El trigo (Triticum turgidum subsp. durum) es uno de los cultivos más importantes a nivel mundial (^{Grijalva-Contreras et al., 2016}). En la actualidad, la producción de este cereal requiere el uso de grandes cantidades de fertilizantes químicos (∼300 kg N ha^-1), cuya tasa de aprovechamiento es del 20 al 35% (^{Grageda-Cabrera et al., 2018}). Lo cual conduce a problemas económicos y ambientales, tales como: la eutrofización, emisión de gases de efecto invernadero, y pérdida de la fertilidad del suelo (^{de los Santos-Villalobos et al. 2018}; ^{Liu y Xie, 2019}). Por lo cual, es determinante la generación de alternativas agro-biotecnológicas sostenibles, que permitan mantener o incrementar los rendimientos agrícolas disminuyendo los efectos negativos al ambiente, salud humana, y economía del productor.

En los últimos años, ha surgido el interés por la generación de sistemas agrícolas integrales; a través, de la aplicación de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV), las cuales son un grupo de bacterias que tienen la capacidad de mejorar la salud y calidad de las plantas, restaurando la fertilidad de los suelos (^{Rojas-Solís et al., 2016}; ^{Valenzuela-Aragon et al., 2019}). Los efectos positivos mostrados por las BPCV han sido fuertemente asociados a diversos mecanismos de acción i) directos, asociados al crecimiento de las plantas, tales como: la producción de fitohormonas (auxinas, citocininas, y giberelinas), compuestos orgánicos volátiles (acetoína, y derivados del azufre), fijación biológica de nitrógeno, ciclaje y solubilización de nutrientes (^{Moreno-Reséndez et al., 2018}; ^{Valenzuela-Ruiz et al., 2018}); e ii) indirectos, asociados a la resistencia de los cultivos a fitopatógenos, mediante la producción de lipopéptidos, antibióticos, o enzimas líticas (^{Villarreal-Delgado et al., 2018}; ^{Villa-Rodríguez et al., 2019}).

En la actualidad, existe un creciente interés por la formulación de estos productos biotecnológicos a partir de una o más especie o géneros bacterianos con capacidades fitoestimulantes, llamados consorcios bacterianos (^{Jha et al., 2013}). El objetivo del estudio fue evaluar la capacidad promotora del crecimiento del trigo, bajo condiciones controladas, de un consorcio bacteriano nativo integrado por cepas del género Bacillus, las cuales fueron aisladas del Valle del Yaqui, Sonora, México (región que contribuye con 50% a la producción de este cereal a nivel nacional).

Las cepas bacterianas en estudio (TE3^T, TRQ8, TRQ65 y TSO9) fueron aisladas (por diluciones seriadas (1:10), utilizando agar nutritivo como medio de cultivo, a 28 ºC) de la rizósfera del cultivo de trigo variedad CIRNO2008, cultivado en parcelas comerciales ubicadas en el Valle del Yaqui, Sonora, México (27°35’53.14” N y 110°2’53.26” W). Dichas cepas fueron preservadas en la Colección de Microorganismos Endófitos y Edáficos Nativos (http://www.itson.edu.mx/COLMENA) (^{de los Santos-Villalobos et al., 2018}).

Las cepas TE3^T, TRQ8, TRQ65 y TSO9 fueron caracterizadas metabólicamente para rasgos asociados a la promoción del crecimiento vegetal, tales como: solubilización de fosfatos, producción de índoles, tolerancia a estrés térmico, hídrico, y salino y clorotalonil (^{Valenzuela-Aragon et al., 2019}; ^{Díaz-Rodríguez et al., 2019}). Así, TRQ8 fue la única cepa que mostró la capacidad de producir sideróforos (8.1 ±0.8%). Además, se observó que ciertas cepas en estudio mostraron la capacidad de solubilización de fosfatos (TE3^T, 43.2 ±1.7%; TRQ8, 38 ±0.9%; TSO9, 54 ±1%), producción de indoles (TRQ8, 12 ±0.4; TRQ65, 28.8 ±0.9 ppm). Finalmente, todas las cepas mostraron la capacidad de tolerar el estrés térmico (43.5 °C), hídrico [Glicol polietileno (PEG), 10%, -0.84 mPa)], salino (NaCl, 5%, 6.8 dS m^-1) y químico (Clorotalonil).

La identificación molecular de las cepas en estudio se realizó mediante la secuenciación del gen 16S ARNr, con base en lo reportado por ^{Valenzuela-Aragon et al. (2019)}. Las secuencias obtenidas se editaron con el software FINCH TV (Geospiza, Inc.; Seattle, WA, EE. UU; http://www.geospiza.com) y fueron comparadas con la base de datos de BLASTn de National Center for Biotechnology Information (NCBI) por sus siglas en inglés), considerando el porcentaje de máxima identidad. Las secuencias del gen 16S ARNr de las cepas estudiadas fueron depositadas en el NCBI Genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y publicadas con el número de accesión: MH057214 (TE3^T), MK493655 (TSO9), MK493638 (TRQ8) y MK493706 (TRQ65).

Las secuencias de DNA obtenidas fueron utilizadas para construir un árbol filogenético mediante el software CLC Sequence Viewer (CLC bio, Aarhus, Denmark), con el modelo de evolución Kimura80, y el modelo de construcción Neighbor-Joining. Dicha construcción se realizó con base en 1000 iteraciones para el cálculo del porcentaje de bootstrap. La secuencia del gen 16S ARNr de Pseudomonas sp. (MH569548) fue utilizada como ‘outgroup’. Así, la cepa TRQ65 fue afiliada taxonómicamente a Bacillus paralicheniformis (cobertura 100% e identidad 100%) (Valenzuela-Ruiz et al., 2019), TSO9 a B. subtilis (cobertura 100% e identidad 100%) (^{Villa-Rodriguez et al., 2019}), TE3^T a B. cabrialesii (cobertura 100% e identidad 100%) (^{de los Santos-Villalobos et al., 2019}) y TRQ8 a Bacillus megaterium (cobertura 100% e identidad 99.66%) (^{Robles-Montoya et al., 2019}). La afiliación taxonómica mencionada anteriormente fue soportada por el valor de bootstrap, indicando el porcentaje en el que la configuración de un clado se repite en 1000 simulaciones al azar o iteraciones (Figura 1).

Figura 1 Árbol filogenético construido con las secuencias del gen 16S ARNr de las cepas en estudio, con los modelos Kimura80 y Neighbor-Joining, los clados se determinaron con 1 000 iteraciones (bootstrap). *= secuencia outgroup (Pseudomonas sp. MH569548). 

El impacto de la inoculación del consorcio bacteriano integrado por Bacillus megaterium TRQ8, B. paralicheniformis TRQ65, B. cabrialesii TE3^T, y B. subtilis TSO9 sobre rasgos biométricos de plántulas de trigo (Triticum turgidum subsp. durum) variedad CIRNO C2008 fue estudiado. Para esto se realizaron pre-inóculos de cada cepa bacteriana, inoculando ~10⁴ unidades formadoras de colonia (UFC) mL^-1 en 10 mL de caldo nutritivo estéril (CN, DIBICO^®) y se incubó a 28 °C con agitación continua (120 RPM) por 24 h. Posteriormente, los inóculos fueron generados inoculando 1 mL del pre-inóculo (densidad óptica a 600 nm: 0.5) en 500 mL de CN, e incubando bajo las condiciones descritas anteriormente. Finalmente, los cultivos bacterianos fueron centrifugados a 3 500 RCF, durante 15 minutos, realizando dos lavados con agua destilada estéril (15 lb, 121 °C, 15 min) y se ajustó la densidad celular de cada cepa en estudio a 1*10⁷ UFC mL^-1, con agua destilada estéril.

Las semillas de trigo fueron desinfectadas superficialmente, lavándolas con jabón comercial y embebiéndolas en agua destilada estéril (121 °C y 15 lb por 15min) durante 24 h, posteriormente las semillas fueron lavadas con NaCl al 2% durante 10 min, seguido de 3 lavados con agua destilada estéril. Las semillas desinfectadas fueron colocadas en 230 g de una mezcla de suelo estéril (121 °C y 15 lb por 5 días), en una proporción de 70:30 (perlita: suelo agrícola). El suelo agrícola utilizado fue colectado de parcelas comerciales destinadas a la producción de trigo en el Valle del Yaqui (vertisol hiposódico, pH 7.74 ±0.05, materia orgánica <1%, textura arcillosa 40-60%).

Un diseño unifactorial con dos tratamientos fue utilizado (dos repeticiones independientes, n= 15 por repetición): i) plántulas inoculadas (4*10⁷ UFC, a los 0 y 15 días de siembra) por el consorcio en estudio vs; y ii) un control negativo (plántulas no inoculadas y asperjadas con agua destilada estéril). El experimento se realizó en una cámara de crecimiento (BJPX-A450, BIOBASE) bajo 70% de humedad relativa, temperatura de 25 °C (día) y 15 °C (noche), y un fotoperiodo de 14 h luz/12 h oscuridad, durante 30 días. Una vez concluido el experimento, las variables biométricas evaluadas en las plántulas fueron longitud total, altura, longitud de raíz, peso seco del brote y raíz, grosor del tallo, e índice de biovolumen (^{Thilagar et al., 2016}).

El consorcio bacteriano integrado por Bacillus cabrialesii TE3^T, B. paralicheniformis TRQ65, B. megaterium TRQ8 y B. subtilis TSO9 mostró un incremento significativo respecto al tratamiento control [Fischer LSD (p≤ 0.05), Statgraphics 5.0] sobre la longitud de la parte aérea (28%), longitud de raíz (25%), longitud total (28%), diámetro de tallo (46%), circunferencia (50%), peso seco de la parte aérea (72%) y el índice de biovolumen (57%) (Cuadro 1).

El consorcio bacteriano estudiado incrementó la producción de biomasa y elongación celular en las plántulas de trigo inoculadas (Cuadro 1), lo cual puede estar asociado a la capacidad metabólicas de las cepas, ie. producción de indoles (12-28 ppm), sideróforos (8%), solubilización de fosfatos (38-54%), represión del crecimiento de microorganismos fitopatógenos, y resistencia a condiciones de estrés (^{Villarreal-Delgado et al. 2018}; ^{Valenzuela-Aragón et al., 2019}; ^{Díaz-Rodríguez et al., 2019}; ^{Villa-Rodríguez et al., 2019}). La inoculación de BPCV productoras de fitohormonas conduce a un incremento de la longitud y biomasa radicular de las plantas, potenciando la adquisición de nutrientes del suelo y promoviendo el crecimiento vegetal, incluso bajo condiciones de estrés (^{Valenzuela-Ruiz et al., 2018}); este efecto benéfico también está aunado a una mayor biodisponibilidad y movilización de nutrientes hacia la planta (^{Jacoby et al., 2017}). La capacidad de solubilizar fosfatos, así como la producción sideróforos, se ha asociado con el incremento en la tasa de crecimiento y rendimiento en trigo, manteniéndose dicho atributo bajo condiciones de estrés químico y dosis disminuida de fertilización inorgánica (^{Munir et al., 2019}).

Los resultados obtenidos en la presente investigación evidencian la compatibilidad y papel ecológico/funcional in vivo de las actividades metabólicas detectadas (y otras no descritas hasta el momento) en las cepas que integran el consorcio bacteriano en estudio (Bacillus cabrialesii TE3^T, B. paralicheniformis TRQ65, B. megaterium TRQ8 y B. subtilis TSO9). Así, los efectos positivos observados en las plántulas de trigo inoculadas con el consorcio bacteriano desarrollado puede ser atribuido a la diversidad metabólica de las cepas del género Bacillus que lo integran, así como su capacidad para responder como un organismo a los diversos estresores ambientales, lo cual le otorga una capacidad incrementada de adaptación (interacciones sinérgicas para proveer nutrientes y estimular su crecimiento, degradación de compuestos inhibitorios, competición microbiana, entre otros), en comparación con cepas individuales.