El tomate es el principal producto agroalimentario de exportación en México, su producción en el año 2013, fue de 3.2 millones de t (^{SIAP, 2017}). En la temporada 2013-2014 se cultivaron en Sinaloa 47 136 ha de hortalizas, produciendo alrededor de 1 millón de t de tomate, exportándose de ese total 313 914 t con un valor de 303.2 millones de dólares (^{CIDH, 2014}). Las especies de nematodos del género Meloidogyne constituyen uno de los fitopatógenos más nocivos del cultivo del tomate a nivel mundial, ya que dañan severamente el sistema radicular del cultivo. Meloidogyne se distingue de otros géneros por tener un amplio rango de hospedantes, esto ha hecho que sea catalogado como el género de nematodos fitoparásitos de mayor importancia económica en el mundo (^{Salazar-Antón y Guzmán-Hernández, 2013}).

En México, Meloidogyne spp., es el género de nematodos fitoparásitos más importante que ataca al cultivo de tomate, debido al porcentaje de pérdidas que ocasiona y en diferentes estados productores se reporta la presencia de cuatro especies: M. incognita, M. arenaria, M. javanica y M. hapla (^{Carrillo et al., 2000}; ^{Cid del Prado et al., 2001}); sin embargo, en la temporada 2012-2013, ^{Martínez et al. (2015)}, realizaron el primer reporte de la presencia de la especie M. enterolobii atacando plantas de tomate portadoras del gen Mi (altamente resistentes a M. incognita, M. javanica y M. arenaria) en condiciones de cultivo bajo malla sombra en Culiacán, Sinaloa. Entre los reportes de ^{Carrillo et al. (2000)}; ^{Cid del Prado et al. (2001)}; ^{Martínez et al. (2015)}, utilizaron como herramienta de biología molecular la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ya que ha proporcionado un enfoque alternativo y sensible para la detección e identificación de nematodos agalladores y muchos organismos patógenos presentes en el suelo que antes se dificultaba su identificación (^{Hu et al., 2011}).

Los objetivos del presente estudio fueron identificar morfológicamente y molecularmente a Meloidogyne spp., así como conocer su distribución en el cultivo de tomate, en Sinaloa, México.

El muestreo se realizó durante la etapa reproductiva de 160 lotes cultivados con tomate, en condiciones de campo abierto, malla sombra e invernadero en cuatro de las principales zonas de producción de Sinaloa: (Los Mochis, Culiacán, La Cruz de Elota y Escuinapa), durante los ciclos agrícolas 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016 y 2016-2017, cada punto de muestreo se georreferenció (Cuadro 1).

La toma de muestra de suelo se realizó entre los 5 y 30 cm de profundidad, cercano a la zona de crecimiento radical (rizósfera) de las plantas, debido a que es donde se encuentra la mayor densidad poblacional de nematodos fitoparásitos. También se incluyó la colecta de raíces agalladas para su respectivo análisis. Cada muestra de suelo estuvo constituida por 2 kg (8 a 10 submuestras) y 5 raíces agalladas (tomadas completamente al azar), se etiquetaron y se almacenó a 4 °C hasta la extracción de nematodos.

Las muestras compuestas de suelo y raíces de cada muestreo, se analizaron en el laboratorio de nematología del CIAD, Culiacán. La identificación de los especímenes se realizó con base en sus características morfológicas (región cefálica, tipo de estilete, tipo de nódulos basales y la distancia de la desembocadura de la glándula esofágica dorsal [DGED]) y patrones perineales de las hembras, apoyándose con claves taxonómicas de ^{Eisenback et al. (1981)}; ^{EPPO (2011)}.

Para la confirmación de la identidad de Meloidogyne a nivel especie, las raíces agalladas se lavaron con agua destilada para remover el suelo, se seleccionaron agallas individuales, de donde se extrajeron 50 hembras con una aguja de disección y se depositaron en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL, posteriormente, se añadió una alícuota de 45 μL de buffer de lisis (NaOH 50mM), se sometió a lisis por calor a 95 °C por 10 min, se agregó una alícuota de 45 μL de Tris-HCl (pH 8) y se centrifugó por 3 min a 10 000 rpm (^{Hu et al., 2011}), se recuperó el sobrenadante, para proceder con la PCR utilizando los iniciadores específicos Me-F y Me-R (Meloidogyne enterolobii), F-jav y R-jav (Meloidogyne javanica), Ma-F y Ma-R (Meloidogyne arenaria), Mi-F y Mi-R (Meloidogyne incognita), Mha-F y Mha-R (Meloidogyne hapla), que codifican para la región 28S ARNr (Cuadro 2) (^{Hu et al., 2011}).

Las reacciones de PCR se realizaron utilizando el sistema de PCR core Systems 1 (Promega). El volumen total de la mezcla de reacción fue de 25 μL para todas las reacciones. El contenido de la mezcla de reacción fue: 10 ng de ADN genómico, 5 μL de buffer de PCR 10x, 3 μL de MgCl₂ (25 mM), 0.5 μL de cada dNTP (10mM), 1 μL de cada iniciador, 0.2 μL de Taq polimerasa (5u µL^-1) y el resto de agua nanopura estéril. La amplificación del ADN se llevó a cabo en un termociclador (BIO-RAD T100), bajo las siguientes condiciones de amplificación: 94 °C por 2 min, 35 ciclos de 94 °C por 30 s, 64 °C por 30 s, 68 °C por 1 min, seguidos de una extensión final a 72 °C por 5 min.

Una alícuota del producto de PCR se visualizó, en un gel de agarosa al 1%, teñido con 1 µL de bromuro de etidio (10 mg mL^-1), en un transiluminador (Benchtop UV). Se consideró como respuesta positiva una banda visible de ±250 pb. (M. enterolobii), ±750 pb. (M. javanica), ±950 pb. (M. arenaria), ±1 000 pb. (M. incognita) y ±1 500 pb. (M. hapla).

Del total de poblaciones obtenidas, al analizar su caracterización morfológica, morfométrica y molecular, se registró una frecuencia de 88% para M. enterolobii, 10% para M. incognita y 2% para M. arenaria (Figura 1).

Figura 1 Porcentaje poblacional de especies de Meloidogyne en el cultivo de tomate en Sinaloa 

De acuerdo a lo reportado por ^{EPPO (2011)}; ^{Ramírez-Suárez et al. (2014}; ²⁰¹⁶⁾, Cuaen consideración los patrones perineales de las hembras colectadas en la presente investigación, las características de la región cefálica, tipo de estilete, tipo de nódulos basales y la distancia de la DGED las muestras se identificaron como M. enterolobii: hembras anilladas con campos laterales blancos y de forma piriforme, de tamaño variable, la relación entre la distancia de la cabeza al poro excretor corta, ubicándose a nivel del metacorpus.

Estilete robusto y los patrones perineales fueron de ovoides a redondeados, con el arco moderadamente alto y redondeado. M. incognita presentó dos anillos en la región cefálica anillada y la parte anterior del estilete en forma de ‘remo’ con punta roma, nódulos basales redondeados y la distancia de la base de los nódulos a la DGED muy corta (1.8-3.3 µm), además en los cortes perineales presentaron el arco dorsal alto formado por estrías que variaron de lisas a onduladas, sin líneas laterales claramente visibles. M. arenaria tuvo la característica de tres anillos en la región cefálica y la DGED larga (3.2-4.9 µm); además, en los modelos perineales mostró presencia del arco dorsal con ‘hombreras’, formadas por ondulaciones pronunciadas de las estrías dorsales (Figura 2).

Figura 2 Patrones perineales de: A) M. incognita, B) M. arenaria y C) M. enterolobii, obtenido de hembras de raíces de cultivo de tomate de Sinaloa 

La PCR amplificó fragmentos de ± 250 pb. (M. enterolobii), ± 950 pb. (M. arenaria) y ±1 000 pb. (M. incognita) respectivamente, lo que confirma los resultados obtenidos por morfología y biología molecular.

La especie M. enterolobii se identificó en las cuatro zonas de producción de Sinaloa, mientras que M. arenaria se presentó en Los Mochis, La Cruz de Elota y Escuinapa, y M. incognita sólo se encontró en las zonas de Culiacán y La Cruz de Elota (Figura 3).

Figura 3 Distribución de especies de Meloidogyne en cultivo de tomate en Sinaloa 

En cinco lotes de muestreo (3% de las muestras) se encontraron especies mezcladas, en una se presentó M. enterolobii y M. incognita y en cuatro se encontró la mezcla poblacional de M. arenaria y M. enterolobii.

Los resultados de la identificación de las especies de Meloidogyne y su relación con la georreferenciación, coinciden con los reportes de otros investigadores (^{Castro et al., 1990}; ^{Cid del Prado et al., 1998}; ^{Carrillo et al., 2000}; ^{Cid del Prado et al., 2001}; ^{Martínez et al., 2015}), ya que reportan que los intervalos de distribución se rigen con base en los rangos de variación de cada una de las especies.

El presente estudio contribuye al conocimiento de la distribución actual de Meloidogyne spp., en Sinaloa y se considera una base para futuras herramientas de control.