Introducción

La lenteja (L. culinaris.) es un grano relativamente tolerante a la sequía, y prospera en muchos ambientes (^{Torino et al., 2013}). Los mayores consumidores se encuentran en Asia, el norte de África, Europa Occidental y parte de Latinoamérica (^{FAO, 2013}). La lenteja es un alimento con una alta concentración de nutrientes. Los hidratos de carbono son los más abundantes (58%) y están formados fundamentalmente por almidón; el contenido en lípidos es muy bajo (2.3%) y el aporte de proteína y fibra es importante con 22 y 18%, respectivamente (^{Silva-Cristóbal et al., 2010}). Las lentejas germinadas tienen propiedades nutricionales superiores a las de las secas: su contenido de vitaminas, minerales, oligoelementos y enzimas pueden multiplicarse por varias centenas durante la germinación (^{Cueva y Sánchez, 2017}).

Las lentejas germinadas en ciertas condiciones tienen propiedades contra la hipertensión arterial (^{Torres-Acosta y Calvo-Araujo, 2011}). Otros trabajos indican que el consumo en fresco de germinados de lenteja aporta carbohidratos, fibra, vitaminas, nutrimentos y un alto contenido de compuestos fitoquímicos con efecto bioactivo como actividad antidiabética, antiinflamatoria, anticáncerigena, antihipertensiva y antioxidante (^{Dziki et al., 2015}). Dichas propiedades se deben a la acción de metabolitos secundarios como los compuestos fenólicos, los cuales han sido ampliamente estudiados y se utilizan comúnmente como antioxidantes para una amplia gama de aplicaciones (^{Cerón et al., 2010}), por lo que su incremento en germinados es una línea de investigación para la obtención de antioxidantes obtenidos a partir de fuentes naturales, lo cual puede convertirse en una innovación importante para la producción de alimentos funcionales (^{González y García, 2012}).

Diversas investigaciones demuestran un incremento en el contenido de compuestos con propiedades bioactivas en germinados de diferentes especies por la aplicación de compuestos que funcionan como elicitores ya que promueven la sintésis de compuestos derivados de los fenilpropanoides y activan cascadas de señalización que incrementan la actividad antioxidante (^{Świeca et al., 2014}). Algunos de los trabajos mencionados han estudiado la aplicación de compuestos como peróxido de hidrógeno (^{Barba-Espín et al., 2012}), corteza de levadura (^{Yu Tian et al., 2014}), y aplicación de minerales como selenio y azufre para mejorar el contenido de compuestos prosalud (^{Świeca et al., 2014}). Por otro lado, la aplicación de ácidos orgánicos también ha demostrado un incremento de este tipo de compuestos en las plantas (^{Ulloa et al., 2010}, ^{Vázquez-Díaz et al., 2016}).

El ácido cítrico mejora el contenido antioxidante de los alimentos, ya que estimula una mayor síntesis de compuestos nutracéuticos que funcionan como antioxidantes, entre los cuales se encuentran los compuestos fenólicos y flavonoides entre ellos (^{Pérez-Balibrea et al., 2008}). Por lo cual, el empleo de ácido cítrico durante el periodo de producción de germinados puede constituir una herramienta muy útil para potenciar la síntesis de compuestos bioactivos. Por otro lado, no existen estudios disponibles en relación con la capacidad antioxidante, contenido de compuestos fenólicos y flavonoides, así como la calidad en azúcares solubes y materia seca en germinados de lenteja por efecto de aplicación de ácido cítrico. El objetivo de la investigación fue evaluar el efecto de la aplicación de diferentes dosis de ácido cítrico en el contenido de compuestos fenólicos totales, flavonoides totales, capacidad antioxidante total materia seca y azúcares solubles en germinados de lenteja.

Materiales y métodos

La presente investigación se desarrolló en la Universidad Politécnica de Gómez Palacio, en Gómez Palacio, Durango, México, entre las coordenadas geográficas 25° 32’ - 25° 54’ de latitud norte y 103° 19’ - 103° 42’ de longitud oeste. Se utilizó semilla de lenteja (Lens culinaris) con un porcentaje de germinación de 95%. Las condiciones de temperatura en el estudio fueron de 15-18 ºC, y para la realización del experimento se utilizó agua destilada. Primeramente, las semillas fueron sometidas durante 15 min a un lavado mediante inmersión en agua con hipoclorito de sodio (NaCIO) a una concentración de 1 mL L^-1. Posteriormente las semillas fueron enjuagadas y escurridas dos veces para eliminar el exceso de NaClO. Enseguida, para la pregerminación se siguió la metodología de ^{Dziki et al., 2015} que consistió en inmersión en agua durante 6 h, para después enjuagar y escurrir nuevamente antes de la germinación.

La germinación consistió en colocar las semillas pregerminadas en recipientes de plástico de poliestireno espumado con un área de 15x10x5 cm, con perforaciones en la parte basal para permitir percolacion y aireación. Los recipientes se cubrieron con manta del número uno y se colocaron por 6 h en oscuridad. Transcurrido este tiempo inició la etapa de crecimiento, en la cual se aplicaron los tratamientos y tuvo una duración de 6 días.

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con cuatro repeticiones por tratamiento los cuales consistieron en la aplicación de ácido cítrico (C₆H₈O₇) en concentraciones de 0, 10^-2, 10^-3,10^-4 y 10^-5 M. Durante la germinación y siembra se realizaron riegos cada 3 h exclusivamente con agua, mediante aspersión con una cantidad de 5 mL por aplicación. Las aplicaciones de los tratamientos se llevaron a cabo en la etapa de crecimiento empleando la misma dosis de riego. Las variables evaluadas fueron el contenido de compuestos fenólicos totales, flavonoides totales, capacidad antioxidante total, porcentaje de materia seca y azúcares solubles.

Para cuantificar las primeras tres variables se prepararon extractos mezclando 2 g de muestra fresca en 10 ml de etanol 80% en tubos de plástico con tapa de rosca, los cuales fueron colocados en agitador rotatorio (ATR Inc., EE. UU) durante 24 h a 20 rpm y a 5 °C. Luego, los tubos fueron centrifugados a 3000 rpm durante 5 min y el sobrenadante fue extraído para su análisis.

El contenido de compuestos fenólicos totales (CFT) se determinó usando una modificación del método de Folin-Ciocalteu (^{Singleton et al., 1999}). Se realizó una curva de calibración utilizando ácido gálico como estándar, y los resultados se registraron en mg de ácido gálico equivalente por 100 g en base a peso fresco (mg AGE 100 g^-1 PF). Para la cuantificación de flavonoides totales se utilizó el método descrito por ^{Lamaison y Carnet (1990)}. Se realizó una curva de calibración utilizando como estándar quercetina. Los resultados fueron expresados en mg equivalentes de quercetina por 100 g en base al peso fresco (mg EQ 100 g^-1 PF).

La capacidad antioxidante total se determinó con el método in vitro DPPH⁺ (^{Brand-Williams et al., 1995}). Para lo cual, se preparó una solución de DPPH⁺ (Aldrich, St. Louis, Missouri, EU) en etanol, ajustando la absorbancia de la solución a 1 100 ± 0.01 a una longitud de onda de 515 nm. Se preparó una curva estándar con Trolox (Aldrich, St. Louis, Missouri, EU), los resultados se reportan como capacidad antioxidante equivalente en µM equivalente en Trolox por 100 g en base peso fresco (µM equiv Trolox 100 gm^-1 PF).

La materia seca se determinó siguiendo el método oficial de la AOAC (1990). Para determinar el contenido de sólidos solubles totales se pesaron 2 g del germinado macerado en un mortero con pistilo y se colocaron unas gotas en el prisma de una refracómetro (Atargo, modelo SPR-N).

Para el análisis estadístico se usó el programa SAS versión 9.0 mediante un análisis de varianza y para la comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey al 0.05 de probabilidad. Además, se realizó un análisis de correlación de Pearson (p≤ 0.05) para detectar correlación entre las variables de calidad nutracéutica evaluadas.

Resultados y discusión

El contenido de compuestos fenólicos totales mostró un incremento significativo debido a la aplicación de ácido cítrico (p≤ 0.05) (Figura 1). El tratamiento 10^-2 M mostró el mayor contenido con 185.80 mg 100 g PF, le siguió el tratamiento 10^-3 M y 10^-4 M con 165.44 y 143 .47 mg 100 g^-1, respectivamente. El tratamiento con más bajo contenido de fenólicos totales fue el 10^-5 M y este similar al control. El ácido cítrico puede degradar fenoles conjugados como taninos a otros compuestos fenólicos más simples mediante hidrolización (^{Larqué-Saavedra et al., 2010}). Estos compuestos pueden acumularse en las vacuolas celulares (^{Tester et al., 2004}). El aumento de los fenólicos totales en los germinados podría ser debido a la liberación de ácidos fenólicos a partir de la descomposición de los constituyentes celulares en el germinado (^{Ulloa et al., 2010}).

Figura 1 Contenido de compuestos fenólicos y flavonoides en germinados de trigo sometidos a diferentes concentraciones molares de ácido cítrico. Valores seguidos de diferente letra en columnas indican diferencia estadística significativa (Tukey p≤ 0.05). 

El contenido de flavonoides totales evaluados en los germinados de lenteja (Figura 1) fueron afectados significativamente por las distintas concentraciones de ácido cítrico (p≤ 0.05), los valores obtenidos fluctuaron entre 103 y 150 mg 100 g^-1 PF. El mayor contenido de flavonoides se presentó en los germinados de lenteja asperjados con concentración de 10^-2 en comparación con el testigo que presentó 68% el valor más bajo.

El ácido cítrico incrementa la síntesis de metabolitos secundarios como flavonoides (^{Reynoso-Camacho et al., 2006}), lo cual concuerda con los resultados de este trabajo, ya que aumentó significativamente el contenido de estos metabolitos. Posiblemente, la aplicación del ácido activó las vías de trasducción de señales del metabolismo secundario producidas por las plantas (^{Ulloa et al., 2010}). Esto podría tener impacto en el incremento de estos compuestos debido a que los flavonoides están implicados en la prevención de enfermedades crónico degenerativas por medio de su actividad antioxidante (^{González-Jiménez et al., 2015}).

La capacidad antioxidante mostró diferencia significativa (p≤ 0.05) (Figura 2). La concentración 10^-2 M mostró la mayor capacidad antioxidante, mientras que la dosis de 10^-5 y el control presentaron los valores más bajos (Figura 2). En este trabajo, la capacidad antioxidante puede ser atribuida a que el ácido cítrico estimuló los mecanismos de defensa de la semilla en germinación desencadenando la acumulación de compuestos antioxidantes (^{Yildirim y Dursum, 2009}). La capacidad antioxidante de un alimento depende de la naturaleza, concentración de diferentes compuestos y los antioxidantes naturales presentes en él (^{Cerón et al., 2010}). Por otro lado, ^{Swieca y Baraniak (2014)} señalan que la mayor o menor actividad antioxidante no siempre va aparejada con la concentración de compuestos fenólicos.

Figura 2 Capacidad antioxidante en germinados de trigo sometidos a diferentes concentraciones molares de ácido cítrico. Valores seguidos de diferente letra indican diferencia estadística significativa (Tukey p≤ 0.05). 

Para determinar la relación entre la capacidad antioxidante y el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides totales, se realizó una correlacion de Pearson (Figura 3). Los resultados muestran que existe una fuerte correlación positiva entre la capacidad antioxidante y el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides (r²= 0.86 y r²= 0.78), lo que sugiere que en este trabajo, estos compuestos son de naturaleza antioxidante. Es decir, la capacidad antioxidante de los germinados de lenteja se debe en 86% a los compuestos fenólicos. Además, la capacidad antioxidante en los germinados de lenteja es debida a 78% al contenido de flavonoides. Estos resultados concuerdan con la literatura que señala el potencial beneficio para la salud de los compuestos fenólicos y flavonoides, atribuyéndoseles principalmente a su actividad antioxidante (^{Fredes et al., 2013}).

Figura 3 Correlación de Pearson (r²) entre la capacidad antioxidante total (CAT) con el contenido de fenólicos totales (CFT) y flavonoides totales (FT) en germinados de lenteja bajo diferentes concentraciones molares de ácido cítrico. 

Asimismo, se encontró una correlación entre el contenido de compuestos fenólicos totales y los flavonoides totales (Figura 4), siendo estos los principales compuestos fenólicos identificados y reportados en germinados (^{Dziki et al., 2015}). Lo anterior indica que existe una correlación positiva entre los compuestos fenólicos y el contenido de flavonoides totales (r²= 0.85). Siendo, por lo tanto 85% de los fenólicos presentes en los germinados, flavonoides.

Figura 4 Correlación de Pearson (r²) entre el contenido de compuestos fenólicos totales (CFT) y flavonoides totales (FT) en germinados de lenteja bajo diferentes concentraciones molares de ácido cítrico. 

Por otra parte, la calidad de un alimento está influenciado por su porcentaje de materia seca debido a que define la calidad nutricional del mismo (^{Anjum et al., 2013}). El porcentaje de materia seca (MS) en los germinados de lenteja mostró diferencia significativa (p≤ 0.05) entre los tratamientos de ácido cítrico (Cuadro 1), con valores comprendidos entre 24 y 32%. La concentración de 10^-2 M tuvo el mayor porcentaje de MS, mientras que el resto de los tratamientos y el control fueron similares. Los resultados sugieren que la aplicación de ácido cítrico en más alta concentración promueve la acumulación de la materia seca en los germinados, posiblemente a través de la participación en la sintésis de hormonas de crecimiento que controlan y coordinan la división celular (^{Amin et al., 2016}).

Similarmente, el AB a concentraciones de 5-20 mg L^-1 estimula el crecimiento y eleva los niveles de promotores de crecimiento en Ammi visnaga L. (^{Talaat et al., 2014}). Además, el AB incrementa el contenido de materia seca y rendimiento en plantas de soya a concentraciones de 100 a 400 mg L^-1 (^{Anjum et al., 2013}).

Los contenidos de sólidos solubles totales en los germinados de lenteja mostraron diferencia significativa (p≤ 0.05) debido a las dósis de ácido cítrico evaluados (Cuadro 1), lo cual coincidió con el resto de las variables en donde el valor más alto lo obtuvo la concentracion 10^-2 M con un valor de 12 °Brix. Los valores encontrados son coincidentes con lo reportado por ^{Buitrago et al. (2015)}, quienes señalan 12 ºBrix en germinados de Vaccinium meridionale.

Conclusiones

El valor más alto de compuestos fenólicos y flavonoides se obtuvo con el tratamiento de 10^-2 M de ácido cítrico con 185.5, 150 mg 100 g^-1 peso fresco respectivamente. Igualmente, la capacidad antioxidante fue mayor con el mismo tratamiento (10^-2 M). La aplicación de bajas concentraciones de moléculas inductoras del metabolismo secundario durante la etapa de desarrollo de germinados es un método útil y efectivo para estimular la biosíntesis de fitoquímicos bioactivos y mejorar la capacidad antioxidante de este tipo de alimento, ampliando así las posibilidades de uso de este alimento como ingrediente en alimentos funcionales o bien para su consumo en fresco.