Cepas

Se utilizaron 29 aislados de P. capsici identificados usando las claves de ^{Erwin y Ribeiro (1996}), los cuales fueron obtenidos de plantas con síntomas de ‘marchitez’, en 12 lotes de producción comercial de diferentes variedades e híbridos de chiles tipo poblano, güero, serrano, jalapeño y chilaca, ubicados en los municipios de: Dolores Hidalgo, San Luis de la Paz, Juventino Rosas, Silao, Salvatierra y Cortazar en Guanajuato.

Las cepas de referencia para los tipos de compatibilidad usadas PCT17 (A1) y PCC6 (A2), fueron donadas por la Dra. Sylvia Patricia Fernández Pavía del Laboratorio de Patología Vegetal-UMSNH. De todos los aislados incluyendo las cepas de referencia se hicieron cultivos monozoospóricos de acuerdo con el protocolo de ^{Erwin y Ribeiro (1996}). Los cultivos se mantuvieron en medio sólido V8C (160 ml de jugo V8, 3 g CaCO₃ y 840 ml de agua desionizada), transfiriéndolos cada seis semanas.

Patrón de crecimiento de la colonia

Para la descripción del patrón de crecimiento de los aislados se sembraron discos de micelio de 1 cm de diámetro en agar V8C, se incubaron a 27 °C durante seis días en la oscuridad. Se determinó las formas de las colonias comparándolas con los patrones descritos por ^{Erwin y Ribeiro (1996}).

Crecimiento a 35 °C

De cada aislado se sembró en el centro de una caja petri con medio V8C, un disco de 8 mm de diámetro con micelio de 3 a 5 días de edad. Se midió el diámetro de la colonia a lo largo de dos ejes perpendiculares, cada 48 h durante ocho días y la tasa de crecimiento se calculó a 27 y 35 °C. Se realizaron dos ensayos con tres repeticiones para cada aislamiento y se tomó como resultado el promedio obtenido. El porcentaje de crecimiento a 35 °C se calculó considerando como 100% el crecimiento a 27 °C.

Tipo de compatibilidad

El tipo de apareamiento se determinó cocultivando cada uno de los aislados monozoospóricos de P. capsici, con cada una de las cepas de tipo de compatibilidad conocida A1 y A2. Las confrontaciones se llevaron a cabo colocando en cajas Petri con agar V8C, fragmentos de micelio del aislado problema y de la cepa de tipo de compatibilidad conocida, con una separación de tres centímetros entre ellos. Las cajas fueron incubadas 2.5 semanas a 27 °C en oscuridad. Se examinó al microscopio (objetivo 10X) la formación de oosporas. A los aislados que produjeron oosporas con la cepa A1, pero no con la A2 se determinaron como tipo de apareamiento A2 y a los que produjeron oosporas con A2 se determinaron como A1.

Sensibilidad a mefenoxam

Discos de agar de 8 mm de diámetro de los 31 cultivos monozoospóricos, fueron transferidos a cajas petri con medio V8C con y sin mefenoxam. Se empleó 100 ppm de mefenoxam (Ridomil Gold-EC, Syngenta, Greensboro, NC, 48% ia.), agregado al medio previo al vaciado en cajas petri (^{Lamour y Hausbeck, 2000}). Las placas fueron incubadas en oscuridad, a 25 ºC durante 7 días. Se evaluó cada 24 h el crecimiento radial del micelio, midiendo el diámetro en dos direcciones (perpendiculares) obteniendo el promedio.

El porcentaje de crecimiento relativo se calculó considerando como 100% el crecimiento promedio de cada aislado cultivado en medio sin mefenoxam (^{Lamour and Hausbeck. 2000}; ^{Fernández-Pavía, et al. 2004}). Se efectuaron dos ensayos con tres repeticiones por aislado. Los aislados monozoospóricos fueron clasificados de acuerdo con la escala establecida por ^{Lamour y Hausbeck (2000)}. Siendo sensibles (S) los que tuvieron un crecimiento relativo menor de 30%, sensibilidad intermedia (SI) de 31-90% e insensible (I) mayor al 90% de crecimiento.

Análisis de virulencia

Se realizaron tres repeticiones, con cada aislados, utilizando tres plantas/repetición en la etapa de tres a cuatro hojas verdaderas de la variedad Sonora Anaheim (Seminis). La inoculación se realizó colocando las plántulas en frascos estériles con 50 ml de agua, a cada una se agregó una solución de 10⁴ zoosporas ml^-1, más un antibiótico (ampicilina 100 mg ml^-1) para evitar el crecimiento de bacterias.

Las plantas inoculadas, se colocaron en una cámara de crecimiento a 25 ºC y se evaluó el daño a los cinco días, usando la escala descrita por ^{Parker y Grau (1992}): 0= planta sana; 1= necrosis y obstrucción en la base del tallo; 2= necrosis, obstrucción en la base del tallo y marchitez parcial; 3= necrosis, obstrucción en la base del tallo, marchitez avanzada; 4= muerte total de la planta.

Patrón de crecimiento de la colonia

En la población analizada se encontraron cinco patrones de crecimiento, siendo el tipo estrellado el más frecuente (62.5%), seguido por el filamentoso (15.62%), estolonífero (12.5%), toruloso (6.25 %) y petaloide (3.12%) (Figura 1). Se observó una variación de los patrones de crecimiento en todo el estado, así como alta variabilidad dentro de algunos municipios, como Dolores Hidalgo en donde se encontraron tres tipos de crecimiento y Cortazar que en tres muestras tiene tres tipos de crecimiento.

Figura 1 Morfotipos de colonias de P. capsici del estado de Guanajuato observadas en PDA. a) estrellado; b) filamentoso; c) estolonífera; d) toruloso; y e) petaloide. 

En contraste con Silao y San Luis de la Paz que todos sus aislados muestran un tipo de crecimiento (Cuadro 1). Con un menor tamaño de muestra, se observó una mayor diversidad en formas de crecimiento en el estado de Guanajuato que en los aislados de Nuevo México, EE. UU. (^{Fernández-Pavía et al., 2004}), Illinois, EE. UU. (^{Islam et al., 2005}) y Chihuahua, México (^{Sánchez-Gurrola et al., 2019}), coincidiendo con estos trabajos de que el crecimiento estrellado es el más frecuente.

Al igual que en los trabajos mencionados, en este estudio, no se encontró una relación clara del tipo de crecimiento con las otras características evaluadas. La variación en la morfología de la colonia se ha observado en P. capsici desde hace varios años y es considerada un primer indicio de la diversidad existente (^{Bowers et al., 2007}).

Crecimiento a 35 °C. La tasa de crecimiento promedio a 27 °C de los cultivos monozoospóricos fue de 12.82 mm día^-1, este crecimiento fue mayor a lo reportado por ^{Tamietti y Valentino (2001}), quienes encontraron para 20 aislados de P. capsici una tasa promedio de crecimiento de 0.81 mm día^-1 y a la reportada por ^{Fernández-Pavía et al. (2004}) de 9 mm día^-1 para aislados de Nuevo México crecidos a 30 °C.

La tasa de crecimiento promedio de los cultivos monozoospóricos a 35° C fue de 1.7 mm día^-1 variando entre 0 y 3.87 mm día^-1 (dato no mostrado); este resultado es menor al obtenido por ^{Islam et al. (2005}), quienes observaron que la tasa de crecimiento a esta temperatura para aislados de Illinois varió de 3.1 a 10.1 mm día^-1 y a lo reportado por ^{Granke et al. (2011}) quienes encontraron un crecimiento promedio de 3.4 mm día^-1 en 122 aislados de P. capsici originarios de 12 países. El porcentaje de crecimiento de los aislados de Guanajuato a 35 °C varió de 0 a 30.7%, todos los aislados con excepción del CT4, tuvieron un crecimiento menor al 30% (Cuadro 1).

Este resultado es contrastante al obtenido para aislados de Nuevo México cuyo crecimiento varió entre 11 y 100% (^{Fernández-Pavía et al., 2004}). Pero concuerda con lo reportado por ^{Tlalpal-Bolaños et al. (1995}) quienes reportan que los aislados de México crecen pobremente a esta temperatura.

Este crecimiento sugiere que los aislados de Guanajuato presentan una menor adaptación a temperaturas elevadas, esto puede ser debido a las condiciones térmicas en las que han evolucionado ya que de acuerdo con el ^{INEGI (2013)}, históricamente la temperatura media anual en Guanajuato es de 18 °C y la temperatura promedio más alta es alrededor de 30 °C y se presenta en los meses de mayo y junio cuando el ciclo de cultivo para chile en fresco está terminando en este estado.

Tipo de compatibilidad

Todos los aislados fueron heterotálicos y la distribución de los tipos de compatibilidad en el estado fue al azar y en algunos campos se encontraron conviviendo los dos tipos de compatibilidad, observándose en el estado una predominancia del tipo A1 (65.5%) (Cuadro 1).

A nivel mundial, la identificación de ambos tipos de compatibilidad en colectas de P. capsici se ha reportado frecuentemente por diferentes investigadores, como ^{Fernández-Pavía et al. (2004}), los cuales al caracterizar 59 aislados del sur de Nuevo México, EE. UU., encontraron una distribución al azar de ambos tipos de compatibilidad A1 y A2 y demostraron la convivencia de ellos en un solo campo, señalando al A1 como el de mayor frecuencia en una relación de 2:1 con respecto al A2. ^{Tamietti y Valentino (2001}), en una colecta de 26 aislados originarios del norte de Italia, encontraron 19 del tipo A1, 3 del tipo A2 y 4 heterotálicos. ^{Islam et al. (2005}) reportan en una colecta de 57 aislados realizada en Illinois E.U., 31 del tipo A1 y 26 del tipo A2. ^{Meitz et al. (2010}) encontraron en una colección de 78 aislados de Sudáfrica 42 del tipo A1 y 36 del tipo A2.

En México, ^{Castro-Rocha et al. (2016}) analizaron 81 aislados de P. capsici de cuatro estados, incluyendo 14 aislados de Guanajuato. Informan la presencia de 32 aislados con el tipo de apareamiento A1, 43 con el tipo A2 y 6 homotálicos en el total de la población. También se ha confirmado la presencia de ambos tipos de compatibilidad en zonas productoras de chile en los estados de Aguascalientes, Chihuahua, Ciudad de México, Jalisco, Michoacán y Zacatecas (^{Rodríguez-Moreno et al., 2004}; ^{Silva-Rojas et al., 2009}; ^{Castro-Rocha et al., 2016}).

La presencia de los dos tipos de compatibilidad en Guanajuato fue reportada por ^{Pérez-Moreno et al. (2003}), quienes al analizar 8 aislados obtenidos en dos municipios de este estado, reportan 4 del tipo A1 y 4 del tipo A2, esto fue confirmado por el trabajo de ^{Castro-Rocha et al. (2016}) que reportan haber encontrado en Guanajuato 5 aislados del tipo A1, 6 del tipo A2 y 3 homotálicos.

Coincidiendo con los resultados del presente trabajo, ambos tipos de apareamiento se han identificado dentro de la misma parcela por varios investigadores (^{Gobena et al., 2012a}; ^{Jiang et al., 2015}; ^{Barchenger et al., 2017}). Esto indica que el manejo de la enfermedad será más difícil, debido a la diversidad genética generada por reproducción sexual, que puede originar nuevos genotipos resistentes a tratamientos químicos o con mayor capacidad patogénica o virulencia y aislados capaces de romper la resistencia de variedades en menor tiempo.

Sensibilidad a mefenoxam

El 65.5% de los aislados presentaron sensibilidad intermedia a mefenoxam a 100 ppm, siendo el resto sensibles (Cuadro 1). El crecimiento del micelio de los aislados con sensibilidad intermedia fue malformado, con hifas cortas y en algunos casos turulosas. La insensibilidad de los aislados de P. capsici a este compuesto químico se ha reportado desde hace varios años, se ha señalado que se debe a que los oomicetos, aunque morfológicamente similares a los hongos verdaderos, son genética y bioquímicamente diferentes (^{Erwin y Ribeiro, 1996}) y no son susceptibles a la mayoría de los fungicidas de amplio espectro, por esta razón, los productores tienden a depender de un número limitado de fungicidas.

Los más populares a nivel mundial y de los que se ha abusado en su uso, son los fungicidas de la clase de las fenilamida, específicamente metalaxil y su enantiómero mefenoxam (Ridomil Gold EC) (^{Lamour y Hausbeck, 2000}), de los cuales se ha establecido que su modo de acción es sitio específico y que la tolerancia a ellos está condicionada por un locus único que tiene un efecto mayor y dominancia incompleta, sujeto a modificación por genes de efectos menores (^{Fabritius et al., 1997}).

Además, se ha reportado que la insensibilidad al mefenoxam, también confiere insensibilidad al metalaxil, en poblaciones de campo de P. capsici en pimiento morrón (^{Parra y Ristaino, 1998}). En Guanajuato, el mefenoxam y metalaxil se han utilizado por más de una década en el cultivo de chile, por lo que la aparición de aislados con insensibilidad a estos productos era de esperarse.

Aislados con insensibilidad al metalaxil fueron reportados por primera vez en Guanajuato por ^{Pérez-Moreno et al. (2003}), quienes señalan haber encontrado nueve aislamientos insensibles a metalaxil. Estos resultados y los encontrados en este trabajo, sugieren que en el estado de Guanajuato no se han encontrado aún aislados insensibles a mefenoxam, hay una tendencia a desarrollar resistencia, lo que podría ser un problema a corto plazo.

Dado que, de acuerdo con estudios realizados por ^{Lamour y Hausbeck (2001}), una vez establecida la resistencia a mefenoxam o metalaxil, el uso de estos debe ser limitado, pues la frecuencia de aislados resistentes no decrece durante dos años, aun eliminando la aplicación del químico y empleando rotación de cultivo.

Análisis de virulencia

Dos de los aislados más virulentos D3 y D5 y los tres aislados no virulentos D8, D11 y D12 encontrados en Guanajuato, son originarios del municipio de Dolores Hidalgo, lo que refleja una alta variabilidad en esta característica, esto podría atribuirse a la presencia de los dos tipos de apareamiento en este municipio, lo cual sugeriría la existencia de reproducción sexual y por tanto la aparición de nuevas razas patogénicas, pero al analizar otros municipios, encontramos localidades como Silao en donde se encontraron también los dos tipos de apareamiento, pero solo un nivel de virulencia en sus aislados y el otro caso es el de Juventino Rosas y Cortazar en donde se tiene un solo tipo de compatibilidad y variación en el grado de virulencia (Cuadro 1).

La falta de correlación de la virulencia con otras características como el tipo de apareamiento, el crecimiento radial a 27 y a 35 °C, concuerda con los estudios reportado por ^{Fernández-Pavía et al. (2004}) y ^{Tamietti y Valentino (2001}). La alta diversidad en la virulencia presente en el municipio de Dolores Hidalgo, podría estar relacionada con el tipo de hospedero, ya que si bien, es un mismo tipo de chile el que se siembra, todos ellos son variedades criollas y prácticamente cada productor tiene su propia variedad y produce su semilla lo que genera un proceso de selección.

Esto podría haber originado que cada criollo desarrollara diferentes mecanismos de defensa para evitar o limitar el daño producido por Phytophthora. Así, los patógenos tendrían que evolucionar para generar nuevos mecanismos de virulencia que les permita eludir las defensas de los huéspedes. Provocando que los huéspedes, tengan que evolucionar para generar nuevas defensas para enfrentar a los nuevos mecanismos de virulencia de los patógenos. Estas presiones de selección recíprocas entre los mecanismos de virulencia del patógeno y de defensa de la planta, se vería reflejado en la diversidad en la virulencia que se está encontrando. Esto habría que probarlo con otros estudios ya que no fue el objetivo de este trabajo.

La población de Phytophthora capsici de Guanajuato se caracteriza por sus altos niveles de diversidad, similares a lo reportado por varios autores para otras poblaciones de este patógeno (^{Lamour y Hausbeck, 2001}; ^{Hausbeck y Lamour, 2004}; ^{Gevens et al., 2008}; ^{Meitz et al., 2010}; ^{Lamour et al., 2011}; ^{Gobena et al., 2012b}), por lo que esta diversidad debe de ser considerada para el diseño de estrategias para su control.

Conclusiones

Existe variabilidad fenotípica entre los aislados de P. capsici de Guanajuato. En Guanajuato se encuentran los dos tipos de apareamiento, siendo el A1 el predominante. Existen municipios en donde conviven aislados de los dos tipos de compatibilidad.

Una alta proporción de aislados de P. capsici han desarrollado resistencia intermedia a Mefenoxam. Existe una alta diversidad en la virulencia presente en el municipio de Dolores Hidalgo.

No se observa una relación directa entre la forma de crecimiento, el crecimiento a 35 °C, el tipo de compatibilidad, la resistencia a mefenoxam, y el grado de virulencia.