Muestreo e identificación del patógeno

Se colectaron muestras de tallos de plantas de tomate con síntomas típicos de la enfermedad de marchitamiento vascular causada por Fol en parcelas productoras de tomate en seis localidades del municipio de Metepec, Hidalgo, en variedades comerciales: Reserva, Donnatello, El Cid, Palermo, Andino y Mezcal. Los tallos colectados se depositaron en bolsas de polietileno para posteriormente trasladarlas al Laboratorio de Patosistemas Agrícolas del Departamento de Fitomejoramiento en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN).

Se realizaron cortes longitudinales al tallo para observar síntomas de necrosis marrón interna en los vasos conductores y luego cortar secciones del tallo de aproximadamente 3 mm. Dichos tallos se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 3 min, posteriormente se sembraron en un medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) en placas de Petri y se incubaron a 25 °C durante ocho días, después de lo cual se realizó transferencia por punta de hifa para obtener cultivos monospóricos (^{Amini, 2009}). La identificación del patógeno se hizo considerando la sintomatología en plantas enfermas y por las características morfológicas de micelio y conidios en medio de cultivo a nivel microscópico (^{Gerlanch y Nirenberg, 1982}; ^{Leslie y Summerell, 2006}).

Identificación de razas Fol

Cultivos en PDA de 10 días de antigüedad se lavaron con agua destilada estéril para obtener la suspensión de inóculos del patógeno. Luego, los cultivos se filtraron, se lavaron con agua estéril y se ajustaron a una concentración de 1×10⁶ conidios ml^-1. La viabilidad de los conidios se verificó mediante diluciones en placas en medios PDA. Para cada aislamiento se midió la concentración de esporas realizando recuentos de macro conidios utilizando un hematocímetro Neubauer en un microscopio de aumento 40X.

La patogenicidad de cada aislado se probó en plántulas de tomate cv Bony Best, susceptible a las razas 1, 2 y 3 de Fol, siguiendo la metodología de inmersión de puntas de raíz durante 10 min en una solución fúngica a una concentración de 1×10⁶ esporas ml^-1 (^{Williams, 1981}; ^{Inami et al., 2012}). Después de la inoculación las plántulas se trasplantaron a macetas de 10 cm de diámetro, llenas de sustrato comercial peat moss y se mantuvieron en un invernadero.

La identificación de razas de los aislamientos colectados de Fol se realizó utilizando la prueba de patogenicidad en cuatro cultivares diferenciales de tomate: Bonny Best, sin genes de resistencia y susceptibles a las tres razas, Manapal resistente solo a la raza 1 por la presencia de locus i, pero susceptible a las razas 2 y 3, Walter resistente a las razas 1 y 2 debido a la presencia de loci i e i-2, pero susceptible a la raza 3 e I3R3 resistente a las razas 1, 2 y 3 debido a la presencia del gen i-3 (^{Reis et al., 2004}; ^{Scott et al., 2004}). Los materiales fueron proporcionados por el Dr. John Paul Jones, del Instituto de Ciencias para la Agricultura y la Alimentación de la Universidad de Florida.

Cuando las plántulas tenían tres hojas verdaderas fueron extraídas del sustrato; sus raíces se lavaron con agua corriente, se enjuagaron con agua destilada estéril y se sumergieron durante 10 min en una solución fúngica a una concentración de 1×10⁶ esporas ml^-1 (^{Inami et al., 2012}). Las plantas control se sumergieron en agua destilada. Todas las plántulas se trasplantaron en macetas de 10 cm de diámetro que contenían una mezcla estéril de arena y tierra, se añadieron a cada maceta 15 g de NPK (15:15:15). Las macetas se mantuvieron en un invernadero a 23-28 °C, 60-70% de humedad relativa y 16 h de luz, 8 h de oscuridad.

Evaluación de la resistencia de genotipos de tomate para la raza 3 de Fol

Se evaluó la incidencia y severidad de Fusarium oxysporum f. sp. lycopercisi raza 3 en siete genotipos de tomate (K3, R1, F3, Y53, D4, D3, IR13), los cuales son líneas seleccionadas por su potencial de rendimiento en trabajos previos realizados en el departamento de Fitomejoramiento de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN). Para la inoculación, se usaron plántulas de tomate 30 días después de la germinación, usando la técnica de inmersión de raíces en una suspensión de 1x10⁶ conidios por ml. Después de la inoculación, las plántulas se trasplantaron a bolsas de polietileno de 3 litros de capacidad que contenían una mezcla de tierra y turba y se mantuvieron en un invernadero durante 48 días a una temperatura de 25 ±2 °C.

La respuesta de las plantas de tomate a la inoculación de Fol se realizó utilizando una escala de severidad de 1 al 5 según ^{Marlatt et al. (1996)} modificada para estimar la severidad de la enfermedad, donde 1 corresponde a planta libre de síntomas, 2 planta con clorosis leve en las hojas inferiores, 3 clorosis moderada, 4 clorosis severa y 5 planta muerta. Con los valores de la escala de la severidad, se estimó un índice de enfermedad porcentual para cada genotipo utilizando la fórmula: IE=∑i=1nXin0.2100 , donde: Xi= severidad de la enfermedad en la i-ésima plántula, n= número de plántulas evaluadas. 0.2= factor de corrección para porcentajes de enfermedad.

Los índices de enfermedad obtenidos se usaron para determinar el avance de la enfermedad y la respuesta de estos materiales a la inoculación del patógeno calculando el área bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE) de acuerdo con la siguiente ecuación: ABCPE=∑i=1n-1yi+1+yi2ti+1-ti , donde: t= es el tiempo de cada lectura; y= es el porcentaje de plantas afectadas en cada lectura y n= es el número de lecturas (^{Shaner y Finney, 1977}).

Análisis estadístico

Todas las pruebas de patogenicidad se realizaron en un diseño de bloques completos al azar, con tres repeticiones. La unidad experimental estuvo formada por cinco macetas por genotipo. Con los valores obtenidos para índice de enfermedad y ABCPE se realizó un análisis de varianza mediante el procedimiento GLM y comparación de medias mediante la prueba de Tukey (p≤ 0.05). Para índice de la enfermedad, el análisis de varianza se realizó con valores obtenidos a los 16, 32 y 48 días después de la inoculación.

Aislamiento e identificación del patógeno

De treinta aislamientos obtenidos de plantas con síntomas típicos de la enfermedad, seis produjeron colonias en medio de cultivo PDA con micelio aéreo flocoso, disperso y abundante con variación en color blanco a violeta pálido, con abundantes macroconidios de corta y mediana longitud, falcados, de paredes delgadas y septados. Dichas características coinciden con lo descrito por ^{Leslie y Summerell (2006)} para la identificación morfológica de Fusarium oxysporum, además de la sintomatología observada en plantas de tomate inoculadas artificialmente permitieron la identificación como Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.

Identificación de razas de Fol

Los resultados sobre la reacción de cultivares diferenciales para Fol se obtuvieron 16 días después de la inoculación. Las plántulas susceptibles presentaron los síntomas típicos de la enfermedad (coloración amarillenta, defoliación, marchitez y muerte), mientras que las plántulas resistentes no mostraron ninguna sintomatología a las cepas utilizadas. Bonny Best y Manapal presentaron susceptibilidad completa en las seis cepas evaluadas (Cuadro 1), descartando así la presencia de la raza 1. Walter mostró susceptibilidad completa a cuatro de los seis aislamientos y resistencia en dos, lo que indica que estos dos aislamientos pueden identificarse como la raza 2, ya que la variedad Walter es resistente a las razas 1 y 2 y susceptible a la raza 3.

Algunas plantas de la variedad I3R3 consideradas resistentes a la raza 3 mostraron algunos signos de susceptibilidad probablemente debido a una impureza genética en el cultivar, por la pérdida de genes menores durante el proceso de introgresión por retrocruzamiento, los cuales son capaces de modular la expresión de la reacción de resistencia a este patógeno (^{Reis et al., 2004}).

Se detectó la presencia de dos razas en parcelas muestreadas en una proporción de 33% correspondiente a la raza 2 y de 67% a la raza 3. Por lo tanto, es necesario utilizar cultivares adaptados a la región con resistencia a las cepas 2 y 3. ^{Ortega (2010)}; ^{Sánchez et al. (2010)}; ^{Hernández et al. (2014)} también reportaron la presencia de las cepas 2 y 3 de Fol en el estado de Morelos, Sinaloa y San Luis Potosí, respectivamente. ^{Valenzuela-Ureta et al. (1996)}; ^{Carrillo-Facio et al. (2003)}; ^{Ascencio-Álvarez et al. (2008)} reportan la presencia de razas 1, 2 y 3 en lotes comerciales de tomate en Culiacán Sinaloa; ^{Holguín-Peña (2005)} en Baja California Sur y ^{Ortega (2010)} en Morelos, es probable que el origen de estas razas en México haya sido mediante introducción de semilla contaminada.

Con el reciente aumento en el uso de semillas comerciales de tomate producidas fuera de México, existe un mayor potencial para introducir y diseminar el patógeno en áreas donde no se ha informado previamente. La aparición de nuevas razas también puede deberse a la selección y mutación de razas preestablecidas o aislados avirulentos (^{Shahi et al., 2016}). Fusarium oxysporum carece de reproducción sexual, por lo tanto, el intercambio genético se limita al ciclo parasexual y a la transformación genética, que requiere heterocariosis, lo que conduce a la fusión de hifas seguida de lisis celular (^{Strom y Bushley, 2016}).

Las plantas han desarrollado un complejo sistema de defensa contra diversos patógenos (^{Agrios, 2004}). Una vez que los patógenos superan las barreras mecánicas a la infección, los receptores vegetales inician vías de señalización que impulsan la expresión de genes de respuesta de defensa que dependen de su capacidad para reconocer las moléculas dañinas, llevar a cabo la transducción de señales y responder defensivamente a través de vías que involucran muchos genes y sus productos (^{Collinge et al., 1994}). De igual forma, los patógenos intentan activamente evadir e interferir con las vías de respuesta, seleccionando un sistema inmune descentralizado y multicomponente (^{Andersen et al., 2018}).

Índice de enfermedad y ABCPE en genotipos de tomate inoculados con Fol

Una forma de medir el daño ocasionado por Fol en plantaciones de tomate es por medio de la cuantificación de la incidencia, la cual mide el número de plantas afectadas expresado en porcentaje, de igual forma se utiliza para determinar la resistencia a este patógeno. El área bajo la curva de progreso de la enfermedad es un resumen cuantitativo de la intensidad de la enfermedad a lo largo del tiempo, útil para comparar la respuesta de genotipos a la inoculación del patógeno. Los resultados obtenidos en este estudio muestran diferencias significativas (p≥ 0.05) para índice de la enfermedad y ABCPE en los genotipos evaluados (Cuadro 2), lo anterior resalta la diferencia en la base genética de las líneas evaluadas y la resistencia o susceptibilidad a Fol.

Los primeros síntomas de la enfermedad (clorosis) ocurrieron 16 días después de la inoculación, con aumento en la severidad a través del tiempo. Y53 fue el genotipo con el porcentaje más bajo de incidencia de la enfermedad (60.6%) y ABCPE de 1 100, mientras que IR13 y R1 presentaron los valores más altos de incidencia de la enfermedad (76 y 75.3%, respectivamente), con valores de ABCPE de 1 700 y 1 450, respectivamente (Cuadro 3). Los valores más bajos de ABCPE corresponden a los materiales con menor incidencia de enfermedad; es decir, con un mayor nivel de resistencia (^{Bautista et al., 2009}).

Al respecto, las plantas y los patógenos han llevado a cabo mecanismos complejos de ataque y defensa. El sistema de defensa de las plantas es la capacidad de percibir los agentes patógenos y activar respuestas de defensa efectivas (^{Grube et al., 2000}). La resistencia en plantas involucra proteínas de resistencia (R) que detectan proteínas efectoras específicas (Avr) producidas por el patógeno. Hasta ahora, algunos de los genes de resistencia a enfermedades a Fol se han utilizado con éxito en el fitomejoramiento. El uso de variedades de tomate con resistencia genética ha representado una buena alternativa de producción sustentable sustituyendo aplicaciones frecuentes de pesticidas. En general, la mayoría de las variedades comerciales de tomate contienen uno o dos de los genes i-1 e i-2 contra la enfermedad Fol (^{El Mohtar et al., 2007}).

El manejo de enfermedades de las plantas siempre ha sido uno de los principales objetivos en programas de mejoramiento genético. Sin embargo, las interacciones hospedero-patógeno que implican resistencia están lejos de ser simples, las plantas desarrollan mecanismos de resistencia, los patógenos desarrollan estrategias para superar la resistencia de las plantas; las plantas, a su vez, desarrollan nuevas medidas defensivas que seleccionan cambios adicionales en el patógeno (^{Stahl y Bishop, 2000}; ^{Gururani et al., 2012}). Los patógenos de plantas tienen estrategias para reconocer al hospedante adecuado, penetrar e invadir el tejido vegetal, superar las defensas de la planta y optimizar su crecimiento dentro de la misma.

Para realizar estos procesos, generalmente, el hongo tiene que percibir las señales químicas y físicas del hospedante y responder con los cambios metabólicos y morfogenéticos requeridos para el desarrollo patogénico (Pietro et al., 2001). En la Figura 1 se observa el progreso de la enfermedad durante el desarrollo de las plantas a través del tiempo, se aprecia que D3 y Y53 presentaron los valores de incidencia de la enfermedad más bajos en los primeros días de evaluación, retrasando la aparición de la enfermedad probablemente como un mecanismo de defensa de las plantas al ataque del patógeno. Lo anterior, no evita que las plantas sean infectadas, sino que reduce la tasa del incremento de la enfermedad de cada uno de los puntos de infección, por lo tanto, retrasa la propagación de la enfermedad y el desarrollo de las epifitias en el campo (^{Van der Plank, 1984}).

Figura 1 Respuesta a la inoculación de Fusarium oxisporum f. sp. lycopersici en siete genotipos de tomate. 

Los patógenos intentan activamente evadir e interferir con las vías de respuesta, seleccionando un sistema inmune descentralizado y multicomponente (^{Andersen et al., 2018}), lo que finalmente se expresa en una infección generalizada.

En este estudio se observaron valores de incidencia de enfermedad superiores al 50%, en contraste con otros trabajos, la incidencia y severidad fue variable, debido a que las condiciones ambientales, la variedad y la virulencia del patógeno son distintas. Con el objetivo de evaluar la resistencia de genotipos de tomate a Fol raza 3, ^{Báez-Valdez et al. (2010)}, realizaron inoculaciones por inmersión de raíz en cuatro portainjertos de tomate, encontrando valores de severidad inferiores al 10%. ^{Mitov y Pérez (1973)} al determinar la resistencia a F. oxysporum en variedades de tomate obtuvieron

valores de 15% de incidencia en las evaluaciones realizadas. Por su parte, ^{Mitidieri et al. (2005)} determinaron la resistencia a F. oxysporum en portainjertos de tomate, reportando porcentajes de severidad de 13% después de 30 días de evaluación.

El uso de variedades de tomate resistentes a las razas de Fol es una alternativa para su control, por lo tanto, es fundamental disponer de germoplasma con resistencia a esta enfermedad. En este trabajo, los genotipos evaluados mostraron diferencias en la resistencia a este patógeno, evidenciando su amplia base genética. En resultados obtenidos por ^{Ascencio-Álvarez et al. (2008)}, basándose en la incidencia de la marchitez vascular presentada en 27 accesiones de tomate, se encontró que cuatro de ellas presentaron resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, siendo tres de origen silvestre, dos de S. pimpinellifolium, una de S. peruvianum y una de S. lycopersicum var. Motelle.

Por otro lado, en un estudio realizado por ^{Dordevic et al. (2012)} acerca de la reacción de diferentes cultivares de tomate a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raza 1, se encontró que de 24 genotipos de tomate (entre estos líneas puras e híbridos) 15 no fueron afectados por esta raza, cuatro fueron tolerantes y cinco susceptibles.