Colecta de material vegetal de D. viscosa

Se colectó 2 kg de muestra foliar de D. viscosa, en el mes de agosto de 2017, en la localidad de Las Trojes, Jocotepec, Jalisco, México (-103.32 longitud, 20.33 latitud) (Figura 1).

Figura 1 Sitio y colecta de material vegetal de D. viscosa. Las Trojes, Jocotepec, Jalisco, México. 

Preparación del extracto

Se pesó 500 g de hojas de D. viscosa, estas se secaron a temperatura ambiente por 15 días y fueron pulverizadas. Se utilizó la maceración en frio, empleando 500 ml por cada disolvente en polaridad ascendente (hexano, diclorometano y metanol), posteriormente, fueron filtrados con papel Whatman^® Núm. 1 y evaporado en rota-vapor (marca R II - SJ24/40, A, 100-120V - BUCHI) hasta obtener un extracto sólido por cada disolvente de acuerdo a ^{Nawaz et al. (2020}), los cuales se almacenaron en frascos color ámbar y guardaron en refrigeración hasta la evaluación de los bioensayos. Las diluciones se prepararon a la concentración 1% por tratamiento con Tween 80 al 0.1% como surfactante (^{Rodríguez-Soto et al., 2018}) y para el control se usó solo Tween 80.

Colecta en campo de S. frugiperda

Durante los meses de julio y agosto del 2018, se realizaron colectas manuales de larvas de Spodoptera frugiperda en los cultivos de maíz, en el Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, de la Universidad de Guadalajara, ubicado con las coordenadas (CUCBA) (20° 44’ 47” latitud norte 103° 30’ 43” longitud oeste).

Cría de gusano cogollero

Las larvas colectadas se transfirieron al laboratorio, donde la cría se mantuvo en incubadora, a una humedad relativa de 60%, 25 °C ±2 °C y un fotoperiodo de 12:12 h de luz, se alimentaron a base de hojas de maíz hasta la formación de la pupa. En la etapa de pupa, fueron sexados de acuerdo con ^{Guzmán (2016}) usando un microscopio estereoscópico (Olympus Optical, modelo SZ-40/SZ-ST, 10); posteriormente se pasaron a vasos de 1oz hasta la emergencia de los adultos. Después de la emergencia de las polillas, los adultos se colocaron en bolsas de papel marrón de 50 x 20 cm para la copulación y ovoposición, a los que se les alimentó con una solución de miel al 10%. Se identificaron las posturas de huevos, los cuales se colectaron diariamente durante 10 días seguidos. La cría del insecto se mantuvo hasta obtener larvas neonatas de la tercera generación.

Pruebas anti-alimentarias

En el bioensayo 1, las larvas fueron alimentadas con dieta artificial ^{Poitout y Bues (1974}) y en el segundo bioensayo se alimentaron a base de hojas de maíz (cultivar LUG 282), esto con la finalidad de tener una mayor certeza o evidencia, del efecto de los extractos. La dieta artificial se cortó en pedazos de 1 cm³ aproximadamente y las hojas de maíz se cortaron en trozos de 2 cm². Ambas dietas se impregnaron por inmersión con cada uno de los extractos foliares a la concentración 1% disueltos en Tween 80.

Para poder determinar la cantidad de extracto retenida en ambos bioensayos, se pesó antes y después de ser sumergidos en el extracto. Las pruebas anti-alimentarias consistieron en alimentar 100 larvas L3 por tratamiento, individualizadas en vasos de 1 oz, colocándoles un trozo dieta, previamente impregnada por los extractos. La evaluación anti-alimentaría, se realizó 24 h después de haber dejado las larvas en inanición. Los parámetros evaluados fueron mortalidad y peso de larvas cada 24 h por siete días, peso de pupas, duración de los estadíos larvario, pupa y adulto, proporción de sexos, número de huevos puestos (se contaron las capas de huevos más externa se contabilizaron y se multiplicaron por el número de capas) y eclosionados (^{Callado-Galindo et al., 2013}), emergencia de adultos y pupas.

Así como, consumo de alimento (calculada mediante la fórmula peso inicial de la dieta (mg) por dieta consumida entre 100), tasa relativa de TRCr= (PF-PI)/(PG x T), donde PF es el peso final de las larvas (mg), PI el peso inicial de las larvas (mg), PG es el peso promedio de larvas durante el ensayo (mg) y T es la duración del periodo de alimentación (7 días). Este parámetro representa la ganancia (mg) de biomasa por día del insecto en relación con su peso (g) metodología modificada por Scriber y Slansky (1981) citado por ^{Valencia et al. (2014}).

Determinación del contenido de fenoles totales y flavonoides

Se determinó el contenido de fenoles totales y se cuantificó de acuerdo con el método propuesto por Waterman y Mole (1994) modificado por ^{Bernabé-Antonio et al. (2017}), la concentración de fenoles totales en extractos fue medida por espectrofotometría, basándose en una reacción colorimétrica de óxido-reducción. La absorbancia fue medida a 760 nm. Los resultados fueron expresados en mg de ácido gálico por gramo de extracto (mg GA g^-1 extracto). Cada muestra fue analizada por triplicado. La cuantificación de flavonoides se realizó de acuerdo con Chang et al. (2002) modificado por Bernabé-Antonio et al. (2017). Se usó el espectrofotómetro UV benchtop para absorción 7 300 nm. Los resultados se expresaron como miligramos de equivalentes de quercetina por gramo de peso seco (mg cat g^-1 extracto).

Diseño experimental y análisis estadístico

El diseño experimental fue completamente al azar. Todos los resultados de las variables medidas fueron evaluados mediante un análisis de varianza multifactorial y se sometieron a la prueba Tukey p= 0.05 para la homogeneidad de grupos entre los tratamientos. Las variables evaluadas se agruparon por fase del insecto, en etapa larvaria: duración del estadío larvario (días), peso larva (mg) y porcentaje de mortalidad de larvas; en fase pupa: duración del estadío pupa (días), peso pupa (mg), proporción de sexos, individuos deformes y no eclosionados; en la etapa de adulto: duración estadío adulto (días), adultos deformes, número de huevos puestos y porcentaje de huevos eclosionados, agrupados en tratamientos (Cuadro 1). El análisis se realizó con el programa Minitab 16 (Minitab^® statistical software). Además, se sometieron a un análisis de componentes principales (ACP), para la incidencia de las variables de mayor importancia en ambos bioensayos.

Efecto de los extractos sobre el gusano cogollero S. frugiperda

El porcentaje de mortalidad de larvas presentó diferencias significativas entre los tratamientos (F= 4.52, p= 0.05); registrándose la mayor mortalidad en la dieta natural en T7 y T8 con 36.6 ±4.08 y 33.3 ±4.08% respectivamente (Cuadro 2). Estos valores en mortalidad de larvas son menores a los reportados por ^{Salinas-Sánchez et al. (2020}) donde evaluaron mediante pruebas anti-alimentarias el efecto de una fracción acuosa de Serjania schiedeana (Sapimdaceae) a concentraciones 250, 500, 1 000, 1 500 y 2 000 ppm, los resultados reflejaron la más alta mortalidad larval de (72%) a la concentración de 250 ppm. Por su parte, ^{El-Din y El Gengaihi (2000}) reportan 90% de mortalidad larvaria, ocasionadas por plantas pertenecientes a la familia Sapindaceae, evaluadas mediante pruebas anti-alimentarias en larvas Spodoptera litoralis; por lo que, la tasa de mortalidad observada por efecto de la aplicación de los extractos pudiera deberse a la presencia de algunos metabolitos secundarios en los extractos, tales como terpenos.

En el tiempo de desarrollo del estadio larvario, se presentó diferencias significativas entre los tratamientos (F=7.22, p= 0.0001), esto de acuerdo con la prueba Tukey, en dieta artificial, el T2 registró el menor tiempo 14.9 ±0.32, al igual que T1-14.7 ±0.32 y el mayor tiempo se registró en dieta natural en T5 y T8 con promedios de 17.1 ±0.32 días para ambos tratamientos (Cuadro 2). Con respecto al peso de pupa, se observó una disminución de peso de acuerdo con el análisis estadístico (F= 8.81, p= 0.01), en la dieta natural en T7 y T8 0.181 ±0.006 y 0.184 ±0.006 mg, respectivamente; comparados con dieta artificial, el T1 y T4, quienes mostraron un peso promedio de 0.211 ±0.006 mg (Cuadro 2). Cabe resaltar, que, para estimar la calidad de las dietas o alimento, el peso de larvas y de pupa, es un dato que hay que tomar en cuenta (^{Cohen, 2015}).

Por tal razón, se considera, que un mayor peso de larvas puede asegurar una supervivencia eficaz. En este sentido, las hojas de maíz están compuestas por células parenquimatosas, lignina, celulosa, etc. y brindan los mismos nutrientes que la dieta artificial, esta es rica en carbohidratos, siendo superior a las hojas de maíz, además, contiene como ingredientes harina de trigo, germen de trigo, agar, levadura, azúcar, ácido ascórbico, vitamina C, este último actúa como estimulante alimenticio y en diferentes reacciones defensivas como la de antioxidante ^{Cohen (2015}), es por esa razón, los pesos más altos se presentaron para la dieta artificial.

Los tiempos de duración de la etapa pupa, mostraron diferencias significativas de acuerdo con el análisis (F= 8.47, p= 0.002). En la dieta artificial se presentaron los menores tiempos en T2 y T3 con 9.3 ±0.2 para ambos tratamientos; sin embargo, en la dieta con hojas de maíz, se observó mayor tiempo con medias de 11 ±0.2 en T5 y T6, (Cuadro 2). En ese sentido, el tiempo de duración o las variaciones en las etapas larva y pupa de S. frugiperda, se puede deber a la calidad y al tipo de alimento ^{Flores-Quinches et al. (2021}). De acuerdo con esto, el ciclo de vida del cogollero está altamente influenciado por condiciones ambientales como la humedad, fotoperiodo y la temperatura, pero en este caso, la dieta es el parámetro que determina la duración de las fases.

Por otro lado, la fertilidad del insecto también mostró diferencias significativas (F= 22.72, p= 0.0001), reduciendo el número de huevos. Los menores promedios se presentaron en dieta artificial en los tratamientos T2, T3 y T4 con promedios de 137.66 ±25.15, 203.83 ±25.15 y 120.3 ±25.15 respectivamente. Para los tratamientos utilizados con dieta natural T6 y T8 fueron significativos, con promedios 215.33 ±26.15 y 211.6 ±26.15 consecutivamente. Mientras el mayor número de huevos en dieta natural fue en el T5 y T7 (Cuadro 2).

Al respecto, ^{Malarvannan et al. (2009}) reportan el efecto sobre otras especies de la familia Sapindaceae, tal es el caso de Dodonaea angustifolia, sus resultados mostraron un efecto ovicida sobre el insecto Helicoverpa armígera, a dosis de 0.5 y 1% en extractos de éter de petróleo y acetona. Sin embargo, ^{Castillo et al. (2009}) evaluaron extractos de diferentes órganos de la planta, como frutos, hojas y ramas de D. viscosa de origen uruguayo, ninguno de estos extractos mostró ser activo contra el polífago Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae).

Con relación a esto, una reducción en el número de huevos puestos y eclosionados se debe a la dificultad de asimilar los nutrientes durante el período larvario y se refleja en un número reducido de huevos (^{Arrese y Soulages, 2010}). Por tanto, estos resultados indican la presencia de un efecto subletal de los extractos orgánicos sobre el insecto, manifestándose en estadios posteriores al estadio larvario, con incidencia de una reducción en el número de huevos puestos.

En el Cuadro 3, se presentan los resultados de la cantidad de alimento ingerido o tasa relativa de consumo (TRCo), de acuerdo al análisis se presentaron consumos de dieta similares en ambos bioensayos con promedios de 0.317 ±0.05 a 0.49 ±0.15 mg mg^-1 día^-1 de consumo; sin embargo, no significa que ocurra la misma asimilación de los nutrientes, esto lo confirma el índice de crecimiento (TRCr), en ambos bioensayos, presentando diferencias significativas (F= 20.25; p= 0.001), las larvas de mayor peso fueron en el bioensayo 1 con medias de 0.514 ±0.02-0.609 ±0.05 mg mg^-1 día^-1, mientras que los menores pesos registrados fueron en bioensayo 2, mostrando el efecto inhibidor más bajo con medias de 279 ±0.07-0.31 ±0.03 mg mg^-1 día^-1, respectivamente.

Efecto de los tratamientos con mayor influencia en las variables evaluadas sobre los estados del gusano cogollero S. frugiperda

En esta parte, se realizó únicamente la inserción en las pruebas anti-alimentarias de las variables que tuvieron algún efecto en S. frugiperda, de acuerdo con el análisis de componentes principales (Figura 2). En (Figura 2A), se observa que los componentes que presentaron valores propios mayores a 1, son la duración del estadío larvario con un valor de 1.37 y mortalidad de larvas con un valor de 1, esto de acuerdo con la gráfica de sedimentación, lo que indica que más cercano a 1 es mayor la influencia de la variable sobre el efecto en el insecto, en relación a esto, se ha reportado que la duración la etapa larva en este insecto, puede prolongar o acortar el ciclo dependiendo del alimento que disponga; es decir que el gusano cogollero prolonga su ciclo cuando se alimenta con algodón y lo reduce cuando se alimenta con maíz, bajo las mismas condiciones ambientales.

Figura 2 Gráficas de sedimentación del análisis de componentes principales, en los estadíos de S. frugiperda. A) larva: a) duración estadío larvario; b) peso de larvas; y c) mortalidad de larvas. B) pupa a) duración de la fase pupa (días); b) peso pupa (mg); c) proporción de sexos; y d) deformes; C) estadío adulto a) duración estadío adulto (días); b) adultos deformes; c) número de huevos puestos; y d) porcentaje de huevos eclosionados. 

Por otro lado, las hojas como fuente de alimento favorecieron el mayor porcentaje de mortalidad de larvas, debido a que las hojas se deshidrataron al poco tiempo de ser cortadas, de esta manera dificultando la ingestión por parte de las larvas. En cambio, la dieta artificial rica en harinas, permitieron la absorción de los compuestos aislados, sobre el alimento, además permitieron mantener constante la mayoría de las variables, tales como temperatura, cantidad de alimento, humedad relativa, entre otras, lo cual, es ventajoso para el desarrollo de los respectivos bioensayos.

En la etapa de pupa, en la Figura 2B, muestra dos de los componentes extraídos, presentaron valores superiores a 1, con un valor de 1.55 el peso de pupa y duración etapa pupa con un valor de 1.12. Lo que indica que el insecto es afectado en su peso y su duración, y puede generar adultos deformes. Los resultados del análisis de componentes principales para la etapa adulto de S. frugiperda, se observan en la (Figura 2C) de sedimentación. Para este caso, solo un componente extraído obtuvo valores superiores a 1 (número de huevos puestos) presentando valores propios de 2.51.

Lo que indica que los adultos son afectados en su reproducción; es decir, los extractos causaron un efecto subletal sobre el desarrollo del insecto, ocasionado por la ingesta de los metabolitos impregnados en la dieta, afectando la fertilidad, con la presencia de una reducción significativa en el número de huevos en ambos experimentos. De tal manera, que los resultados coinciden con los reportados por ^{Salama et al. (1988}) quienes demostraron que los extractos de hexano y cloroformo al 5% de hojas de D. viscosa causaron educción de huevos puestos hasta 50% en S. litoralis. Este efecto se debe a la presencia de compuestos de fenol, como flavonoides presentes en el tejido foliar.

Análisis de relación de los bioensayos 1 y 2 en S. frugiperda.

Las pruebas para la evaluación de los extractos en ambos bioensayos fueron sometidos al análisis con 12 variables. En la Figura 3, se muestran aquellas variables que no presentaron correlación para ambos experimentos. El efecto en la mortalidad de larvas fue diferente en ambos bioensayos; mostrando mayor afectación en los insectos alimentados a base de hojas (bioensayo 2), como se muestra en la Figura 3A. Este efecto se mostró similar para la duración de la etapa larvaria (Figura 3B), la duración etapa pupa (Figura 3C) y el número de huevos puestos (Figura 3E). Sin embargo, para el peso de pupa (Figura 3D), se observa mayor afectación en los individuos alimentados con dieta artificial (bioensayo 1), los menores pesos se registraron en la dieta de hojas (bioensayo 2).

Figura 3 Análisis multivariado, medias de los variables evaluadas de los dos experimentos anti-alimentarios. 1= bioensayo dieta artificial; 2= bioensayo dieta hojas de maíz. A) mortalidad de larvas; B) duración de la etapa larva; C) duración etapa pupa; D) peso de pupa; y E) número de huevos puestos. 

Además, se determinó la presencia de fenoles (15.58% 100 mg GA g^-1 extracto) y flavonoides totales con (1.33% 100 mg cat g^-1 extracto). De tal manera, que la presencia de estos compuestos indica, que esta especie es fuente importante con actividad biológica relevante.

Existen reportes sobre los diversos metabolitos secundarios presentes en D. viscosa, entre ellos alcaloides, saponinas, flavonoides, terpenos, fenoles, de acuerdo con ^{Mostafa et al. (2014}) considerados como posibles responsables del efecto sobre el desarrollo del insecto. Por su parte ^{Schneider et al. (2017}) evaluaron efecto del neem (Azadirachta indica) mediante pruebas anti-alimentarias Diatraea saccharalisa F. (Lepidoptera: Crambidae. Por su parte, ^{Niu et al. (2010}) mencionan que se han aislado de las partes aéreas de D. viscosa una serie de compuestos de tipo diterpenos clerodano con actividad biológica insecticida contra Spodoptera exempla y S. littoralis y flavonoides prenilados, que han mostrado actividad contra los lepidópteros (Plutella xylostella y Pierisrapae) y el coleóptero Sitophilus oryzae.