Manejo de los insectos

Durante el año 2013, huevos, pupas y adultos de C. carnea fueron proporcionados por el CREROB. Después de recibirlos, huevos y pupas fueron fumigados como se indicará, mientras que a los adultos se les proporcionaron antimicrobianos en el agua que bebieron. Después de la fumigación los huevos fueron incubados a 28 ºC y al eclosionar las larvas fueron alimentadas con huevos de Sitotroga cerealella Olivier, proporcionado por el CREROB. Las pupas fueron incubadas a 28 ºC hasta obtener el adulto a temperatura de laboratorio (20-25 ºC).

Los adultos fueron alimentados con una mezcla de azúcar sin refinar, leche en polvo (Nido^®) y levadura seca de cerveza (Industrial Rosanco^®) en proporción 2:1:1 p/p/p, preparada con agua destilada y calentándola hasta tener la consistencia de una jalea. La jalea fue almacenada durante 15 días a 0 ºC. Los adultos fueron alimentados con jalea, sobre abate-lenguas esterilizados (renovados cada tercer día) o sobre las paredes de las celdas de confinamiento. A los adultos, se les proporcionó en el agua destilada estéril los antimicrobianos en la cabeza de hisopos estériles, remplazándolos cada tercer día, el testigo solo el agua.

Aislamiento e identificación de Bacillus thuringiensis

Los adultos de C. carnea fueron esterilizados superficialmente con hipoclorito de sodio al 1% y macerados en condiciones de esterilidad para posteriormente recuperar el macerado en agua estéril. Para observar la formación de los cuerpos paraesporales en microscopio óptico, se crecieron las bacterias en medio nutritivo hasta inducir la esporulación. Después de tres días de crecimiento se recuperaron las esporas y los cristales y se analizaron en un gel SDS-PAGE. Este macerado fue sembrado en placas Petri conteniendo medio Luria-Bertani sólido.

Las placas fueron incubadas a 30 ºC durante 24 h y fueron identificadas diferentes bacterias, entre estas fueron seleccionadas y purificadas dos aislados denominados Cc1 y Cc2 que presentaron la morfología típica de bacterias pertenecientes a B. thuringiensis. Para comprobar que estas corresponden a dicha especie se analizó la amplificación por PCR del gene 16S ribosomal utilizando oligonucleótidos específicos diseñados por (^{Aguino de Muro y Priest, 1993}).

Para identificar ambos aislados, se hicieron crecer durante 12 horas en una placa de medio nutritivo (Difco). Un pequeño volumen de células fue transferido a 0.1 ml de H₂O y congelado a -70 °C durante 20 min para después ser incubadas en agua hirviendo durante 10 min para lisar las células. El lisado celular resultante se centrifugó brevemente (10 s a 10 000 rpm en una centrífuga Eppendorf modelo 5415C) y 15 µl de sobrenadante fue utilizado como muestra de ADN en la PCR.

La amplificación se hizo en un termociclador Perkin-Elmer modelo 480. Las condiciones de las PCR hechas con oligonucleótidos cry1 (gral-cry1) fueron las siguientes: una sola etapa de desnaturalización de 2 min a 95 °C, seguido de un programa de 30 ciclos en donde cada ciclo consta de desnaturalización a 95 °C durante un min, hibridación a 52 °C durante 1 min y extensión a 72 °C durante un min. Al final de 30 ciclos se realizó un paso adicional de extensión a 72 °C durante 5 min.

Las condiciones para las PCR realizadas con los otros oligonucleótidos fueron similares, excepto que se modificaron las temperaturas de hibridación a 49 °C para oligonucleótidos de cry8, a 51 °C para oligonucleótidos de cry9, cry11 y cyt1 y a 50 °C para el resto de los oligonucleótidos. Una vez realizada la reacción de amplificación, se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 2% en tampón Tris-borato (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA (pH 8) a 250 V por 35 min y se tiñeron con bromuro de etidio. Finalmente, con la intención de identificar a estas proteínas se realizó un análisis de posibles genes cry presentes en estas cepas utilizando una batería de oligonucleótidos (^{Cerón et al., 1995}; ^{Bravo et al., 1998}). Estos oligonucleótidos permiten identificar a genes cry1, cry3, cry5, cry7, cry8, cry9, cry11, cry13, cry14 y cyt1A.

Bioensayos de patogenicidad en otras especies

Las actividades de las diferentes cepas de B. thuringiensis se analizaron en larvas neonatas de Spodoptera frugiperda y Diatraea magnifactella (Insecta: Lepidoptera). Diluciones de las suspensiones de esporas-cristales se aplicaron sobre la superficie de la dieta a una concentración final de 100 y 1 000 ng cm^-2 (^{Bravo et al., 1998}). La mortalidad se registró después de siete días.

Bioensayos de fumigación en huevo

Frascos de vidrio de 250 ml fueron utilizados para poner en el fondo ácido acético como fumigante, dentro de este frasco fue colocado un frasco de 25 ml en donde fueron colocados los huevos de C. carnea. Las dosis y tiempos de fumigación de los huevos fueron de 0 (testigo) 0.04 y 0.4 µl ml^-1 ácido-aire durante 8, 16, 24 y 48 h, respectivamente. En total, cuatro repeticiones fueron utilizadas para cada dosis y tiempo, cada repetición fue conformada por 50 huevos. Posterior a la fumigación, los huevos fueron colocados de manera individual en celdas de alrededor de un cm³, en donde al eclosionar las larvas se alimentaron con huevos de S. cerealella.

Las pupas formadas fueron colocadas en celdas de confinamiento individuales de tres cm³, donde previamente se impregnó la jalea sobre las paredes para alimentar a los adultos que emergieron, suministrándoles también agua estéril e incubándose a temperatura de laboratorio (20-25 °C) durante 35 días. El recuento de adultos vivos sin síntomas y muertos con síntomas se realizó semanalmente y diariamente se retiraron los adultos muertos para evitar en lo posible la diseminación de la infección. Este y posteriores experimentos fueron repetidos dos veces. Otro experimento se realizó de manera idéntica, excepto porque a las larvas se les proporcionó huevos de S. cerealella esterilizados con calor.

Bioensayos de fumigación en pupas

Las pupas fueron fumigadas con ácido acético a dosis de 0 (testigo), 0.04. 0.4 y 4 µl ml^-1 ácido-aire a tiempos de fumigación de 10, 20, 30, 60 y 120 min. Enseguida, fueron confinadas en vasos de poliuretano de un litro, y los adultos emergidos fueron mantenidos por dos semanas a temperatura de laboratorio (20-25 °C), tiempo en el que se contabilizó adultos muertos con síntomas de la enfermedad y adultos sin síntomas. Los adultos fueron alimentados con la jalea en los abate-lenguas y el suministro de agua en los hisopos. Las pupas y adultos muertos fueron retirados diariamente. En total, cuatro repeticiones por cada dosis y tiempo de fumigación de las pupas fueron realizadas, cada repetición con 15 pupas.

Bioensayos con antimicrobianos en adultos

En el CREROB, se nos proporcionaron diez unidades cada una con 700-800 celdas ocupadas por pupas, de donde se esperaba obtener por lo menos 4 200 adultos, para evaluar seis antimicrobianos por tres dosis cada uno (un testigo) con cuatro repeticiones. De las unidades, solo se recobraron 530 pupas de donde nacerían los adultos. Con las pupas disponibles, se establecieron 21 tratamientos con (25 pupas) sin repeticiones, seis sustancias antimicrobianas con tres dosis y el testigo sin antimicrobiano. Después se desechar los adultos muertos en los primeros dos días, los tratamientos contaron con distinto número de adultos (Cuadro 1).

Los productos antimicrobianos de tipo comercial que se utilizaron fueronamikacina Amk^® ampicilina Binotal^®; cefotaxima Biosint^®, eritromicina Ilosone^®, metronidasol Flagelase^®, vancomicina Vancocin^® además del testigo.

Las pupas y los adultos emergidos se confinaron en vasos de poliuretano de 2 L, diariamente se retiraron adultos muertos cuando los hubo. A las crisopas se les proporcionó el alimento en abate-lenguas con la jalea, mientras los antimicrobianos en el agua que retenían los hisopos. Los insectos se transfirieron temporalmente a otro vaso, mientras que el vaso de origen se limpió utilizando algodón embebido con una solución de cloro comercial al 0.3%. La primera limpieza se realizó siete días después de haber emergido los adultos, las subsecuentes cada cinco días.

Análisis de datos

Los datos de adultos obtenidos de los experimentos de las fumigaciones de huevos se analizaron por la prueba de chi cuadrada (ꭓ²). El experimento con pupas se analizó con un diseño completamente al azar, un arreglo factorial y con el procedimiento GLM, en donde el tiempo de fumigación y la dosis fueron los factores; cada análisis se realizó por separado para los tiempos de incubación de 7 y 14 d. El experimento de adultos tratados con antimicrobianos no se analizó estadísticamente debido a la falta de repeticiones.

De los insectos adultos que provenían de los huevos fumigados, se establecieron sus coeficientes de determinación lineal R² y sus pendientes, ello para su supervivencia versus tiempo de incubación. También se obtuvo R² entre las pendientes obtenidas para cada tratamiento (en cada experimento) incluyendo los testigos versus número inicial de insectos adultos. Todos los análisis se realizaron con el Sistema de Análisis Estadístico (^{SAS versión 9.1, 2003}).

Sintomatología de la enfermedad

Los adultos de C. carnea infectados ralentizan su movimiento, su tórax se torna oscuro, posteriormente también todo el tracto digestivo; el insecto no ingiere alimento y adelgaza hasta morir (Figura 1 A y B), cuando ello ocurre, la descomposición del insecto genera un olor fétido. Pupas y larvas también se tornan oscuras y mueren (Figura 1C y 1D).

Figura 1 A-D) signos de infección en Chrysoperla carnea. A) adulto con tórax oscurecido y abdomen ceñido; B) adulto con abdomen muy oscurecido; C) pupas con producto muerto y oscurecido; y D) larva muerta y oscurecida.  

Aislamiento e identificación de Bacillus thuringiensis

Las colonias bacterianas aisladas fueron de color blanco, opaco, estrellada y plana. El producto de PCR obtenido mostró el tamaño (dato no mostrado) propio del grupo de Bacillus spp. También se observaron los cuerpos paraesporales, característica única de B. thuringiensis (donde las proteínas Cry o Cyt se acumulan).

La Figura 2, muestra que la cepa Cc1 produce una proteína de 150 kDa y la cepa Cc2 presenta un cristal muy pequeño, por lo que es difícil identificar la banda del cristal en el gel SDS-PAGE, notando solamente que presenta una proteína de 65 kDa que asemeja el peso de otras proteínas Cry reportadas en B. thuringiensis. La cepa Cc2 presento amplificación con los oligonucleótidos del gene cry3. Sin embargo, no se observó una proteína de peso similar a lo observado con la cepa control que expresa Cry3Aa. La cepa Cc1 no amplificó con ninguno de estos oligonucleótidos. Estos datos sugieren que estas cepas podrían contener genes diferentes a los analizados por medio de estos ensayos de PCR o podrían contener un posible gen cry nuevo.

Figura 2 Gel de SDS-PAGE que muestra un peso molecular diferente de las proteínas formadoras de cristales en las cepas Cc1 y Cc2 con respecto a las proteínas Cry3A de B. thuringiensis. 

Bioensayos de patogenicidad en otras especies

La toxicidad de las cepas de Bacillus spp. incluyendo a dos cepas de B. thuringiensis probada contra S. frugiperda y D. magnifactella mostraron que no son toxicas para estas especies de insectos, si bien, la toxicidad de las cepas de B. thuringiensis no se ensayaron contra larvas y adultos de C. carnea.

Bioensayos de fumigación en huevo

En el primero y segundo experimentos, los tratamientos testigo sin fumigar y fumigados se recobraron 19, 17 y 8, 8% de adultos, respectivamente (Figura 3 izquierda). Las diferencias entre los tratamientos fueron significativas (ꭓ²= 74.6, gl= 8, p< 0.001) para el primer experimento y (ꭓ²= 109.6, gl= 8, p< 0.001) para el segundo experimento. Después de cinco semanas, la supervivencia de los adultos que provenían de huevos fumigados fue el doble que el testigo huevos no fumigados (Figura 3 derecha) en el primer experimento (ꭓ²= 36.9, gl= 9, p≤ 0.001) y (ꭓ²= 26.6, gl= 9, p≤ 0.001) en el segundo.

Figura 3 Sobrevivencia de adultos vivos y muertos de C. carnea. Izquierda, adultos vivos o muertos que provenían de 1600 huevos fumigados o de 200 huevos no fumigados testigo en dos experimentos. Derecha, adultos vivos o muertos después de cinco semanas de incubación. 

Para cada curva (lineal) de supervivencia versus número inicial de adultos sanos, se obtuvieron sus pendientes, R² y su bondad de ajuste (Cuadro 2), ahí se observa que en ambos experimentos el tratamiento huevo fumigado con 0.4 µl ml^-1 ácido-aire por 16 h no fue significativa la bondad de ajuste de sus pendientes; el resto de los tratamientos y testigo fueron significativos.

Con relación a las R² obtenidas entre el número inicial de adultos de C. carnea versus su pendiente de supervivencia para ambos experimentos, el tratamiento 0.04 µl ml^-1 ácido-aire por 8 horas (del segundo experimento) tuvo la pendiente más acentuada (-1.033) seguidas de los tratamientos testigo -0.833 y -0.988 del primer y segundo experimento, respectivamente (Cuadro 2 y Figura 4). En los dos experimentos, en los que se les proporción a las larvas como alimento huevos esterilizados con calor de S. cerealella, no llegaron a formar ninguna pupa.

Figura 4 Coeficientes de determinación entre el número inicial de adultos de C. carnea y su pendiente de supervivencia. Los cuadrados abierto y cerrado indican los tratamientos testigo o no fumigado del primer y segundo experimento, respectivamente; los círculos abiertos y cerrados representan los tratamientos de fumigación del primer y segundo experimento, respectivamente.  

Bioensayos de fumigación en pupas

El tiempo y dosis de fumigación fueron significativos p≤ 0.001, esto ocurrió para las pupas que permanecieron 7 ó 14 días, conforme se incrementaron el tiempo y dosis de fumigación de las pupas su formación de adultos disminuyó.

Los adultos formados después de fumigar las pupas no fueron acordes con las dosis y tiempos de fumigación, por ejemplo, en los tiempos de incubación 7 ó 14 días, 30 min de fumigación y dosis de 4 µl ml^-1 ácido-aire no se generaron adultos, pero sí en tiempos de fumigación menores o mayores a 30 min (Cuadro 3). La supervivencia de pupas fumigadas que se reflejó en la emergencia de adultos sugiere que el ácido acético no atraviesa la capa externa de la pupa, pues sí lo hiciese la mataría o desinfectaría.

Bioensayos con antimicrobianos en adultos

Únicamente el tratamiento de cefotaxima a dosis de 1 200 µg ml^-1 permitió que todos los adultos sobrevivieran hasta el día 51. Los 267 adultos sin síntomas al inicio de la aplicación de las sustancias antimicrobianas, representa menos del 5% de pupas que formaron adultos. En contraste, del número inicial (267) de adultos tratados con sustancias antimicrobianas incluyendo al testigo sobrevivieron 183, después de 51 días, es decir, alrededor de 69%, aunque en los tratamientos con eritromicina y metronidasol sobrevivieron 80%.

Fumigación del huevo

La fumigación con ácido acético ha resultado matar microorganismos patógenos de abejas e insectos plaga (^{Van Engelsdorp et al., 2008}; ^{Randall et al., 2011}). Aunque la fumigación de los huevos de crisopa mejoró la supervivencia no fue suficiente para eliminar por completo la infección, ya que no sobrevivió 100% de los adultos.

El agente infeccioso de C. carnea se manifestó en larvas, pupas y adultos. Comúnmente, las toxinas de B. thuringiensis o la bacteria misma infecta solo estados larvarios de los insectos provocando su muerte de 2 a 5 y de 7 a 10 días, respectivamente (^{Broderick et al., 2006}).

De los huevos no fumigados nacieron el doble de adultos que de huevos fumigados (Figura 3 izquierda) lo que sugiere que la fumigación favorece la mortandad de los huevos y al mismo tiempo una selección de adultos que sobrevivirán más tiempo y en proporción (Figura 3 derecha). Sin embargo, a mayor número inicial de adultos que se confinaron en celdas individuales las tasas de mortandad fueron más acentuadas (Cuadro 2 y Figura 4).

Una posible causa de la infección que explique la muerte de las crisopas que permanecieron en celdas individuales después de dos semanas, pudo ser el alimento contenido en las celdas, en donde el posible agente infeccioso pudo reproducirse y reinfectar los adultos. Considérese que dicho alimento, no fue sustituido durante las cinco semanas en que los insectos adultos permanecieron bajo observación.

El alimento pudo favorecer el desarrollo de microrganismos relacionados directa o indirectamente con la infección y muerte de las crisopas. Esto lo sugiere la supervivencia casi de 100% de los adultos a los 16 días en 18 de 21 tratamientos donde se evaluaron los antimicrobianos (datos no mostrados) y donde hubo recambio de alimento y asepsia de los vasos donde permanecieron las crisopas. Aunque en este trabajo, no se puede atribuir la presencia de B. thuringiensis como causa de la infección de los adultos u otro estadio de C. carnea, se sabe que esta bacteria por sí sola o en presencia de bacterias entéricas puede matar larvas de crisopas (^{Broderick et al., 2009}; ^{Johnston y Crickmore, 2009}).

Dentro de huevos, larvas y adultos de insectos incluyendo Chrysoperla spp., habitan levaduras, bacterias que les ayudan a digerir su alimento (^{Chen et al., 2006}), complementan su dieta o deficiencias nutricionales (^{Gibson y Hunter, 2005}; ^{Ben-Yosef et al., 2010}). En suma, existen por lo menos diez factores extrínsecos que afectan la relación selectividad y dosis-respuesta de las toxinas de B. thuringiensis hacia insectos, tales como sus microbiotas, factores nutricionales, respuesta inmunológica, entre otros (^{Lawo et al., 2010}; ^{Then, 2010}; ^{Grenier, 2012}). Los huevos de S. cerealella utilizados para alimentar a las larvas que provenían de los huevos fumigados podrían también albergar inóculo infeccioso o microorganismos que favorecieran la infección.

En este trabajo, se intentó eliminar la infección potencial al esterilizar los huevos de S. cerealella para alimentar las larvas de C. carnea, pero éstas no sobrevivieron con este alimento. Resultados obtenidos por ^{Fletcher (2016)} muestran que larvas de C. carnea se infectaron y murieron al alimentarse con huevos del insecto Adalia bipunctata L. infectados con el patógeno Nosema adaliae Steele & Bjørnson. Las crisopas también pueden infectarse y morir al estar en contacto con bacterias, por ejemplo, Chrysoperla externa Hagen murió por bacterias aisladas de Phyllocnistis citrella Stainton (presas de la crisopa) (^{Meca et al., 2009}), mientras que C. carnea murió por bacterias patógenas de humanos Pseudomonas aureoginosa y P. putida (^{Fernández et al., 2015}).

Fumigación de pupas

Algunas pupas que se fumigaron hasta dos horas, que fue el tiempo máximo y a la dosis de 4 µl ml^-1 ácido-aire sobrevivieron, lo que sugiere que algunas toleran la fumigación. En contraste, la marcada variación de emergencia y sobrevivencia de las crisopas provenientes de las pupas expuestas a distintas dosis-tiempo de fumigante sugiere que tuvieron un marcado deterioro y/o muerte antes de aplicar los tratamientos (Cuadro 3).

La trasmisión vertical (adulto→huevo→larva→pupa→adulto) de microorganismos benéficos o perjudiciales de las especies de Chrysoperla es conocida (^{Sung-Oui et al., 2004}; ^{Hemalatha, 2015}), ello podría explicar la trasmisión del agente infeccioso con la subsecuente mortandad de huevo, pupas, larvas y adultos.

Aplicación de sustancias antimicrobianas en adultos

La asepsia y la eliminación de crisopas que murieron los dos primeros días durante los tratamientos de sustancias antimicrobianas, posiblemente permitieron mantener C. carnea con los mayores porcentajes de supervivencia que en los experimentos anteriores. Incluso en el tratamiento con 1 200 µg ml^-1 de cefotaxima la muerte de adultos o síntomas de la infección no se manifestaron. Los antibióticos se han utilizado para eliminar las bacterias y al mismo tiempo, determinar su papel incluyendo las bacterias endosimbióticas en los insectos; las dosis utilizadas que afectaron a los insectos fueron desde 10 µg ml^-1 hasta 5 mg ml^-1 (^{Broderick et al., 2006}; ^{Ben-Yosef et al., 2010}; ^{Lin et al., 2015}).

Insectos entomófagos como Chrysoperla spp., tienen efectos negativos en su ciclo de vida cuando se alimentan de sus presas si estas últimas se han alimentado de cultivos transgénicos que expresan toxinas de B. thuringiensis (^{Hilbeck et al., 1998}; ^{Dutton et al., 2003}). En contraste, otros trabajos indican que Chrysoperla no es afectada al depredar presas que han consumido plantas transgénicas (^{Tian et al., 2013}; ^{Carvalho et al., 2012}; ^{Meissle et al., 2014}) por ello, no está del todo claro el papel de B. thuringiensis sobre las crisopas.

Tampoco sabemos el papel de B. thuringiensis encontrado dentro de adultos muertos de C. carnea, pero el saberlo, podría ayudar a esclarecer sí la bacteria podría ser patógena o no sobre estos insectos desde huevo hasta adulto. La tolerancia de los huevos y pupas a la fumigación con AA y la de los adultos a los antimicrobianos, podría evaluarse en el futuro para eliminar organismos no deseables en la producción masiva de insectos benéficos distintos a la crisopa.

Nuestro desconocimiento cuantitativo de la infección y su falta de control en huevo, pupa y adulto generó una inconsistencia dosis-tiempos de fumigación y dosis de antimicrobianos versus sobrevivencia de adultos.