tres días después de la liberación de los gametos masculinos, pudiendo ser la dehiscencia del polen un mejor indicador para identificar el momento adecuado para la polinización. Al respecto, Vargas et al. (1999) señalaron que en E. heterophylla la liberación de polen fue mayor con el aumento de la temperatura ocurriendo un incremento después del medio día o al final de la tarde, esto en Viçosa, Brasil.
Valores con la misma letra son estadísticamente iguales de acuerdo a la prueba de Tukey (p≤ 0.05).
Cuadro 2 Volumen de néctar en nueve variedades de nochebuena.
La hora adecuada para la polinización será variable en función del lugar, pues la dehiscencia de granos de polen fue afectada por la temperatura y humedad relativa del ambiente de cultivo, como fue reportado por Lisci et al. (1994) quienes señalaron que la hora del día para la dehiscencia de las anteras varió en el tiempo y parece estar influenciada por la temperatura y la humedad relativa.
Durante el desarrollo del experimento, en las variedades de sol se observaron diversos insectos polinizadores entre las 12:00 y las 16:00 h, cuando los nectarios tuvieron en promedio 35 µl de néctar; los órdenes de los insectos que se observaron fueron himenóptera, díptera (familia Tachinidae), coleóptera y lepidóptera mariposa monarca (Danaus plexippus) (Figura 7) esta última fue la única que se observó en las variedades de sombra.
Tipo de polinización
El tratamiento 1 que consistió en emascular flores y cubrirlas para evitar la llegada de polen extraño, no hubo formación de frutos, lo cual indicó que la nochebuena no produjo semillas mediante apomixis.
El tratamiento 2 consistió en eliminar las flores machos conforme aparecieron y se polinizaron las flores femeninas con polen de otra planta de la misma variedad, se formaron frutos solo en las variedades de sol, más de dos frutos, teniendo diferencias significativas con las demás variedades, las cuales generaron en promedio menos de un fruto, lo cual reforzó que la nochebuena es una planta de polinización cruzada.
En el tratamiento 3 donde se cubrieron las flores hembras y fueron polinizadas con polen de flores de la misma planta y cubiertas de nuevo, no se observó formación de frutos lo que indicó que fue posible que en la nochebuena hubiera autoincompatibilidad de gametos.
Finalmente, en el tratamiento 4 donde se cubrieron las flores hembras y se polinizaron con polen de otra variedad de nochebuena hubo formación de frutos, manifestando que el tipo de polinización de nochebuena fue cruzado, ya que se formaron frutos en la mayoría de las variedades, con excepción de Prestige y Nutcracker white. La mayor cantidad de frutos se observó en las variedades de sol, en especial en Belén (2.6 frutos en promedio) mientras que las variedades Freedom, Burgundy e Ice punch formaron 0.85 frutos en promedio (Figura 8), los frutos se formaron en las flores hermafroditas.
Conclusiones
Las variedades de sol tuvieron mayor viabilidad de polen, flores receptivas, y amarre de fruto, por lo cual pueden servir como hembras en un programa de fitomejoramiento. Nutcraker white y Prestige son variedades que no podrían fungir como hembras porque no presentaron receptividad del estigma ni amarre de fruto. La mayor receptividad del estigma se tuvo a las 14:00 h, misma que ocurre en el periodo de actividad de los insectos polinizadores. Se determinó que el tipo de polinización de la nochebuena es cruzada.
