Material vegetal

Se seleccionó el material vegetal de una población de amplia base genética de plantas partenocarpicas de calabaza arbustiva, 46 genotipos provenientes de la libre recombinación de progenies con cruzamiento dialélico (método IV de 1989), de siete variedades experimentales tipo round zucchini. Dicha población fue desarrollada ex profeso en el Programa de Mejoramiento Genético del Departamento de Fitotecnia de la Universidad Autónoma Chapingo, México.

Análisis molecular

El análisis molecular se realizó en el Laboratorio de Fisiología de la Interacción Planta-Patógeno (FPP) en el Colegio de Postgraduados, México. Se extrajo el ADN genómico de 46 genotipos, a partir de hojas jóvenes, sanas y liofilizadas con el protocolo modificado por ^{Rojas et al. (2003)}, conocido como método combinado: MLO y CTAB 3%.

La calidad del ADN se verificó mediante electroforesis en geles de agarosa 1.2% (p/v) teñidos en una solución de bromuro de etidio (10 mg ml^-1) y por medio de un espectrofotómetro de ultra-bajo volumen (NanoDrop ND-1000 V3.7 de Thermo Scientific^®) se determinó la absorbancia (260/280) en un rango de 1.33 a 1.94, la concentración del ADN fue de 202.3-512.1 ng µL^-1.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo para la ISSR con un iniciador (GATA)₄ y para RAMP se utilizaron cuatro iniciadores de secuencia aleatoria de la serie A de Operon (OPA: 05, 10, 13, 19) combinados con (GATA)₄, estos iniciadores fueron sintetizados por el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Los iniciadores seleccionados son el resultado de la estandarización del protocolo y fueron los que presentaron polimorfismo y marcaron diferencias considerables en el bandeo, entre los genotipos.

El volumen y la concentración de cada reactivo en la mezcla de reacción para la PCR, se ajustó a 25 µL como volumen final, la cual contuvo: 2.5 µL de Buffer [10 X ], 1.5 µL de MgCl₂, [30 Mm µL^-1 ], 0.5 µL de Dntp’s [2.5 Mm µL^-1 ], 2 µL de (GATA)₄ [10 pmol µL^-1 ], 0.2 µL de Taq ADN-polimerasa (Amplificasa^®) [5 U µL^-1 ], 4 µL de ADN genómico [20 ng µL^-1 ] y 14.05 µL de agua desionizada estéril, para el caso de ISSR, mientras que para RAMP, se adicionó 2 µL de cada iniciador aleatorio por reacción (OPA05, OPA10, OPA13 y OPA19) [10 pmol µL^-1 ] y el agua se ajustó a 12.05 µL, las combinaciones de cada RAMP quedaron de la siguiente manera: OPA05+(GATA)₄, OPA10+(GATA)₄, OPA13+(GATA)₄ y OPA19+(GATA)₄. El ADN se colocó de manera individual a cada tubo según el número de genotipo de calabaza a caracterizar.

Se utilizó un termociclador APOLO^® (Instrumentation ATC 201, serie 00449), las condiciones de termociclaje para ISSR consistieron de un ciclo de predesnaturalización de 1 min a 94 °C, 40 ciclos de 40 s a 94 °C, 1 min a 40 °C y 1 min a 72 °C, seguidos de un ciclo de 8 min a 72 °C y un periodo a 4 °C de extensión final, mientras que para RAMP las condiciones consistieron de un ciclo de predesnaturalización de 2 min a 94 °C, 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 2 min a 50 °C y 3 min a 72 °C, seguidos de un ciclo de 10 min a 72 °C y un periodo de extensión final a 4 °C.

Los productos de amplificación obtenidos de los ISSR y RAMP se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2.5% (p/v) a 85 volts, durante un periodo de 4.5 h. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio y las bandas se visualizaron bajo luz ultravioleta en un fotodocumentador (modelo Gel Doc 2000, BIO RAD^®), la foto del gel se capturó con el programa Quantity One 4.0.3. Se utilizó el marcador de peso molecular 1 Kb (Invitrogen^®) en ambos costados del gel de agarosa.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó en forma separada para cada una de las técnicas moleculares. En el análisis de conglomerados se calcularon las distancias genéticas con el coeficiente de apareamiento simple, ^{Sokal y Sneath, (1963)} y se obtuvo un dendrograma de similaridad por medio del método del promedio aritmético no ponderado por pares entre agrupamientos, tipo UPGMA (^{Adams et al., 2000}). La robustez se probó por medio de 1 000 remuestreos en las matrices de distancias genéticas con un α= 0.05, la confiabilidad de los resultados se verificó por medio de una prueba de ^{Mantel (1967)}. Como parámetros de diversidad genética se consideraron: el porcentaje de loci polimórfico y el rango de polimorfismo en pares de bases (pb), las distancias genéticas de similitud y el rango de distancias genéticas (RDG) entre grupos y genotipos. Se utilizó el paquete computacional de NTSYSpc versión 2.21 h (Rohlf, 2009).

Análisis del polimorfismo

Se produjo un total de seis loci amplificados, los cuales representaron el 100% del polimorfismo generado por el iniciador (GATA)₄ utilizado para los ISSR y con un rango del peso molecular en la amplificación de loci polimórficos de 506 a 1 636 pb (Cuadro 1). Éstos resultados indican que los genotipos partenocarpicos de calabaza tienen poca diferenciación genética, por el bajo número de loci detectados con los ISSR; al respecto, ^{Vigoroux et al. (2002)} menciona que las especies cultivadas han experimentado una fuerte presión de selección dirigida a genes que controlan algunas regiones genómicas, mientras que los genes que no tienen presión de selección mantienen similitud con sus parientes silvestre, la selección que el ser humano ha realizado a las especies cultivadas durante su domesticación y su mejoramiento genético ha reducido la variación en exceso sobre todo en los genes para los que dicha especie poseía variación alélica, mientras que otros loci experimentan modificación de la diversidad acorde con el efecto natural, en este sentido Restrepo y Vallejo (2008), en un trabajo con colectas de Cucurbita moshata y con marcadores polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP), mencionan que los niveles de variación genética o heterocigosidad más altos se debe a la distancia entre poblaciones y a los intercambios antrópicos que se da en esta especie.

^{Pradeep (2002)} menciona que los ISSR frecuentemente amplifican de 25 a 50 bandas en una sola reacción y permiten detectar el polimorfismo entre individuos de la misma población, evaluación de diversidad genética, así como distinción e identificación de variedades intraespecíficas (particularmente en especies con importancia económica), entre otras.

Para RAMP, 34 loci de 37 totales amplificados fueron polimórficos lo que representa 91.8% y con un promedio de 8.5 loci por iniciador. El rango de amplificación se ubicó entre los 298 y 3 054 pb. Las combinaciones en las que se identificó menor variabilidad genética entre los genotipos fue con las combinaciones OPA10+(GATA)₄ y OPA13+(GATA)₄ con 25% y 8.3% de loci monomórficos, respectivamente (Cuadro 1), ^{Wu et al. (1994)} reportaron entre 10 a 20 de polimorfismo por iniciador en geles de acrilamida en ecotipos de Arabidopsis usando la técnica RAMP, lo que superó las expectativas del uso de esta técnica con respecto a otras alternativas, además de que favorece principalmente la amplificación de los microsatélites, sin excluir la amplificación de RAPD.

^{Valadez-Moctezuma et al. (2005)}, mencionan que con la técnica RAMP es posible identificar perfiles nuevos que comparten algunos fragmentos, de los perfiles obtenidos independientemente con las técnicas RAPD y microsatélites, además indican que los análisis RAMP proporcionan una nueva alternativa para analizar y hacer estudios de diversidad genética prácticamente en cualquier genoma; estos resultados respaldan ésta investigación debido a que se corroboran las diferencias encontradas entre el polimorfismo de ISSR, con respecto a RAMP, en los genotipos partenocarpicos de calabaza, por lo que resulto ser muy informativa la técnica de RAMP.

Análisis de agrupamiento

El árbol consenso o dendrograma de distancias genéticas de similaridad, obtenido de la robustez de los agrupamientos por 1 000 remuetreos generó cinco grupos con ISSR y cuatro grupos con RAMP. Estos grupos fueron definidos principalmente por la variabilidad genética que existe entre los genotipos (Figura 1 y 2), ^{Méndez et al. (2010)} en un trabajo previo caracterizaron los mismos genotipos partenocarpicos, con variables morfológicas y agronómicas, en el cual encontraron tres agrupaciones.

Figura 1 Dendrograma promedio construido a partir de 1000 combinaciones de remuestreo obtenido mediante el coeficiente de apareamiento simple (SM) de los productos amplificados de ISSR (GATA)₄ para 46 genotipos partenocarpicos de calabaza. 

Los grupos obtenidos en el dendrograma para ISSR muestran a los genotipos 3, 15, 16, 20, 25, 28, 33, 38, 47, 51, 82, 84, 97, 103, 106 y 107 en el grupo I, con un RDG de 0.781 a 1, el grupo II lo integran los genotipos 5, 13, 14, 21, 30, 35, 45, 48, 62, 63, 70, 90, 91 y 105 (RDG de 0.802 a 1), en tanto que el grupo III está integrado por los genotipos 19, 26, 29, 41, 44, 56, 57, 87, 93 y 108 (RGD: 0.849 a 1), el grupo IV lo conforman los genotipos 23, 69 y 88 con similitud genética de 1, mientras que el grupo V lo integran los genotipos 73, 83 y 96, este grupo se encontró a mayor distancia genética con respecto a los otros grupos (0.469), el RDG entre los genotipos fue de 0.761 a 0.849 (Figura 1).

Estos resultados muestran concordancia con ^{Méndez et al. (2010)}, por lo que los agrupamientos formados con ISSR presentaron las características siguientes: el grupo I está definido por plantas con entrenudos largos, frutos redondos de peso intermedio, cáscara delgada, mucha semilla y pequeña, en los grupos II y V, predominan plantas con entrenudos cortos, frutos alargados con bajo peso, cáscara delgada, poca semilla y pequeña. El grupo IV presenta plantas con entrenudos intermedios, frutos redondos, pesados, cáscara gruesa, mucha semilla y grande.

En tanto que, con los resultados obtenidos con RAMP los grupos se conformaron de la siguiente manera: grupo I, genotipos 3, 5, 35, 47, 48 y 56, RDG de 0.729 a 0.919, grupo II conformado por los genotipos 14, 16, 28, 29, 30, 33, 62, 69, 83, 91, 93, 96 y 97, RDG de 0.720 a 0.945, grupo III integrado por 13, 15, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 38, 41, 44, 45, 73, 84, 88, 90, 106, 107 y 108, RDG de 0.782 a 0.974 y grupo IV con los genotipos 51, 57, 63, 70, 82, 87, 103 y 105, este último grupo contiene los genotipos más emparentados genéticamente (RDG: 0.8352 a 1) (Figura 2). Las características morfoagronómicas que reportan ^{Méndez et al. (2010)} para estos genotipos, se definen de la siguiente manera: para los grupos I y II, predominan plantas con entrenudos cortos, frutos alargados con bajo peso, cáscara delgada, poca semilla y pequeña. En el grupo III, prevalecen plantas con entrenudos largos, frutos redondos de peso intermedio, cáscara delgada, mucha semilla y pequeña.

Figura 2 Dendrograma general construido a partir de 1000 combinaciones de remuestreo, mediante el coeficiente de apareamiento simple (SM) de los productos amplificados de RAMP (OPA05, 10, 13 y 19) + (GATA)₄) para 46 genotipos partenocarpicos de calabaza.  

El grupo III y IV (ISSR y RAMP, respectivamente), no presentaron predominancia de algunas características morfológicas y agronómicas entre los genotipos. En este sentido, ^{Demey et al. (2008)}, demostraron que las caracterizaciones generadas por descriptores morfológicos de las hechas por marcadores moleculares, suelen ser independientes respondiendo en cada caso a reglas y presiones evolutivas diferentes.

Los grupos formados en RAMP presentaron mayor estabilidad que las agrupaciones que arrojo el análisis de los ISSR, además hubo mayor número de concordancias con las agrupaciones presentadas por ^{Méndez et al. (2010)}, por lo que las relaciones encontradas con los marcadores moleculares empleados en este trabajo indican la condición genética en la que se encuentran los genotipos de calabaza para su futuro uso en el mejoramiento y búsqueda de partenocarpia. Sin embargo, ^{Sánchez et al. (2000)}, mencionan que los estudios con marcadores moleculares no están asociados con diferenciación fenotípica y a la forma en la que se ha realizado el mejoramiento empírico y científico.

^{Demey et al. (2008)} en trabajos de maíz, han sugerido conjuntar información de diferente índole para análisis de diversidad pues permite analizar toda la variabilidad y obtener un análisis más preciso, mejor distribución y definición de la clasificación de las poblaciones y la resolución de los resultados es mejor.

Los resultados de la comparación entre matrices de distancias genéticas sin remuestreo y la matriz promedio de 1 000 remuestreos, tanto para ISSR como para RAMP fueron corroborados con la prueba de ^{Mantel (1967)}, misma que identificó correlación alta, positiva y significativa, para ambas técnicas moleculares (r= 0.999), con 99.9% de congruencia entre las distancias genéticas y las agrupaciones de los genotipos, al respecto ^{Beyene et al. (2005)}, mencionan que correlaciones significativas indican que los conjuntos de datos reflejan el mismo patrón de diversidad genética y validan el uso de estos datos para realizar análisis estadísticos de diferentes tipos, como conglomerados sobre diferentes poblaciones.