Preparación de los medios de cultivo

Para el aislamiento y caracterización de los aislados se utilizaron los medios de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA), agua-agar (AA), café-dextrosa-agar (CDA), zanahoria-agar (ZA) y spezieller-nährstoffarmer-agar (SNA) recomendados por ^{Leslie y Summerell (2006)} para el análisis y caracterización del género Fusarium y por ^{Beever (1969)} modificado por ^{Christen y Raimbault (1991)}, que es un medio de fermentación líquida-agar (FLA) para Ceratocystis fimbriata ( ^{Palma-Sandoval, 1993}).

Obtención de aislamientos

Se siguieron las técnicas fitopatológicas descritas por ^{Trigiano et al. (2004)}; ^{Agrios (2005)}, se sembraron las muestras en medio de cultivo ½X PDA e incubaron a 28 °C en obscuridad, puntas de hifa. Para la identificación mediante preparaciones fijas se comparó morfológica con las claves de ^{Barnett y Hunter (1998)}; ^{Leslie y Summerell (2006)}. Se realizaron cultivos monospóricos y almacenaron en glicerol 25% estéril a -70 °C para su uso.

Caracterización cultural y morfológica de los aislados de Fusarium

La caracterización cultural se realizó en medio 1XPDA. Se inocularon 20 μL de la suspensión de conidios en glicerol 25%. Se registraron las características de tipo y espesor del micelio, color de la colonia (anverso y reverso), pigmentación del agar, presencia y color del esporodoquio, presencia de clamidosporas, así como la posible presencia de hifas enrolladas a los 15, 30 y 60 días.

La caracterización morfológica fue en medio CLA, se inocularon 5 μL de la suspensión, a los 10 días se midió el largo y ancho de 50 macroconidios y 50 microconidios de cada aislamiento, se determinó en los macroconidios la forma, tipo de pie y célula apical, así como el número de septos y presencia de esporodoquios, de los microconidios se determinó la forma, disposición y tipo de fiálide, junto con la presencia y disposición de clamidosporas e hifas enrolladas de ser posible.

Tasa de crecimiento

Se inocularon 5 μL de la suspensión en medio SNA sin papel, que se incubaron por 7 días a 25 °C en oscuridad. De la colonia se transfirió un disco de 6 mm de diámetro al centro de una caja de Petri con los medios ZA, FLA, CDA y PDA con trozos de tallo de hule esterilizado, se incubaron por 72 h y registró la tasa de crecimiento (mm), con los datos obtenidos se realizó el análisis de varianza con el programa Statgraphics Centurión XVI (^{Statpoint, 2013}). Se establecieron cinco repeticiones. El experimento se realizó dos veces.

Pruebas de patogenicidad

De acuerdo con ^{Dhingra y Sinclair (1985)}, se extrajeron de campo 60 tallos de Hevea brasiliensis del clon IAN-710 con 2.5 cm de ancho y 35 cm de largo, se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 5%, las puntas se sellaron con pintura vinílica y para su trasladado laboratorio y procesamiento se envolvieron en papel humedecido. Bajo condiciones asépticas, se lavaron nuevamente en hipoclorito de sodio al 2%. Para la inoculación se colocaron discos de 10 mm con medio PDA con el aislado en tallos con y sin herida, mismos que se cubrieron con cinta transparente. Los tallos se colocaron dentro de cámaras húmedas. Se establecieron cinco repeticiones.

La prueba de patogenicidad en campo se realizó sobre árboles de hule del clon IAN-710 sanos de 2.5 y 4.5 años, la concentración de conidios varió con el aislado Tux 01(10.76), Tux 02 (3.0), Tux 03 (1.56) y Tux 04 (8.50) x10⁶ respectivamente. Se asperjaron 200 mL de cada suspensión en una herida similar a la de pica de los cultivos comerciales, sobre la corteza externa suave. Se realizaron cuatro repeticiones. Los tratamientos se distribuyeron en bloques al azar. La evaluación de la severidad se realizó cuatro días después de la inoculación con una escala visual, en donde: A= corteza dañada; B= pudrición visible; C= micelio visible; D= necrosis; y E= ausencia de daño.

Bioensayo de sensibilidad in vitro de los fitopatógenos a fungicidas

Bajo la técnica de ^{Dhingra y Sinclair (1985)} de humedecimiento de papel filtro, sobre discos de papel Whatman No. 4 de 6 mm de diámetro, se aplicaron los productos Benomilo (2 g), Carbendazin (3 mL), Mancozed 70% (4 g), Mancozed 70% (1 kg/6 L testigo regional), Propiconazol (2.5 mL), Carboxamida (12 g), Clorotalonil(12 g) y las combinaciones Clorotalonil + Carboxamida (12 g), Benomilo + Mancozed 70% (2+4 g) recomendados por ^{AGI-Hule Región Papaloapan (2012)} y agua destilada (testigo absoluto).

Los discos se impregnaron con 50 μL de la solución. Se establecieron 10 tratamientos por aislado incluidos un testigo regional y un absoluto. Cada tratamiento tuvo ocho repeticiones distribuidas completamente al azar. La unidad experimental fue un disco. La variable respuesta fue el crecimiento micelial de los aislados, éste se registró a partir de las 24 h y hasta que el micelio del tratamiento testigo tocó el disco de papel filtro. Los datos obtenidos del crecimiento se sometieron a un análisis de varianza con el programa estadístico Statgraphics Centurión XVI (^{Statpoint, 2013}).

Características culturales de Fusarium en medios de cultivo 1X PDA con trozos de tallo de hule, ZA, CDA y FLA

Los aislados tuvieron un crecimiento radial, con marcados anillos, 75% de los aislados presentó micelio abundante, algodonoso, flocoso, aéreo, mientras que 25% restante (Tux-01 y Tux-04 en CDA, Tux-02 en PDA y ZA) tuvieron micelio ralo, inmerso en el medio. El color de la colonia fue blanco, amarillo claro a marrón por el anverso en todos los aislados y amarilla, marrón y negro por el reverso conforme envejeció la colonia, de manera sobresaliente el aislado Tux-01 en PDA y CDA y Tux-04 en CDA mostraron una coloración azulada en el anverso. Se observó pigmentación en el medio de cultivo en 50 % de los aislamientos (Figura 1).

Figura 1 Caracterización cultural de los aislados de Fusarium en los medios de cultivo: PDA con trozos de tallo de hule, ZA, CDA y FLA.  

La temperatura, oscuridad y el medio de cultivo son factores importantes para la formación rápida de pigmentos en este género, lo que facilita el hecho de observar variabilidad en la intensidad de la coloración. De manera particular el medio PDA por su alto contenido de carbohidratos permite un desarrollo y expresión ideales de sus características culturales como la forma, color, pigmentación del medio y rango de crecimiento (^{Leslie y Summerell, 2006}).

Características morfológicas de Fusarium en medio de cultivo PDA con trozos de tallo de hule

Todos los aislados presentaron la formación de macroconidios, dispersos en el micelio y en esporodoquios de color blanco, naranja y azul a los 36 días. La forma predominante fue semirrecta con una curva dorsal. El número de septos varió, para Tux-01, Tux-02 y Tux-04 fue de tres a cinco, mientras que para Tux-03 fue de cinco a nueve. La célula apical observada fue papilada y en forma de gancho, la basal con ligera y clara muesca.

Los microconidios estuvieron presentes en los cuatro aislados, éstos fueron hialinos, generalmente sin septos, algunos con uno o dos. Formados en falsa cabezas, sobre mono y polifiálides, cortas y largas. Clamidosporas intercalares y terminales presentes en los aislados Tux-02, Tux-03 y Tux-04. Hifas enrolladas en Tux-01, Tux-03 y Tux-04.

De acuerdo con ^{Dhingra y Sinclair (1985)} el medio de cultivo PDA puede estimular la formación de clamidosporas, lo que pudo facilitar su observación. Por otra parte, la presencia de las hifas enrolladas puede separar especies de Fusarium aislados de diferentes materiales vegetales de regiones pantropicales que pertenecen al complejo de Gibberella fujikuroi en la sección Liseola (^{Leslie, 1995}).

Características morfológicas de Fusarium en medio de cultivo CLA

Los macroconidios observados estuvieron dispersos en el medio de cultivo, abundantemente producidos en esporodoquios de color azul y naranja para Tux-01, naranja en Tux-02 y Tux-04 y blancos en Tux-03 que desarrollaron sobre las hojas de clavel o el medio de cultivo a los 36 días de inoculado (Figura 2A a 2D). Los macroconidios fueron hialinos, de forma semirecta con curva dorsal. En el aislado Tux-01 presentaron 3 a 4 septos, la célula apical fue papilada, la basal con apenas muesca y midieron 39.06 4.4 µm.

Figura 2 Estructuras de Fusarium observadas en el medio de cultivo CLA. A y B= esporodoquios blanco y azul sobre hoja de clavel; C= esporodoquio naranja sobre el medio; D= esporodoquio visto a 10X; E= macroconidio con cuatro septos; F= macroconidio con nueve septos; G= microconidios en falsas cabezas; H= clamidosporas intercalares; I= clamidosporas terminales; J y K= hifas enrolladas.  

En Tux-02 tde 3 a 5 septos, célula apical papilada, la basal con apenas muesca, de 39.4 x 4.4 µm. Tux-03 de 5 a 9 septos, célula apical estrecha y la basal con clara muesca, midieron 57.72 x 5.8 µm y Tux-04 de 3 a 4 septos, célula apical papilada, basal con apenas muesca y de 36.4 x 4.9 µm (Figura 2E y 2F).

Este medio de cultivo es excelente para la formación de estructuras reproductivas de Fusarium y su preservación, ya que disminuye la degeneración del cultivo por su bajo contenido de nutrientes (^{Fisher et al., 1982}). Los macroconidios que se producen suelen ser uniformes en tamaño y forma, se presentan entre 6 y 10 días después de inoculado el medio, estas particularidades proveen la razón por la cual es el medio de cultivo recomendado para trabajos de identificación de especies. El número de septos de 3 a 5 es frecuente en las especies de este género; sin embargo, el aislamiento Tux-03 con 5 a 9 (Figura 2E y F). coincide con los reportados para las especies F. decemcellulare, (^{Ploetz et al., 1996}) y F. lateritium (^{Leslie y Summerell, 2006}).

Los microconidios fueron formados en falsas cabezas dispuestas en mono o polifiálides (Figura 2G). De forma ovoide y sin septos, los aislados Tux-01 y Tux-02 tuvieron uno y dos septos, mientras que los Tux-03 y Tux-04 presentaron además forma arriñonada. Las medidas fueron Tux-01 de 9.48 x 3.08, Tux-02 de 8.2 x 3.2, Tux-03 de 6.52 x 3.2 y Tux-04 de 7.92 x 2.8 µm. Los microconidios no son producidos por todas las especies del género, su presencia puede ser un carácter importante, así como la talla, forma, las células conidiógenas donde nacen o el arreglo que tienen; la formación de éstas últimas puede verse afectada por el medio de cultivo utilizado.

En F. decemcellulare su forma es oval y sin septos, por lo general formados en cadenas, aunque pueden ocasionalmente ser en falsas cabezas y sobre monofiálides, además de abundantes en el micelio aéreo, características que coinciden con las observadas para el aislado Tux-03 y que los separan de F. lateririum al presentarlos elipsoides con cero a tres septos, individuales, en monofiálides y generalmente ausentes (^{Leslie y Summerell, 2006}).

Se observaron abundantes clamidosporas intercalares y terminales en los aislados Tux-02, Tux-03 y Tux-04. La presencia de éstas puede ser un factor distintivo en algunas especies, así como su disposición, por lo general son frecuentes en cultivos con medio SNA y CLA más que en otras superficies de agar y su formación puede tardar más de seis semanas (^{Leslie y Summerell, 2006}), su producción puede darse como respuesta a cambios de temperaturas, es un rasgo de supervivencia común en este género (^{Agrios, 2005}).

En tres de los aislados se observaron hifas enrolladas con tres y cuatro vueltas, preferentemente en micelio aéreo, con excepción de Tux-02 en donde no se apreciaron (Figura 2). Estas hifas son semejantes a las formadas por las especies F. sterilihyphosum, F. circinatum, F. pseudocircinatum y F. mexicanum que son las únicas reportadas que las producen (^{Leslie y Summerell, 2006}; ^{Jacobs et al., 2007}; ^{Kvas et al., 2009}; ^{Otero-Colina et al., 2010}).

Tasa de crecimiento para los aislados de Fusarium spp.

El análisis de los datos de crecimiento micelial a las 72 h, mostró diferencias estadísticas significativas entre ellos y varió tanto en los aislados como en los medios usados. La prueba de comparación de medias Tukey α= 0.05 para cada medio evidenció que en Tux-01 el mejor crecimiento se obtuvo con el medio de ZA (13.6 mm) en Tux-02 los medios ZA (9.8 mm), CDA (9.4 mm) y PDA (8.8 mm) tuvieron un crecimiento similar, para Tux-03 y Tux-04 los mejores medios fueron ZA (9.9 y 12.6 mm) y CDA (9.9 y 11.7 mm). El menor crecimiento se observó en el medio FLA en todos los aislados (Figura 3).

Figura 3 Prueba de comparación de medias de Tukey α= 0.05 de los aislados de Fusarium para cada medio de cultivo.  

La tasa de crecimiento es un carácter secundario, tradicionalmente se utiliza el medio PDA y se deja crecer por tres días a una temperatura de 25 o 30 °C. Por lo general permite distinguir las especies de rápido o lento crecimiento (^{Leslie y Summerell et al., 2006}).

La tasa de crecimiento para F. sterilihyphosum a 25 °C es de 4.8 mm día^-1 (^{Britz et al., 1999}), en F. circinatum es relativamente rápida (4.7 mm día^-1) a 20 °C (^{García, 2011}), F. decemcellulare es de 5-8.3 mm día^-1 a 25 °C, F. mangiferae Britz, Wingfield & Marasas 3.4 mm día^-1 y F. lateritium de 2.6-6.6 mm día^-1 (^{Leslie y Summmerell, 2006}).

Los datos registrados para el aislados Tux-01 se asemejan a las de las especies F. sterilihyphosum y F. circinatum, con quienes comparte la característica morfológica de hifas enrolladas. Los otros aislados estudiados son similares a los reportados para F. lateritium, y F. mangiferae, ya que Tux-02 creció 2.9 mm día^-1, Tux-03 (2.8 mm día^-1) y Tux-04 (3 mm día^-1); sin embargo, Tux-03 y Tux-04 presentan hifas enrolladas y las otras especies no.

Al comparar las características culturales, morfológicas y tasa de crecimiento observadas en los aislamientos estudiados con las descripciones hechas por (^{Klitiich y Leslie, 1992}; Leslie, 1995; ^{Huss et al., 1996}, ^{Ploetz et al., 1996}; ^{Klitiich et al., 1997}; ^{O’Donnell et al., 1998}; ²⁰⁰⁰; ^{Britz et al., 1998}; ¹⁹⁹⁹; ^{Steemkamp et al., 1999a}; Leslie y Summerell, 2006; ^{Jacobs et al., 2007}; ^{Kvas et al., 2007}; ^{Kvas et al., 2009}), se podría sugerir que el aislado Tux-01 pertenece a la especie F. circinatum Nirenberg & O’Donnell emend. Britz, Coutinho, Wingfield & Marasas, el aislamiento Tux-02 a F. lateritium Nees, Tux-03 a F. decemcellulare Brick, y finalmente Tux-04 a F. mangiferae Britz, Winfield & Marasas, aunque se hace evidente e indispensable la necesidad de confirmar; a través, del uso de herramientas moleculares y análisis multigénico que permitan distinguir con precisión cada aislamiento.

Pruebas de patogenicidad

En la prueba bajo condiciones controladas en laboratorio, se observó que los tallos inoculados sin herir no presentaron ningún signo de la enfermedad al igual que los testigos, mientras que los tallos con heridas presentaron los síntomas característicos en un lapso de 8 a 10 días. La prueba de patogenicidad en campo fue positiva para F. circinatum y F. mangiferae en todos los árboles en los que fueron inoculadas. F. mangiferae desarrolló una pudrición y micelio visibles, necrosis coincidente con los síntomas esperados a las 72 h, mientras que F. circinatum lo hizo a las 92 h y en 50% de los árboles inoculados. Las plantas testigo permanecieron libres de la enfermedad a pesar de haber sido heridas.

Los síntomas descritos para la enfermedad son similares a los ocasionados por el género en el tronco del pino Pinus halepensis (^{García, 2011}), pino ‘Alepo’ (^{Garbelotto et al., 2007}), durazno (^{Jacobs et al., 2007}), donde F. circinatum al bloquear los haces vasculares de las plantas, genera un marchitamiento de esta, con disminución en el tamaño y fortaleza. El daño que ocasionan se observa fácilmente al desprenderse la corteza, debajo de estas lesiones elongadas, oscuras a negras con abundante resina hay presencia de micelio si existe alta humedad relativa.

Las especies F. lateritium y F. decemcellulare no causaron los síntomas de la enfermedad en campo, esto contradice sus resultados en laboratorio, la importancia que tienen las condiciones ambientales es trascendente para que pueda llevarse a cabo el ciclo de una enfermedad.

Bioensayo de sensibilidad in vitro a fungicidas

El análisis de varianza indicó diferente respuesta en presencia de los fungicidas dependiendo del aislamiento. La interacción aislamiento por fungicida mostró alta significancia estadística, así como la prueba de comparación de medias de Tukey α= 0.05 (p= 0.0001), en el efecto de los tratamientos empleados sobre los aislamientos evaluados a los 11 días de establecido el bioensayo (Figura 4).

Figura 4 Interacciones, acción y efecto de los fungicidas, variación sobre las cepas del género Fusarium. 

Los resultados de las pruebas de Tukey α= 0.05 para F. circinatum mostraron que los mejores productos para la inhibición del crecimiento micelial fueron Propiconazol, Mancozed (TR), Carboxamida, Clorotlonil + Carboxamida y Clorotalonil. Los productos con menor inhibición fueron Benomilo, Carbendazin y agua destilada. Para el aislado F. lateritium los mejores efectos se presentaron con Propiconazol, Mancozed (TR) y Carboxamida, mientras que Mancozed, Benomilo + Mancozed, Benomilo, Carbendazin y agua destilada tuvieron la menor inhibición.

Para F. decemcellulare Clorotalonil + Carboxamida y Propiconazol fueron los mejores; Benomilo y Carbendazin tuvieron un bajo desempeño. F. mangiferae mostraron que los mejores productos para su inhibición fueron Clorotalonil + Carboxamida, Popiconazol; Mancozed (TR) y Mancozed 70%. El resto de los productos no tuvo buen desempeño.

Los resultados positivos observados con el uso de Propiconazol para F. circinatum, F. laterirtium y F. mangiferae son similares a los reportados por ^{Serrano et al. (2014)} para F. circinatum aislado de plantas muertas de Pinus radiata, en donde fue eficiente. En F. decemcellulare tuvo un desempeño regular.

El fungicida Mancozed aplicado solo también ejerció un buen control sobre las cuatro especies, situación contraria a la referida por ^{Mamza et al. (2010)} en su evaluación sobre F. pallidoroseum, aislado de Ricinus communis. Sin embargo, cuando Mancozed 70% fue probado junto con Benomilo tuvo una respuesta baja para F. circinatum y F. decemcellulare y nula para F. lateririum y F. mangiferae donde se comportó como el testigo de agua destilada.

El Benomilo aplicado solo, tuvo un funcionamiento nulo al no evitar el crecimiento del micelio en ninguna de las especies probadas, situación cercana a la observada por ^{Lara et al. (2013)} para F. oxysporum de gerbera con secadera, ^{Mendoza et al. (2011)} con F. nivale y F. oxysporum en jícama Pachyrhizus erosus, ^{Negrete et al. (2007)} en Fusarium sp., aislado de Heliconia Heliconia wagneriana y ^{Jiménez et al. (2007)} con Fusarium sp., de Ginger Alpinia purpurata en ambos casos de pudrición radical.

El fungicida Carboxamida tuvo resultados variables, así cuando fue aplicado solo fue eficiente para las especies F. circinatum y F. lateritium, pero fue regular para F. decemcellulare y F. mangiferae. Cuando estuvo en combinación con Clorotalonil su efecto fue bueno para F. circinatum, F. mangiferae y F. decemcellulare, pero medio para F. laterirum, situación contraria a la reportada por ^{Jiménez et al. (2007)} donde tuvo un buen control. Finalmente, el fungicida Carbendazin no ejerció ningún control sobre el micelio de ninguna de las especies estudiadas, situación que dista de la reportada por ^{Jiménez et al. (2007)} y ^{Negrete et al. (2007)}.