Material biológico

Se utilizaron cuatro cepas de F. mexicana: IE 974, IE 984, IE 985, IE 986 del Cepario del Instituto de Ecología (INECOL) de Xalapa, Veracruz, México; las cuales fueron obtenidas previamente; a partir, de cuerpos fructíferos de la región de alta montaña del Nevado de Toluca en el centro de México (^{Arana-Gabriel et al., 2014}; Arana-Gabriel., 2017). Las cepas fueron reaisladas en medio de agar croquetas (AC) (15 g de agar, 15 g de croquetas para perro Ganador^®, 2 g de extracto de levadura, 1 g de peptona de gelatina en un litro de agua destilada) (^{Stamets, 2000}; ^{Arana-Gabriel et al., 2014}) a 18 °C y caracterizadas con forme a ^{Cruz-Ulloa (1995)} y la clave de color ‘códigos de colores HTML’ (html-color-codes.info/).

Producción de inóculo sólido

Se preparó inóculo primario y secundario con granos de trigo. Para preparar el inóculo primario, los granos de trigo se limpiaron, lavaron e hidrataron por 24 h, posteriormente se hirvieron durante 10 min. Una vez escurridos y con una humedad de 70%, se prepararon 5 frascos con 200 g de granos por cada una de las cuatro cepas utilizadas, a las cuales se les adicionó cal [Ca(OH)2 ] (0.7 g de cal por frasco) dejando el pH del trigo en 8.5, posteriormente se sometieron a esterilización en autoclave a 121 °C/15 lb de presión durante una hora (^{Guzmán et al., 2013}). Una vez enfriados los frascos con trigo, se inocularon con tres fragmentos de 1 cm² de micelio de las cuatro cepas. Para el inóculo secundario, el trigo fue sometido al procedimiento anteriormente descrito, pero ahora se inoculó el grano con 5% del inóculo primario. Todos los tratamientos fueron incubados en obscuridad a 18 ºC hasta que el micelio invadiera al 100% los granos de trigo para poder inocular los diferentes sustratos.

Producción de inóculo líquido y caracterización miceliar

El inóculo líquido se preparó utilizando croquetas adicionadas con peptona y levadura (C-PL) (15 g de agar agar, 15 g de croquetas para perro Ganador®, 2 g de extracto de levadura, 1 g de peptona de gelatina en un litro de agua destilada) (^{Stamets, 2000}; ^{Arana-Gabriel et al., 2014}). El medio se esterilizó en autoclave a 121 °C/15 lb de presión durante quince minutos y se le agregó 0.05 g de Cloranfenicol (SIgma^®) como antibiótico.

Se prepararon muestras de 100 ml de medio de cultivo (C-PL) en matraces Erlenmeyer de 250 ml con cinco réplicas. Los medios se inocularon con 0.5 cm de diámetro de cada cepa y se incubaron en obscuridad durante 20 días a 18 °C y 120 rpm en baño de agua con agitación PolyScience^®.

Concluido el periodo de incubación, se midió el pH del medio y se caracterizó la biomasa tanto morfológicamente (forma y tamaño) como microscópicamente para tener reporte del comportamiento miceliar bajo condiciones de agitación. El color del micelio se reportó con la clave de color ‘códigos de colores HTML’ (html-color-codes.info/). Para la caracterización microscópica, se tomaron pequeñas muestras de micelio con las que se hicieron preparaciones temporales con rojo Congo al 10%, lo que permitió observar la presencia de fíbulas y descartar que el micelio producido estuviera contaminado. Asimismo, se midió el diámetro de las hifas a 100x (20 hifas por tratamiento) con la ayuda del programa Motic digital Microscope DMB3-223 (Motic China Group Co., Ltd., 2001-2004).

Posteriormente se filtró la biomasa, se lavó con agua destilada estéril para evitar que el medio de cultivo fuera un factor en la colonización de los sustratos y se homogenizó en un procesador de alimentos Magic Bullet Deluxe^® durante 10 s con 100 ml de agua destilada estéril (modificado de ^{Stamets, 2000}). De igual manera se cuantificó la biomasa seca; después del periodo de incubación, la biomasa se filtró, se lavó con agua destilada estéril y se puso a secar en estufa a 80 ºC por 24 h para su posterior pesado.

Evaluación del crecimiento miceliar en diferentes sustratos

Para determinar la eficiencia del inóculo líquido y sólido con las diferentes cepas y sustratos respecto al tiempo de colonización, densidad de micelio y porcentaje de contaminación, se utilizaron cuatro diferentes formulaciones para los sustratos: 1) aserrín de encino (Quercus sp.) 100% (AQ); 2) aserrín de jara (S. cinerarioides) 100% (ASC), 3) rastrojo de maíz (Zea mays) con aserrín de S. cinerarioides 50:50 (ASC+RM); y 4) rastrojo de maíz 100% (RM) (^{Arana-Gabriel, 2018}). Las diferentes combinaciones de sustrato se hidrataron al 70% (por cada kilogramo de sustrato se agregó 1.4 l de agua) y se les adicionó 0.1% de cal [Ca (OH)₂ ] y 0.1% de yeso (CaSO4). La mezcla debidamente homogenizada se colocó en tubos de ensayo (2.5 x 15 cm) a 12 cm del volumen del tubo (^{Carreño-Ruiz et al., 2014}) a partir de su base (equivalente a 20 g de peso húmedo). Se prepararon cinco tubos por tratamiento con un análisis factorial de: 4 x 4 x 2 x 5 (4 cepas x 4 sustratos x 2 tipos de inóculo x 5 réplicas).

Los tubos de ensayo con el sustrato se esterilizaron durante una hora a 121 °C y 15 lb de presión; posteriormente se inocularon con 5% (peso húmedo del sustrato) de inóculo secundario o 1 ml de inóculo líquido; se taparon con algodón estéril para permitir el intercambio gaseoso y se llevaron a incubación a 18 °C en condiciones de oscuridad hasta que el micelio invadió por completo los diferentes sustratos; realizando observaciones cada tercer día para monitorear el crecimiento miceliar. La velocidad de crecimiento (VC) en los diferentes sustratos se calculó dividiendo la longitud de sustrato (12 cm que tenían los sustratos en los tubos) entre el número de días que tardó el micelio en invadirlo (modificado de ^{Huerta et al., 2009}). Una vez que el sustrato fue cubierto por el micelio, la densidad de este se clasificó visualmente de acuerdo con ^{Shrestha et al. (2006)}, (-)= extremadamente escaso, (+)= escaso, (++)= moderado, (+++)= abundante.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el programa Statgraphics^® Centurion XVI (Statpoint Technologies, Inc., 2009), los datos de velocidad de crecimiento miceliar se sometieron a un análisis de varianza (Anova) para determinar si había o no diferencias entre cepas, sustratos y tipo de inóculo (sólido y líquido) y un análisis multivariado de varianza (Manova) para determinar si había interacción entre los sustratos y el tipo de inóculo que afectara la velocidad de crecimiento. Las diferencias significativas se determinaron con una prueba de rangos múltiples de Tukey (p≤ 0.05).

Obtención de cuerpos fructíferos

Una vez que todos los tratamientos presentaron 100% de colonización, se estimuló la producción de los cuerpos fructíferos, trasladando los tubos de ensayo a un cuarto con luz (100 lux), se les colocó algodón húmedo con agua destilada estéril en la parte superior del sustrato, el algodón se mantuvo húmedo y fue retirado al observar la aparición de primordios; a partir, de ese momento, se aplicaron dos riegos de agua por día.

Material biológico

Las cepas reaisladas IE 974 y IE 986 en medio AC tardaron 14 días en invadir la caja Petri de 9 cm y las cepas IE 984 y IE 985 lo hicieron en 16 días. Las cuatro cepas desarrollaron un crecimiento uniforme, aéreo de color blanco (#FFFFFF), con textura algodonosa, margen fimbrado y sin presencia de exudados. Microscópicamente, las hifas fueron lisas, ramificadas, septadas y con abundantes fíbulas.

Producción de inóculo sólido

Para la producción de inóculo primario, las semillas de trigo tardaron 20 días en presentar una colonización miceliar abundante (+++) de 100%. Con inóculo secundario el tiempo de colonización fue de 15 días (100% de grano invadido y micelio abundante), tiempo que se encuentra dentro del rango reportado para especies del género Pleurotus donde el crecimiento miceliar tarda de 20-26 días (^{Grison et al., 2008}). El tiempo de colonización y densidad del micelio se encuentra en función de la cepa, sustrato utilizado, pH, porcentaje de humedad y temperatura de incubación. En la producción de inóculo sólido, se podrían utilizar otro tipo de semilla o aserrín suplementados; sin embargo, su uso depende de la disponibilidad y los costos de cada región. En este caso, el trigo es uno de los granos con más disponibilidad en cuanto a producción y costos en el Estado de México; además es considerado un buen vehículo para la propagación del micelio; la humedad de 70% y pH de 8.5 son valores que se encuentran dentro de los rangos reportados para el crecimiento del micelio ya que facilitan la disponibilidad de nutrientes (^{Ríos et al., 2010}).

Producción de inóculo líquido y caracterización miceliar

La producción de biomasa de las cuatro cepas IE 974, IE 984, IE 985 y IE 986 en medio líquido C-PL fue, en promedio, de 7.9 g L^-1 después de 20 días de agitación. El micelio formó pellets globosos y de superficie fimbrosa con un tamaño de 1.5 a 3 cm de diámetro. Microscópicamente, las hifas fueron lisas con diámetro de 1.1-3.3 µm, ramificadas, septadas y con fíbulas abundantes y frecuentes. La morfología del micelio (filamentos libres o pellets) y el tamaño de los pellets dependen de la intensidad de agitación; en cuanto a la cantidad de biomasa producida depende de la especie, cepa, fuente de carbono del medio de cultivo, pH y oxígeno disuelto (^{Cui et al., 1997}; ^{Frieal y McLoughlin, 2000}; ^{Grison et al., 2008}; ^{Ma et al., 2016}). Por ejemplo, para Sparassis latifolia, que se ha llevado a obtención de biomasa en medio líquido, con una producción de 11.96 g L^-1 después de 15 días (^{Ma et al., 2016}) o para Pleurotus pulmonarius donde se obtuvo biomasa en tres días a partir de un biorreactor automatizado (^{Abdullah et al., 2013}).

Evaluación del crecimiemto miceliar en diferentes sustratos

La velocidad de colonización de los diferentes sustratos varió entre las cuatro cepas (F_3,159= 15.54, p≤ 0.0001), siendo la IE 974 y IE 986 las que colonizaron más rápidamente los sustratos de RM y ASC+RM (F_4,159= 5.09, p≤ 0.0007) con inóculo líquido (F_1,159= 8.72, p≤ 0.0036) (Cuadro 1). La cepa IE 974 presentó una velocidad de crecimiento miceliar de 0.71 cm día^-1, tardando un promedio de 17 días en invadir el sustrato de ASC+RM con una densidad abundante (Figura 1d) de micelio al igual que la IE 986 en RM y ASC+RM (Figura 1a).

Figura 1 Crecimiento miceliar de cuatro cepas de F. mexicana: a, e) IE 986; b, f) IE 985; c, g) IE 984; d, h) IE 974 en diferentes sustratos inóculados. Inóculo líquido (a-d); inóculo sólido (e-h). De izquierda a derecha los tubos de ensayo con los sustratos corresponden a RM (rastrojo de maíz); AQ (aserrín de Quercus sp.); ASC (Aserrín de S. cinerarioides) y ASC+RM (aserrín de S. cinerarioides y rastrojo de maíz).  

Por el contrario, el sustrato RM inoculado con inóculo sólido en las cuatro cepas presentó la menor velocidad de crecimiento, tardando en promedio hasta 50 días (0.24 cm día^-1) en colonizar 100% del sustrato; sin embargo, pese a la baja velocidad de crecimiento, la densidad miceliar fue abundante (Figura 1e-h). El sustrato AQ en tres de las cuatro cepas con inóculo sólido presentó densidad moderada, con la cepa IE 986, la densidad fue escasa y con inóculo líquido la densidad fue de moderada a abundante, a excepción de la cepa IE 984 donde fue extremadamente escasa, con un tiempo de colonización de 27-29 días (0.13-0.26 cm día^-1). El crecimiento miceliar fue más uniforme en los sustratos inoculados con inóculo líquido, al contrario de los sustratos con inóculo sólido que presentaron sitios que no fueron colonizados por completo (Cuadro 1, Figura 1).

En el Cuadro 1, se muestran las diferencias de velocidad de crecimiento entre los dos tipos de inóculo y diferentes sustratos de acuerdo con la prueba de rangos múltiples de Tukey. La cepa IE 984 fue la única que presentó la menor velocidad de crecimiento en los cuatro sustratos con inóculo líquido, y la densidad del micelio fue de extremadamente escaso a escaso (Figura 1c). De manera general, el inóculo sólido presentó velocidades de crecimiento menores que el inóculo líquido, lo cual también estuvo relacionado con el sustrato utilizado, presentando una interacción entre el tipo de inóculo y el sustrato que afecta la velocidad de crecimiento (F4,159= 18.94, p≤ 0.0001).

La rápida colonización de sustratos y maduración temprana del micelio con inóculo líquido también ha sido reportada para especies como L. edodes (^{Kawai et al., 1996}), Pleurotus ostreatoroseus (Rogéiro et al., 2002) y P. pulmonarius (^{Abdullah et al., 2013}). Esto se debe a que el inóculo líquido se utiliza directamente en el sustrato (^{Frieal y McLoughlin, 2000}; ^{Gregori et al., 2007}) aumentando el número de puntos de invasión donde se reinicia el crecimiento miceliar, comenzando a nutrirse directamente del sustrato. En el inóculo en trigo, por el contrario, disminuyen los puntos de invasión ya que se inicia por la parte superior de los tubos y en este caso, el micelio primero comenzó a nutrirse de la semilla retrasando así la colonización de los sustratos.

Inóculo líquido (a-d); inóculo sólido (e-h). De izquierda a derecha los tubos de ensayo con los sustratos corresponden a RM (rastrojo de maíz); AQ (aserrín de Quercus sp.); ASC (Aserrín de S. cinerarioides) y ASC+RM (aserrín de S. cinerarioides y rastrojo de maíz).

Otra desventaja de usar inóculo sólido, es que, cuando se utiliza continuamente un medio de cultivo con una fuente simple de hidratos de carbono, los hongos se vuelven menos eficientes en la colonización de sustratos y producción de cuerpos fructíferos, además de que no son viables metabólicamente (Rogéiro et al., 2002).

El uso de inóculo líquido en la presente investigación tuvo resultados favorables desde el inicio de la colonización de los sustratos al tercer día; al contrario de la inoculación con trigo que comenzó al quinto día, tendencia también reportada para L. edodes (^{Kawai et al., 1996}). Sin embargo, a pesar de la eficiencia en la colonización de los sustratos con inóculo líquido, ^{Ma et al. (2016)}; ^{Silveira et al. (2008)} reportan que no existen diferencias en la eficiencia biológica en la producción de cuerpos fructíferos entre diferentes tipos de inóculo.

El éxito en el uso de inóculo líquido, se relaciona con la eficiencia a la hora de transferirlo al sustrato, permitiendo una colonización rápida, lo que se traduce en una reducción en la duración del ciclo de producción. La distribución más uniforme del inóculo en el sustrato, proporciona un crecimiento homogéneo del micelio, lo cual disminuye los costos tanto de mano de obra como de materiales; así como la reducción considerable de problemas de contaminación por organismos antagonistas (^{Frieal y McLoughlin, 2000}; Rogéiro et al., 2002; ^{Abdullah et al., 2013}; ^{Ma et al., 2016}). La aparición de hongos antagonistas puede inhibir el crecimiento del micelio y reducir o anular la producción de las fructificaciones; lo que representa una de las necesidades fundamentales en la industria del cultivo de los hongos comestibles (^{Mata et al., 2011}).

La capacidad de los hongos para crecer en un sustrato no sólo está relacionada con el inóculo utilizado, sino también con el vigor de su micelio, la habilidad de las cepas para explotar adecuadamente los nutrientes del sustrato y tener mayor posibilidad de competir frente a los antagonistas, la producción de enzimas lignocelulolíticas, temperatura de incubación, así como el tamaño de partícula, composición química y pH de los sustratos (Staments 2000; Rogéiro et al., 2002; ^{Mata et al., 2011}).

Obtención de cuerpos fructíferos

Los primeros sustratos que formaron primordios fueron RM y RM+ASC con inóculo líquido de la cepa IE 986 después de 5 días de haber inducido la formación de fructificaciones (Figura 2), el resto de los tratamientos tardó de 7 a 10 días, a excepción de los cuatro sustratos inoculados con inóculo líquido de IE 984 y el sustrato AQ tanto con inóculo líquido como sólido en las cuatro cepas donde no hubo formación de primordios.

Figura 2 Primordios de F. mexicana.  

Los primordios formados presentaron crecimiento cespitoso, los píleos fueron pequeños de color amarillo (#F2F5A9) con estípites largos, lisos de color amarillo (#F2F5A9, #F7D358) con tonalidad más clara cerca del píleo (Figura 2). La aparición de los cuerpos fructíferos es un indicativo de que las cepas y los sustratos utilizados son viables. La aparición de las fructificaciones en un periodo de tiempo más corto con inóculo líquido también han sido reportadas para L. edodes (^{Kawai et al., 1996}) quienes mencionan que la aparición temprana de primordios es un fenómeno hereditario, que podría ser inducido con el inóculo líquido y retrasado en el sólido. Los usos de inóculo líquido junto con el método utilizado en el estudio para la inducción de fructificaciones pueden utilizarse para probar a pequeña escala la viabilidad de las cepas, sustratos y condiciones ambientales que permitan el cultivo de hongos, antes de ser llevados a nivel de invernadero.

A pesar que, en la presente investigación, la producción de biomasa en medio líquido se llevó a cabo en sistema en Bach, este procedimiento puede ser escalado a nivel de biorreactor para su optimización y automatización; lo que permitiría aumentar la biomasa producida y reducir considerablemente la producción inóculo y el ciclo de cultivo. Por otra parte, el uso de germoplasma nativo puede diversificar las especies cultivadas comestibles y con propiedades funcionales, así como trabajar con especies de importancia cultural en cada región y utilizar los sustratos disponibles y aptos para su cultivo (^{Morales et al., 2010}).